Dna ricombinante e frammenti di restrizione

Utilizzo dei plasmidi

I biotecnologi per ottenere prodotti utili all’uomo, come i farmaci, utilizzano i plasmidi. I plasmidi sono delle piccole molecole circolari di DNA che si duplicano separatamente dal cromosoma batterico.
L’inserimento del DNA all’interno del vettore avviene con un meccanismo di copia e incolla che sfrutta particolari proteine: gli enzimi di restrizione e l’enzima ligasi.

Il prodotto finale di queste reazioni è definito DNA ricombinante, in quanto composto da materiale genetico proveniente da fonti diverse.

Funzione degli enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione sono proteine capaci di tagliare in modo specifico determinati frammenti di DNA, riconoscendone piccole sequenze. L’enzima DNA ligasi funziona come collante tra frammenti di DNA, catalizzando la formazione di legami covalenti tra le estremità dei filamenti.
La tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR) permette di ottenere migliaia di copie di un dato frammento di DNA in poche ore partendo da una quantità minima di campione. Il procedimento coinvolge particolari DNA polimerasi e altri reagenti per la sintesi del DNA. Tagliando l’intero genoma con un enzima di restrizione e clonando i frammenti nei plasmidi o nei fagi si ottiene una libreria genomica.

Identificazione del DNA d'interesse

L’identificazione di molecole di DNA d’interesse avviene mediante l’uso di sonde a DNA o RNA in grado di legarle ed emettere un segnale rilevabile, per esempio grazie alla radioattività.
La tecnica del microarray usa sonde coniugate a molecole fluorescenti, permettendo di individuare rapidamente quali geni sono espressi in una cellula in un certo momento. In tal modo si può paragonare l’attività genica di una cellula normale e di una tumorale.

Metodo dell'elettroforesi su gel

L’elettroforesi su gel è un metodo di separazione che consente di suddividere le macromolecole (proteine o acidi nucleici) sulla base delle loro dimensioni e delle loro cariche elettriche.
Un campione di ogni soluzione è collocato in un pozzetto ad un’estremità di una lastra rettangolare contenente gel. A tale estremità si attacca un elettrodo con carica negativa e all’estremità opposta un elettrodo con carica positiva.

I gruppi fosfato del DNA si spostano nel gel verso il polo positivo con velocità proporzionali alle dimensioni: i frammenti più piccoli sono più veloci mentre quelli più grandi sono più lenti. Dopo un certo tempo il campo elettrico viene interrotto e si ottengono una serie di bande e ogni banda è costituita da molecole di DNA delle stesse dimensioni.

Con l’elettroforesi su gel di frammenti di restrizione è possibile ordinare tali frammenti ed evidenziarne le differenza, che sono dette poliformismi della lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP).