Le biotecnologie


Le biotecnologie classiche e moderne
Per biotecnologie si intende l’insieme di tecniche che utilizzano organismi viventi per lo sviluppo di processi o prodotti utili all’uomo.
Bisogna però distinguere tra biotecnologie classiche e biotecnologie moderne:
- Biotecnologie classiche
Un esempio di biotecnologie classiche è l’ibridazione tra specie affini per trovare nuove combinazioni di caratteri, soprattutto nelle piante.
I processi di ibridazione sono seguiti da una selezione artificiale.
Un altro esempio di biotecnologie classiche è la mutagenesi, ovvero una tecnica di biologia molecolare in cui una mutazione è creata in modo selettivo in un particolare sito di una molecola di DNA, solitamente un plasmide.
Tramite la tecnica di mutagenesi, i ricercatori riescono a fare sì che le mutazioni, eventi che avvengono in natura, si verifichino con maggiore frequenza, per poter creare degli alleli (versioni di un gene) nuovi, portatori di caratteri migliori.
Si provocano quindi attraverso l’uso di agenti mutageni, come ad esempio i raggi ultravioletti.
Anche nell’industria alimentare è utilizzata la mutagenesi: un esempio è la fermentazione lattante, ovvero una particolare fermentazione nella quale vengono utilizzati dei batteri fermentanti che trasformano il latte in formaggio.
Un altro esempio sono i lieviti, ovvero funghi che vengono utilizzati per la lievitazione del pane.
Queste tecniche, che utilizzano organismi viventi, avvengono anche normalmente in natura, solo che in questo caso le reazioni sono accelerate.
- Biotecnologie moderne
Nelle nuove biotecnologie, vengono applicate tutte le nuove conoscenze nel campo della genetica per effettuare processi che in natura non avverrebbero.
-- La più diffusa è la biotecnologia del DNA ricombinante: è una tecnica che prevede il prelievo di un gene dal genoma di una specie e inserirlo, trapiantarlo, nel genoma di un’altra specie nella quale si manifesta.
In natura la ricombinazione dei geni avviene solo attraverso la riproduzione sessuata, quindi solo tra individui della stessa specie o di specie affini.
In questo modo, invece, il gene può provenire da qualsiasi organismo ed essere trapiantato in qualsiasi altro.
-- Un’altra serie di processi sono quelli che permettono l’analisi del DNA, ovvero la determinazione del profilo genetico dell’individuo.
Per fare ciò si ricercano i marcatori genetici, ovvero le parti che rendono unico il DNA di ciascun individuo, all’interno del suo genoma.
-- Una terza serie di processi è il sequenziamento di interi genomi, cioè la genomica.
Tramite la genomica è possibile sequenziare tutto il DNA di una specie, e quindi a vedere tutta la serie di basi.
-- Anche le tecniche di clonazione di organismi fanno parte di queste pratiche.
Clonare significa avere più copie identiche di un organismo, e questa pratica non ha alcuna problematica per quanto riguarda i batteri, in quanto tutta la colonia batterica deriva da una sola cellula.
-- Le tecniche di utilizzo di cellule staminali consistono nel prelievo di cellule staminali, che vengono modificate e reimpiantate per fare in modo che una determinata serie di cellule difettosa possa essere corretta e reinserito in una cellula, in modo che il clone possa nascere e svilupparsi normalmente.

L’analisi del DNA


Analizzare il DNA significa individuare e identificare delle sequenze caratteristiche del profilo genetico di un organismo.
Supponiamo di avere un campione di un reperto e uno di un indiziato: per verificare che i due corrispondano, bisognerebbe sequenziare entrambi i DNA per verificare che siano omologhi, ma questo sistema sarebbe lungo e dispendioso.
Invece che confrontare tutta la sequenza di DNA è possibile individuare e confrontare delle parti di DNA che per la loro natura sono uniche per ciascuno di noi, per questo chiamate marcatori genetici.
Il genoma degli eucarioti è composto solo per una piccola percentuale, circa il 5 %, di DNA codificante, cioè corrispondente a dei geni che a loro volta corrispondono a proteine; per il 95 % non si è riusciti a trovare una corrispondenza a delle proteine, e per questo motivo, in un primo momento, era stato identificato come DNA spazzatura poiché non si riusciva a capire a cosa corrispondesse.
Successivamente, analizzando e studiando questo DNA, si è trovato che è costituito da diversi tipi di sequenze, tra le quali ci sono le sequenze ripetitive, o altamente ripetute, chiamate così perché sono gruppi di basi che si ripetono un certo numero di volte all’interno del DNA.
Queste sequenze sono di due tipi, chiamati minisatelliti e microsatelliti: i primi sono sequenze di 10-12 basi che si ripetono, mentre i microsatelliti sono sequenze composte di 2-3 basi.
I microsatelliti corrispondono ai marcatori genetici: i microsatelliti sono moltissimi per ogni genoma (sull’ordine delle migliaia), distribuiti variamente nel genoma, e all’interno di ciascuno di essi c’è una grandissima variabilità nella popolazione.
Ciò che varia da un tipo di marcatore ad un altro è il numero di sequenze: ogni numero di sequenze corrisponde ad un allele, ovvero la variante di un gene che si trova sui cromosomi, omologhi a coppie.
I vari alleli corrispondono alle varie possibilità di ripetizione.
È permessa la variabilità di questi microsatelliti perché non hanno una funzione diretta e non corrispondono a niente di fenotipico.
Di ciascun microsatellite ognuno di noi ha due alleli.
Data la grandissima variabilità di questi alleli, trovare due individui che abbiano lo stesso genotipo per un determinato microsatellite, è già molto bassa.
Nelle analisi del DNA si considerano dai tre ai cinque marcatori genetici alla volta.
Trovare quindi due individui che abbiano lo stesso genotipo (coppia di alleli di un gene) per tre marcatori diversi è impossibile.
Confrontare il genotipo di tre marcatori e trovare che corrispondono nei due individui, significa avere la certezza che il campione corrisponda all’individuo, altrimenti il contrario.
Non è necessario sequenziare questi marcatori per identificarli, perché per un determinato marcatore gli alleli differiscono solo per il numero di basi: quello che cambia da un allele all’altro è solo il numero di basi, quindi di ripetizioni. Perciò gli alleli differiscono per il peso molecolare e la dimensione.


L’elettroforesi su gel


In un’analisi si utilizza quindi questa caratteristica per poterli confrontare.
C’è una tecnica che permette di separare tra loro i vari frammenti di DNA in base alla dimensione e al peso, ovvero l’elettroforesi su gel:
1)La prima cosa da effettuare sui campioni di DNA è un’amplificazione dei microsatelliti, cioè fare in modo di averne un numero sufficiente di copie per poterne fare l’analisi.
Non bisogna riprodurre un numero di copie di tutto il DNA, ma solo dei microsatelliti che interessano.
Nei laboratori di biotecnologie esiste una tecnica utilizzata per separare i vari materiali, chiamata PCR, acronimo di reazione a catena della polimerasi.
La PCR è una tecnica con la quale si ripete all’infuori della cellula la duplicazione del DNA in maniera controllata, cioè in modo che si duplichino solo le parti che interessano e non tutto il DNA.
Lo strumento utilizzato si chiama termociclatore: è un contenitore in cui vengono introdotte tutte le sostanze necessarie in soluzione, ovvero il campione di DNA, tutti i tipi di nucleotidi in abbondanza, necessari per questa sintesi, e l’enzima necessario, cioè la DNA polimerasi.
Non si può però inserire una DNA polimerasi qualsiasi, poiché nel processo è previsto che la soluzione da duplicare venga sottoposta ad alte temperature di 90° C circa, ma a quella temperatura la proteina si denaturerebbe.
Quindi viene usata la DNA polimerasi estratta da un battere termofilo: si tratta di un battere che vive nelle sorgenti termali, in acque ad alte temperature, e che quindi ha una DNA polimerasi termoresistente, indicata come Taq polimerasi.
Dopodiché, se non si inserisse nient’altro, la duplicazione del DNA avverrebbe per tutto il DNA.
Per duplicare solo la parte corrispondente al microsatellite, si inseriscono nel termociclatore anche dei primer specifici: i primer corrispondenti alla prima sequenza di basi che precede immediatamente il microsatellite da duplicare, su uno dei due filamenti, e il primer complementare alla sequenza di basi che segue immediatamente il microsatellite.
In questo modo si limita la duplicazione, la quale si svolge in diverse fasi:
- Primo passo è riscaldare fino a circa 90-95 °C la soluzione, allo scopo di separare tra loro i filamenti di DNA.
Nella cellula solitamente è l’elicasi a provvedere a questa funzione, mentre in questo caso la separazione avviene tramite il riscaldamento, in quanto vengono rotti i legami a idrogeno.
- Successivamente la soluzione viene raffreddata fino 50-60 °C, per dare la possibilità ai primer e ai nucleotidi complementari di formare dei legami a idrogeno con i corrispettivi sui due filamenti.
Il DNA però non si richiude, in quanto le molecole di nucleotidi e di primer sono molto più veloci e leggere poiché più piccole, quindi riescono a portarsi nella loro posizione prima che la molecola di DNA, più pesante, si richiuda.
- Bisogna infine riscaldare nuovamente ad una temperatura di circa 70° C, alla quale la Taq polimerasi ha la massima efficacia; questa catalizza la formazione dei legami fosfodiesterici tra i vari nucleotidi.
In questo modo, con un ciclo, si è ottenuta una copia.
Ripetendo questo singolo ciclo di riscaldamento e raffreddamento in successione, si ottengono tutte le copie dei microsatelliti che interessano.
La crescita è esponenziale perché ogni volta raddoppiano: in venti minuti si ottengono milioni di copie di microsatelliti, ovvero una quantità sufficiente per un’analisi.
2)Il secondo passaggio è identificarli per poterli confrontare.
I vari alleli differiscono per dimensioni e per peso: si sfrutta perciò questa caratteristica, cioè la velocità con cui riescono a muoversi tra le maglie di un gel.
I vari frammenti di DNA si muovono a velocità diverse in base alle loro dimensioni.
Il gel utilizzato è una sorta di gelatina fatto di un disaccaride, chiamato agarosio, che si ricava dalle cellule vegetali.
Questo gel viene ottenuto sciogliendo nell’acqua una quantità opportuna di agarosio, che è in polvere, perché a seconda della concentrazione si può avere un gel con maglie più o meno larghe: la dimensione della larghezza delle maglie può essere regolata attraverso la concentrazione dell’agarosio.
Più è concentrato, più le maglie sono strette.
Quando si scioglie esso è liquido, ma poi quando viene versato su una lastrina e lo si lascia raffreddare diventa una lastra di gel.
Consideriamo una scena del crimine da analizzare; consideriamo anche di avere tre campioni, uno corrispondente al reperto trovato sul luogo del delitto, due agli indiziati.
Si inseriscono con una pipetta i campioni di DNA ad una estremità della lastrina di gel, in una cavità scavata nella gelatina che viene chiamato pozzetto.
Mettendo un pettine prima di versare il gel e poi togliendolo una volta che il gel si è solidificato, si inseriscono i campioni nei pozzetti lasciati da questo.
Successivamente, per poter distinguere i frammenti in base alla velocità, devo farli muovere da una estremità all’altra.
Per fare ciò bisogna sfruttare il campo magnetico: la vaschetta viene quindi collegata a due elettrodi, uno positivo e l’altro negativo, in modo che il DNA venga richiamato dall’elettrodo di segno opposto alla propria carica.
Il DNA è infatti caricato negativamente, in quanto il gruppo fosfato è dissociato e ha un gruppo OH-; perciò viene posto sul polo negativo in modo da essere attirato verso quello positivo.

Si depositano i campioni di DNA dentro a questi pozzetti che si trovano all’estremità della lastrina, dentro una vaschetta da elettroforesi.
Nella vaschetta si aggiunge una soluzione salina che conduce elettricità, e successivamente si chiude.
Si collegano poi le estremità della lastrina di gel con i poli di un generatore: l’estremità in cui è stato depositato il DNA viene collegata con il polo negativo, perché essendo carico negativamente viene indotto a migrare verso quello positivo.
Questa differenza di potenziale ha lo scopo di generare una forza che induca il DNA a migrare verso l’altro elettrodo.
Ogni campione di DNA è fatto di frammenti di diversa lunghezza; per questo motivo, il DNA viene prima trattato con una sostanza colorante per poter rintracciare i frammenti di DNA.
Si applica a questo punto la differenza di potenziale e inizia la corsa elettroforetica.
Ogni frammento si muove da un polo all’altro con velocità diverse, e questa velocità è inversamente proporzionale alla loro dimensione e al loro peso.
Dopo circa mezz’ora si apre il circuito e si toglie il campo elettrico, fermando quindi la corsa.
Sulla lastrina si formeranno delle bande colorate che corrispondono ai frammenti di diversa colorazione: i frammenti si saranno quindi separati tra di loro in base al peso molecolare, con i più veloci che saranno arrivati più avanti.
Se l’1 era il campione di DNA del reperto biologico, si vedrà che l’indiziato 2 è da scagionare, perché i suoi microsatelliti non corrispondono, mentre il reperto 3 combacia perfettamente, quindi il reperto appartiene all’individuo 3.


Tecnologia del DNA ricombinante


È una tecnologia grazie alla quale è possibile prelevare segmenti di molecole del DNA, contenenti specifici geni, provenienti da un qualsiasi organismo, e inserirli, attraverso un vettore, nel genoma di un altro organismo dove si esprime, cioè dove viene prodotta la proteina corrispondente ai geni.
Si potrebbe, ad esempio, prelevare un gene della specie umana e inserirlo nel genoma di un battere, dove si esprime.
Utilizzare questa tecnologia vuol dire fare qualcosa che in natura non avviene: ricombinare il gene in un genoma è un’azione artificiale poiché in natura, negli eucarioti, il mescolamento dei geni avviene solo con la riproduzione sessuata; e siccome questa può avvenire solo tra individui appartenenti alla stessa specie o al massimo tra individui di specie affini, questo tipo di ricombinazione non è possibile naturalmente.
Negli eucarioti la ricombinazione avviene attraverso la riproduzione sessuata; nei batteri (procarioti), invece, la ricombinazione di geni può avvenire attraverso tre sistemi: trasformazione, trasduzione e coniugazione.
1)Trasformazione: I batteri hanno la capacità di assorbire dall’ambiente circostante dei piccoli frammenti di DNA e farli propri.
I batteri possono assorbire questi frammenti di DNA dal mezzo in cui si trovano, ed è un modo con cui i batteri si trasmettono la resistenza agli antibiotici.
Oltre al cromosoma circolare, i batteri hanno dei circoletti, dei frammenti di DNA, chiamati plasmidi, che contengono pochi geni, ma che i batteri possono assorbire facilmente.
Per esempio, i plasmidi che hanno le informazioni per resistere agli antibiotici si chiamano plasmidi R.
2)Trasduzione: Questa avviene grazie ai fagi, in particolare quando il DNA di un fago si inserisce nel cromosoma batterico e inizia un ciclo, chiamato ciclo lisogeno.
3)Coniugazione: I batteri costruiscono un ponte citoplasmatico attraverso il quale passano i frammenti di DNA.
La tecnologia del DNA ricombinante consiste nell’inserire i geni, per esempio umani, in un plasmide batterico, e poi darlo al battere che lo ingloba.
Quando il battere si riprodurrà, riprodurrà anche il gene umano.
Applicazioni pratiche: Questa tecnologia viene applicata in diversi campi:
- Produzione di farmaci ricombinanti: Ce ne sono in commercio una ventina.
Questi farmaci sono delle sostanze che sono impossibili da produrre sinteticamente in quantità commerciale.
Un esempio è l’insulina per i diabetici, oppure il fattore ottavo della coagulazione (utilizzato nelle persone quando la mancanza di questo fattore impedisce la coagulazione), l’ormone della crescita (chiamato anche ormone somatotropo) o l’interferone (farmaco antivirale che le cellule però producono naturalmente).
Queste sostanze sono utili da somministrare a chi ne ha bisogno, ma il problema è che sono sostanze prodotte solo da particolari organi dell’uomo: l’insulina è prodotta solo dal pancreas umano.
Bisogna quindi trapiantare il gene per l’insulina in un battere così da renderlo capace di produrre insulina; nel momento in cui il battere si riproduce, riproduce anche questo gene, ed essendo la sua riproduzione molto rapida, si vengono a creare colonie batteriche capaci di produrre insulina.
- Produzione di vaccini: Nei vaccini contro le malattie virali, ad esempio, si inietta il virus reso innocuo con il calore in modo che l’individuo produca anticorpi, stimolando quindi il sistema immunitario.
Questi vaccini sono a rischio, poiché può succedere che il virus iniettato non sia del tutto innocuo e che quindi provochi la malattia.
Si è scoperto che la parte del virus che stimola il sistema immunitario non è tutta, ma è solo una proteina del capside virale.
Si preleva perciò dal virus il gene con le istruzioni per la sintesi di questa la proteina e lo si trapianta in un battere, il quale produce la proteina in quantità, in modo tale che noi possiamo iniettare direttamente solo questa proteina, rendendo quindi impossibile la manifestazione della malattia.
A quel punto il vaccino è sicuramente innocuo.
- Agricoltura: In agricoltura, il miglioramento genetico veniva fatto attraverso l’ibridazione, la selezione artificiale, la mutagenesi, ovvero tutte tecniche che sfruttano eventi che avvengono anche in natura.
Invece, con la tecnologia del DNA ricombinante, è possibile inserire un gene nelle piante ottenendo, ad esempio, piante resistenti alle infezioni virali o agli erbicidi, oppure alle specie di insetti dannosi per quella pianta.
Le piante trattate con queste tecnologie non sono moltissime, ma solo 4 o 5 specie: il mais, la colza, il cotone e la soia.
Questa tecnologia non è a largo spettro come molti insetticidi che poi uccidono anche altri insetti, turbando in maniera accentuata l’equilibrio; in questa maniera è possibile inserire il gene per la proteina che è tossica per una specifica categoria di insetti, quindi assolutamente non per l’uomo.
Le piante con questo insetticida, vengono anche indicate come Bt, perché questo gene viene da un battere il cui nome è Bacillus Thuringiensis.
Alcuni esempi di piante sono il mais Bt e la colza Bt.
Il Bacillus Thuringiensis che ha le istruzioni per produrre una particolare proteina che si chiama proteina Cry: questa è particolarmente attiva su insetti infestanti, in particolar modo in queste piante.
È specifica perché si lega a dei recettori che si trovano solo nelle cellule dei tessuti di questi insetti; l’uomo, non avendo questi recettori, non viene danneggiato, mentre gli insetticidi sono dannosi anche per l’uomo.
- Nella ricerca sono diffusi animali GM, soprattutto topi, che servono come modello per la cura di malattie genetiche umane: è possibile, negli animali da esperimento, inserire il gene difettoso di una malattia del genere umano per ricreare nel topo la malattia per studiarla e provare terapie per curarla.
Nei topi si sono ottenuti i cosiddetti topi knock-out (KO), sempre a scopo di ricerca: i topi KO sono topi a cui viene inattivato un gene, in maniera da capire, vedendo gli effetti della mancanza del prodotto di questo gene, capire cosa producesse.
Inattivando di volta in volta tutti i geni è possibile ricostruire la funzione dei geni stessi.

Tecnologia del DNA ricombinante: descrizione delle fasi


Dopo aver individuato il gene che interessa, occorre tagliarlo, isolarlo e produrne numerose copie: in poche parole vuol dire clonarlo.
Non si può però utilizzare la PCR perché questa tecnica è adatta a produrre copie di segmenti brevi.
Un gene può avere una sequenza di migliaia di nucleotidi, troppo lunga per poter essere copiata con la PCR: una pratica di questo tipo è soggetta ad errori.
Si sfruttano allora i batteri e la loro enorme capacità riproduttiva, poiché questi, in pochi minuti, producono colonie di milioni di cellule.
Si sfruttano quindi inserendo nei batteri il gene che si vuole clonare, in modo che il battere, riproducendo se stesso e il proprio DNA, riproduca anche il gene.
Gli si può fornire questo gene preparando un plasmide contenente il gene, cioè inserendo il gene in un plasmide batterico, e far sì che il battere lo assorba per trasformazione.
In questo modo il battere, riproducendosi, darà una colonia di batteri tutti contenenti quel frammento di DNA.
Per fare ciò si utilizzano degli strumenti naturali: per tagliare il DNA si usano gli enzimi di restrizione.
Questi sono enzimi che si trovano naturalmente nei batteri poiché sono degli strumenti di difesa contro i virus, ovvero contro i fagi: questi, infatti, iniettano il loro DNA nei batteri, e successivamente il loro DNA prende il comando del battere producendo copie di se stesso utilizzando il materiale del battere.
I fagi possono o cominciare direttamente questa attività, oppure possono inserire il loro DNA nel DNA batterico, iniziando il ciclo lisogeno.
In ogni caso gli enzimi di restrizione riconoscono il DNA estraneo e lo idrolizzano (lo tagliano).
Questi enzimi di restrizione hanno la particolarità di riconoscere, ciascuno, una determinata sequenza di basi da tagliare (sequenze di restrizione).
Queste sequenze sono caratteristiche perché sono palindrome: lette in una direzione su un filamento o letta nella direzione opposta, la sequenza si ripete.
L’enzima, percorrendo il DNA, quando trova questa sequenza, la riconosce e taglia il DNA in corrispondenza di questa.
Di enzimi di restrizione ne esistono di due tipi: alcuni fanno un taglio corrispondente all’ossatura dei due filamenti, e in questo caso le due estremità tagliate si dicono piatte; questo tipo di taglio non è però utile per lo scopo che ci si prefigge.
Si utilizzano invece quegli enzimi di restrizione che fanno un taglio sfalsato nei due filamenti: in questo caso si ottengono due estremità che non sono piatte, ma a filamento singolo.
L’enzima di restrizione utilizzato per compiere questo taglio sfalsato è l’enzima EcoRi.
Queste due estremità a filamento singolo si dicono estremità coesive, o sticky ends, perché tra loro sono appiccicose: se tornano vicine, infatti, si attaccano con dei legami a idrogeno perché sono complementari tra loro.
Se si taglia con lo stesso enzima di restrizione il plasmide e il DNA che contiene il gene che interessa, chiamato DNA donatore, che dev’essere incorporato nel plasmide, si ottiene che il plasmide tagliato si apre e avrà le estremità coesive; anche le estremità dei frammenti del DNA donatore saranno coesive tra loro ma anche con le estremità del plasmide.
Si forma quindi un plasmide con all’interno un frammento di un’altra specie: viene perciò chiamato chimera.
Mettendo a contatto questi plasmidi ricombinati con dei batteri vivi, questi li assorbono per trasformazione, diventando batteri GM, che riproducendosi clonano anche il frammento ricevuto, producendone numerosissime copie.
Per far sì che i vari frammenti si leghino tra loro occorre aggiungere anche la DNA ligasi.

Terminologia specifica


- Libreria genomica: Ogni colonia di batteri trasformati con un plasmide ricombinato è costituita da cellule identiche contenenti coppie di un particolare frammento del DNA donatore.
L’insieme di tutti i frammenti di DNA clonati nelle varie colonie, che corrisponde all’intero genoma dell’organismo, è detto libreria genomica.
I frammenti di DNA clonati contengono due o tre geni e li si può vedere come i libri in uno scaffale, che è il plasmide in una colonia, mentre l’insieme dei plasmidi nelle varie colonie rappresenta la libreria genomica.
- Sonde nucleotidiche (microarray): Possono essere usate per individuare geni specifici.
Il problema, infatti, è riuscire ad individuare e isolare il DNA che interessa nella colonia in cui è stato inglobato e clonato; l’alternativa per trovare la colonia potrebbe essere andare a vedere dove si trova la proteina codificata per quel gene, ma il problema è che non sempre i geni esprimono nell’ambiente il prodotto, quindi non può essere usato questo sistema.
La sonda genica è un frammento di DNA o RNA con una sequenza complementare a quella cercata, reso identificabile grazie al legame con una sostanza radioattiva o fluorescente.
La sonda, essendo complementare, si legherà con legami idrogeno con le basi complementari, rendendo identificabile il gene cercato.
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