di Metodi di inserimento dei vettori plasmidici nella cellula
Ci sono diversi sistemi per inserire un plasmide in una cellula (trasformazione per la cellula batterica e trasfezione per la cellula eucariotica).
I primi due sistemi funzionano sulla variabilità della permeabilità della membrana. Nel primo caso si usano ioni positivi inseriti nella membrana in modo che il DNA del plasmide (carico negativamente gli si avvicini). Viene poi portata la temperatura a gradi basse e con questo shock termico improvviso la membrana diventa permeabile e gli enzimi entrano. L’elettroporazione consiste in un impulso elettrico che fa variare la permeabilità della membrana.
Nel metodo di bombardamento biolistico (con pistola bio-rad) il plasmide viene circondato con una membrana di tungsteno e viene sparato all’interno delle cellule. Si usano questi metalli perché inerti, che non reagiscono e non provocano reazioni. Questo tipo di inserimento si fa solitamente nelle piante.
La microiniezione serve per inserire dei geni nelle cellule, soprattutto quando si vuole agire su cellule staminali embrioni ecc.
Una volta che le cellule sono state ottenute bisogna selezionare quelle che hanno inserito il gene. In alcuni casi l’introduzione non avviene. La selezione si fa con i geni reporter. Rispetto ad una tecnica basata sulla fluorescenza, i geni reporter con la resistenza per gli antibiotici, per certi tipi di utilizzo, sono utili perché sopravvivono.
