Analisi delle differenze strutturali e funzionali nei canali BK

Differenze strutturali nei canali BK

Appare subito evidente che esistono delle significative differenze nella struttura di questo canale rispetto a quella proposta per i canali ionici voltaggio-dipendenti. Innanzitutto le subunità formanti il poro del canale BK presentano, nella loro estremità N-terminale, un segmento transmembrana aggiuntivo (S0), oltre a quelli anche posseduti dai canali voltaggio-dipendenti (S1-S6). In secondo luogo questa subunità α possiede una lunga regione C-terminale, localizzata nel versante intracellulare, formata da altre 4 regioni a α-elica (S7-S10).

Importanza della sequenza N-terminale

Studi di mutagenesi sito-specifica indicherebbero che in questa regione N-terminale è presente una sequenza di 28 aminoacidi. La Ca-bowl include ben 10 cariche negative, 5 delle quali sono portate da 5 residui consecutivi di acido aspartico. Questa sequenza è altamente conservata nei canali BK di specie molto diverse tra loro, che vanno dai nematodi all’uomo, suggerendo che la sua presenza è essenziale per il corretto funzionamento di questo canale.

Esperimenti di mutagenesi e Ca-bowl

L’elevata densità di carica negativa presente in questa regione portò presto a formulare l’ipotesi che essa potesse rappresentare un sito di legame per gli ioni Ca, ipotesi confermata da esperimenti di mutagenesi. Si osservò infatti che la sostituzione dei vari aminoacidi carichi negativamente presenti in questa regione con residui neutri portava a un significativo decremento della sensibilità al Ca dei canali BK. Simili risultati si ottennero anche dopo delezione completa di questa regione. Sebbene gli esperimenti di mutagenesi appena descritti siano in linea con l’ipotesi che il Ca-bowl rappresenti un sito di legame per gli ioni Ca, altre possibilità esistono. A esempio mutazioni in questa regione potrebbero influenzare la Ca-sensibilità indirettamente, modificando il comportamento cinetico del canale, e senza alterare il legame del Ca al suo sito sul canale BK.

Conferma del legame del Ca-bowl

Per poter definitivamente concludere che il Ca-bowl sia effettivamente la regione del canale a cui il Ca si lega, fu condotto il seguente esperimento. Partendo da una proteina batterica che non presenta la capacità di legare Ca, si trovò che l’incorporazione, in questa proteina, di un dominio aggiuntivo identico alla regione C-terminale del canale BK, che includeva il Ca-bowl, conferiva alla proteina stessa la capacità di legare Ca. L’affinità per il Ca di questa proteina ricombinante veniva inoltre ridotta se alcuni degli aminoacidi carichi negativamente del Ca-bowl venivano sostituiti con residui neutri.