La citometria a flusso nello screening diagnostico dell'emoglobinuria parossistica notturna

Indice

1. Citometria a flusso ............................................................................................................ 2

1.1 Citometro a flusso ....................................................................................................... 3

Componenti e caratteristiche di un citometro a flusso .................................................. 4

1.2 Applicazioni della citometria a flusso ...................................................................... 10

2. Emoglobinuria parossistica notturna e clone EPN ......................................................... 11

2.1 Storia ......................................................................................................................... 12

2.2 Patofisiologia ............................................................................................................ 13

2.3 Caratterizzazione dell’EPN ....................................................................................... 15

Caratterizzazione citometrica dell’EPN ...................................................................... 16

2.3 Descrizione del metodo ............................................................................................ 18

In quali pazienti eseguire il test citometrico................................................................ 18

A cosa serve il test citometrico ................................................................................... 18

Fase preanalitica .......................................................................................................... 18

Fase analitica ............................................................................................................... 19

2.4 Refertazione del test citometrico .............................................................................. 24

La diagnosi citometrica ............................................................................................... 24

2.6 Terapia ...................................................................................................................... 25

2.7 Monitoraggio del Clone EPN nel tempo ................................................................... 27

2.8 Storia naturale dell’EPN ........................................................................................... 27

Conclusioni ......................................................................................................................... 28

Bibliografia ......................................................................................................................... 29

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1. Citometria a flusso

La citometria a flusso (anche chiamata citofluorimetria) è una metodica ampiamente usata per

l'analisi dell'espressione di molecole di superficie e intracellulari. Caratterizza e definisce

diversi tipi di cellule in popolazioni cellulari eterogenee, valuta la purezza di sotto-

popolazioni isolate e analizza la taglia e il volume delle cellule. Questa metodica permette la

simultanea analisi multiparametrica delle singole cellule ed è principalmente usata per

misurare l'intensità di fluorescenza prodotta da anticorpi fluorescenti marcati che individuano

proteine o ligandi che legano molecole specifiche associate ad un determinato tipo di cellule.

La procedura di marcatura consiste nel preparare una sospensione cellulare monodispensa da

una coltura cellulare o da campioni di tessuto. In seguito le cellule vengono incubate in

provette o in piastre per microtitolazione con anticorpi non marcati o marcati con fluorocromi

e successivamente analizzate al citofluorimetro (o citometro a flusso).

Nei citometri a flusso, sospensioni cellulari (come pure di nuclei, cromosomi ed altri materiali

biologici) vengono iniettate in un filetto liquido, il quale tende, in condizioni idrodinamiche

opportune a trasportare le cellule in maniera separata ed ordinata in un punto in cui arriva un

fascio di luce focalizzata. La finalità è quella di misurare parametri biofisici e biochimici per

poi raccoglierli nella memoria di un microprocessore, rappresentarli graficamente mediante

opportuni software e analizzarli con metodi statistici. Con i moderni citometri a flusso per

applicazioni clinico - laboratoristiche si possono misurare simultaneamente diverse proprietà

cellulari, senza per questo dover ricorrere a strumenti con doppio /triplo raggio di eccitazione.

L’analisi multiparametrica è uno dei più potenti aspetti di questa strumentazione necessaria

per affrontare i problemi biologici della eterogeneità cellulare tramite due operazioni

fondamentali: il gating ed il sorting. Il gating si usa per trarre pieno vantaggio dall’analisi a

più dimensioni; ad es. una popolazione C (Figura 1) può in base a determinati parametri di

(analisi bidimensionale) essere isolata con l’aiuto di una “finestra elettronica” e

tipo 1-2

quindi permettere la misura di altri due parametri 3-4, che la suddividono ancora in altre

popolazioni. Il cell-sorting, che è un gating fisico, consente invece di raccogliere fisicamente

la popolazione C in una provetta separata. Come tutte le metodiche scientifiche anche la

citometria a flusso presenta dei limiti e dei vantaggi. Un limite è rappresentato dai parametri

di morfologia FSC (forward scatter) verso SSC (side scatter) che essendo a bassa risoluzione

non sempre consentono di separare cellule di istotipo diverso. Un secondo esempio può

riguardare l’analisi di cellule molto rare, che in CFM non sono separabili dal rumore di fondo,

a causa del loro ridotto numero in confronto alla massività dell’analisi. Le limitazioni

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all’impiego della CFM trovano

anche altre giustificazioni, quali

la necessità di dover lavorare

con campioni in fase

monodispersa e l’impossibilità

di localizzare la sede di Figura 1: Esempio di analisi multiparametrica

provenienza di un segnale, in

caso di contemporanea presenza di marcatori nei diversi compartimenti cellulari. Tra i

vantaggi della CFM sono da evidenziare: la possibilità di analisi multiparametrica, l’elevato

numero di cellule esaminate (oltre 50000), l’obiettività, la riproducibilità e l’affidabilità

statistica delle letture, la rapidità dei tempi di analisi (oltre 1000 cell/sec), nonché la

semplicità di processazione dei campioni da esaminare, evitando lunghe e complesse

procedure di purificazione, senza per questo perdere la vitalità cellulare (cell-sorting). I

misure molto sensibili dell’ordine di 300-

citometri a flusso a raggio laser consentono inoltre

400 molecole di fluoroforo/cell: ridurre la sensibilità è un evento possibile ma nello stesso

tempo rischioso, perché può risultare poi difficile separare l’oggetto della misura da artefatti

tecnici [4].

1.1 Citometro a flusso

Il principio di funzionamento di un citometro a flusso può essere così riassunto: una

sospensione cellulare monodispersa (cellule da sangue periferico, aspirato midollare,

agoaspirati di diversa natura da tessuti solidi dissociati), viene convogliata da un sistema

fluidico di trasporto fino al punto di misura. Qui incontra un fascio luminoso focalizzato di

alcune decine di micron, tramite l’ausilio di una lente proveniente da una sorgente di

eccitazione. Quando il raggio di luce intercetta il flusso cellulare (stream) vengono generati

segnali dall’incontro di ogni singola cellula. Questi segnali sono legati alle caratteristiche

fisiche della particella (diametro, rapporto nucleo/citoplasma, granularità interna, rugosità di

membrana), e alla presenza di molecole fluorescenti localizzate in diversi siti. Una volta

emessi, i segnali sono raccolti da un sistema di lenti, specchi dicroici e filtri ottici, e inviati ai

che ne misurano l’intensità.

rispettivi sensori (fotodiodi e fotomoltiplicatori) Questi segnali

elettrici (analogici) provenienti da ogni sensore, opportunamente amplificati e digitalizzati,

associati tra loro, sono inviati a un analizzatore/elaboratore di dati che provvede alla

presentazione su un monitor dei medesimi e alla loro definizione statistica [4].

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Componenti e caratteristiche di un citometro a flusso

 Il sistema fluidico

Nella sua forma più semplice un citometro a flusso è la combinazione di un sistema di

dispensazione di un campione liquido con uno spettrofluorimetro ed un fotometro a light

scatter. Partendo da un campione consistente in una sospensione cellulare (o di altre

particelle) il sistema di dispensazione del campione liquido fornisce un mezzo conveniente ed

efficiente per presentare individualmente le cellule del campione alla stazione di misura. La

sospensione cellulare è trasportata dal sistema di distribuzione alla cella a flusso dove viene

iniettata attraverso un piccolo ago. Nella Figura 2 viene mostrata schematicamente una

camera di flusso di un citometro. In essa si realizzano alcune condizioni idrodinamiche

necessarie per la misurazione. La focalizzazione idrodinamica consiste nel fare in modo che

singole cellule attraversino il punto di intersezione con un raggio di luce, anch’esso

allineate lungo l’asse di un filetto fluido di piccole dimensioni. In

focalizzato, mantenendosi

pratica, se il regime fluidico è di tipo laminare, si creano due flussi coassiali. Quello interno

contiene le cellule (core flow o nucleo del flusso) e quello esterno mantiene queste ultime

lungo l’asse ideale di flusso (sheath fluid o fluido di guaina). Agendo sul sistema pneumatico

di trasporto che controlla la differenza di pressione tra core flow e sheath fluid si regola la

valutata in numero di “eventi” al

velocità di efflusso delle cellule (flow rate), normalmente

secondo, cioè numero di “particelle” che hanno incontrato lo spot luminoso nell’unità di

tempo. È logico pertanto evitare la formazione di aggregati di grosse dimensioni. nm) c’è

Essendo la camera di flusso di geometria variabile, ma di dimensioni ridotte (75-250

la necessità di filtrare i campioni al fine di evitare intasamenti dello strumento. Una pressione

di spinta e una progressiva focalizzazione idrodinamica come suddetto, determinano una

velocità di conta più o meno costante, che può essere regolata tra 200 e 2000 cell/sec.

Esistono numerose varianti di

camere a flusso nel tipo e nella

geometria, in relazione alle

diverse esigenze di costruzione

dei diversi apparecchi e ai vari

tipi di illuminazione (laser o

lampade). Tra le più semplici ci

sono quelle coniche terminanti

con un piccolo orifizio o

“nozzle”; quelle a cuvetta di Figura 2: Schema di una camera di flusso

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quarzo e quelle capillari. Per questa caratteristica si distinguono quindi citometri con fluidica

a “circuito chiuso” (solo analizzatori), nei quali il campione analizzato in cuvetta o in orifizi

capillari viene p