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La citometria a flusso nello screening diagnostico dell'emoglobinuria parossistica notturna

La tesi verte sull'attività di tirocinio che ho svolto presso il laboratorio di citofluorimetria del centro trasfusionale dell'ASP di Trapani descrivendo la tecnologia in questione e il citofluorimetro (la sua struttura e il suo funzionamento). Fra le varie patologie che ho analizzato al citofluorimetro quella che ha suscitato in me un certo interesse è stata l'EPN (emoglobinuria parossistica... Vedi di più

Materia di Immunoematologia relatore Prof. S. Lo Brutto

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2. Emoglobinuria parossistica notturna e clone EPN

L’emoglobinuria parossistica notturna (EPN o PNH acronimo di paroxysmal nocturnal

hemoglobinuria) è un raro disordine di natura clonale caratterizzato da distruzione prematura

delle cellule del sangue, conseguente ad anomalie della membrana cellulare acquisite durante

la formazione midollare. È una rara forma di anemia, caratterizzata dalla seguente triade

clinica:

 emolisi intravascolare cronica (rottura dei globuli rossi con fuoriuscita

dell’emoglobina);

 trombosi venose, che si verificano nel 50% circa dei pazienti, specie a carico delle

vene epatiche, addominali, cerebrali e del derma;

 citopenia (insufficiente produzione di cellule del sangue nel midollo osseo), che può

essere lieve o severa (pancitopenia), in associazione con anemia aplastica.

Pur essendo cronica, la malattia mostra riacutizzazioni episodiche dei sintomi (crisi

emolitiche), e per questo viene definita parossistica: gli episodi hanno durata variabile, da

pochi giorni ad alcune settimane, e sono caratterizzati tipicamente da comparsa di urine scure

al mattino, crisi dolorose specie a carico del distretto esofageo e addominale, possibilità di

eventi trombotici. La distruzione dei globuli rossi determina gradi estremamente variabili di

anemia; si va infatti da forme clinicamente silenti a quadri dominati da astenia, facile

affaticabilità, colorazione giallastra di cute e mucose (ittero), ingrandimento della milza

(splenomegalia). In alcuni casi la presenza di emoglobina nelle urine (emoglobinuria) può non

essere mai riscontrata, mentre è quasi sempre evidenziabile la presenza di emosiderina, forma

dell’emoglobina.

insolubile di ferro derivante dal metabolismo Gli episodi tendono a

verificarsi in particolare di notte o in condizioni di stress fisico (es. interventi chirurgici,

infezioni). Oltre all’anemia i pazienti possono presentare anomalie, e riduzione del numero, a

carico dei globuli bianchi con un’aumentata suscettibilità alle infezioni, nonché a carico delle

piastrine con comparsa di manifestazioni trombotiche profonde dei vasi addominali, epatici

(con ittero, dolore addominale, epatomegalia, ascite), del derma (con formazione di noduli

cutanei rossastri dolorosi). Rara è la trombosi dei vasi cerebrali (con cefalea, papilledema).

Nel 10-20% dei casi la riduzione progressiva dei globuli bianchi associata alla diminuzione

delle piastrine determina l’evoluzione dell’emoglobinuria parossistica notturna in anemia

aplastica. Sono comunque descritti anche casi di remissione spontanea della malattia [5].

11

2.1 Storia

Una delle prime descrizioni

dell’EPN fu del Dr. Paul

Strübing che nel 1882 descrisse

un maschio di 29 anni che

presentava stanchezza, dolori

addominali e gravi parossismi

notturni di emoglobinuria.

dedusse che l’emolisi

Strübing

si stava verificando Figura 8: Provette che mettono a confronto un campione di

intravascolarmente quando il un paziente affetto da EPN (le provette 1, 2 e 3) con un

campione di controllo (4, 5 e 6). Entrambi i campioni sono

plasma del paziente virò verso il stati sottoposti al test di Ham.

rosso dopo gravi attacchi di

Rapporti successivi di Marchiafava e Micheli portarono all’eponimo,

emoglobinuria.

sindrome di Marchiafava-Micheli, ma fu Enneking, nel 1925, che introdusse il termine

emoglobinuria parossistica notturna. Nel 1937, Thomas Ham mise a punto il primo test

per l’EPN (il test di Ham)

diagnostico [1]. Si effettua mediante l'incubazione a 37°C dei

globuli rossi del paziente con siero umano acidificato: in ambiente acido, infatti,

il complemento viene attivato per la via secondaria e provoca emolisi. In seguito si

risospendono i globuli rossi del paziente nel siero di un altro soggetto compatibile, perché

quello del paziente può avere i fattori del complemento consumati, data la ripetuta attivazione

sui globuli rossi sensibili (Figura 9). Fu solo nel 1954, con la scoperta del via alternativa per

l’attivazione del complemento, che il complemento è stato dimostrato ufficialmente essere la

causa dell’emolisi negli eritrociti con EPN. Negli anni ’80 fu scoperto che le cellule EPN

mostravano una complessiva carenza di un gruppo di proteine che si fissano sulla superficie

cellulare mediante l’ancora glicosilfosfatidilinositolo (GPI). Due delle proteine mancanti che

si ancorano al GPI (CD55 e CD59) regolano il complemento. Pochi anni dopo, fu scoperta

responsabile della carenza della carenza dell’ancora GPI, e

una mutazione genetica (PIG-A)

più recentemente, un anticorpo monoclonale umanizzato che inibisce l’attivazione del

complemento ha dimostrato di migliorare l’emolisi, la trombosi e la qualità della vita nei

pazienti affetti da EPN [1]. 12

2.2 Patofisiologia

Come menzionato precedentemente, l'EPN ha una causa

genetica ampiamente riconosciuta che non è ereditata né

trasmessa alla progenie. Si sviluppa attraverso una mutazione

somatica del gene PIG-A gene che si verifica nelle cellule

staminali ematopoietiche, che originano una progenie di

cellule sanguigne mature con la strana caratteristica della

mancanza di determinate proteine sulla loro superficie. Tutte

le proteine mancanti sulla superficie delle cellule EPN

condividono un meccanismo comune per attaccarsi alla

membrana cellulare, che è stato identificato in una struttura

glicolipidica chiamata ancora glicosilfosfatidilinositolo (GPI)

(Figura 9). PIG-A è un gene housekeeping localizzato nel

braccio corto del cromosoma X (Xp22.1). Il gene PIG-A

codifica un enzima essenziale che trasferisce, in

combinazione con almeno altre due proteine, un'N-acetil

glucosamina ad un fosfatidilinositolo; questo è il primo

passaggio della biosintesi del dell'ancora GPI. Tutte le

mutazioni identificate nei pazienti affetti da EPN influiscono

sul gene PIG-A; nessuna anormalità è stata trovata in Figura 9: Struttura chimica

dell’ancora GPI

nessuno dei numerosi geni coinvolti nei passaggi successivi

della biosintesi dell'ancora GPI. Infatti il gene PIG-A è l'unico gene legato all'X e un singolo

evento mutazionale è sufficiente a sconvolgere la biosintesi dell'ancora GPI (anche nelle

femmine in seguito all'inattivazione funzionale del cromosoma X). Il ruolo dell'ancora GPI in

una cellula sembra essere molto importante, come supportato dalla sua alta conservazione

nelle cellule eucariotiche, includendo il lievito e il tripanosoma; ad ogni modo le implicazioni

funzionali delle proteine che si ancorano al GPI e della stessa ancora GPI non sono del tutto

chiare. Si sa che le proteine ancorate al GPI (GPI-APs) non sono distribuite casualmente sulla

superficie cellulare, ma piuttosto costituiscono sottodomini di membrana arricchiti in lipidi

specifici, come colesterolo e sfingolipidi; queste strutture, chiamate rafts (zattere), sembrano

essere coinvolte nel traffico e nel rimodellamento della membrana, includendo la endo-, la

eso- e la potocitosi, così come nella trasduzione del segnale. A causa dell'insufficienza di

ancore GPI le cellule EPN mancano di tutte le GPI-APs sulla loro superficie; finora, sono

state descritte sulle cellule del sangue più di 25 proteine differenti che condividono il sistema

di ancoraggio al GPI le cui specifiche funzioni sono parzialmente note. Tuttavia, alcune GPI-

13

APs sono state descritte funzionalmente e sono state fondamentali per svelare completamente

i meccanismi patogenetici di alcune manifestazioni cliniche dell'EPN. Infatti, tra le GPI-APs

ci sono due proteine regolatrici del complemento chiamate CD59/MIRL (inibitore della lisi

reattiva della membrana) e CD55/DAF (fattore di accelerazione del decadimento). Agiscono

su livelli diversi della cascata del complemento: CD55 controlla inizialmente l'attivazione del

complemento, inibendo le C3 e C5 convertasi, mentre CD59 interferisce con l'effettore del

complemento terminale, bloccando l'incorporazione di C9 sul complesso C5b-C8 che

formerebbe il complesso di attacco alla membrana (MAC). La mancanza di queste proteine

porta all'aumento della suscettibilità degli eritrociti EPN per la lisi complemento-mediata,

risultante nella tipica emolisi intravascolare. Un livello basso di attivazione del complemento

è un fenomeno fisiologico costante amplificato enormemente durante i processi

d’infiammazione o delle malattie infettive; gli eritrociti EPN vanno incontro ad un'emolisi

intravascolare cronica nei pazienti EPN dovuta ad una carenza di CD55 e CD59, con una

durata della vita ridotta al 10% comparata con quella di eritrociti normali. La carenza di GPI-

AP sugli eritrociti potrebbe essere totale (cellule con EPN di tipo III), parziale (cellule con

EPN di tipo II),

risultando in

sensibilità diverse

alla lisi

complemento-

mediata. CD55 e

CD59 sono carenti

sugli eritrociti ma

anche sui leucociti e

sulle piastrine; Figura 10: Sviluppo dell'EPN

tuttavia, per quanto

riguarda i leucociti, non c’è un’evidenza della riduzione della durata della vita di queste

cellule nei pazienti EPN, probabilmente perché le cellule nucleate hanno un ulteriore inibitore

In contrasto, l’attivazione incontrollata del complemento

del complemento transmembrana.

sulle piastrine è stata ipotizzata come possibile spiegazione per altre caratteristiche cliniche

dell’EPN, ossia la propensione ad eventi tromboembolici. Infatti, l’attivazione del

guidare le piastrine all’attivazione e all’aggregazione, amplificando la

complemento potrebbe

formazione dei coaguli; ad ogni modo, non è stata fornita nessuna dimostrazione di questo

meccanismo finora, e sono stati postulati altri meccanismi [3].

14

2.3 Caratterizzazione dell’EPN

Dal punto di vista ematologico, un Clone EPN è

l’insieme di cellule derivate da una singola

cellula staminale che ha subìto una mutazione

nel gene PIG-A. Dal punto di vista citometrico,

è l’insieme di cellule che vengono

un Clone EPN

identificate da un deficit di espressione di

almeno due proteine GPI-linked (oppure da un

deficit dell’ancora GPI e di una proteina GPI-

linked), su almeno due popolazioni cellulari. È Figura 11: Tipico istogramma citometrico

importante ricordare poi alcuni concetti relativo all’espressione di CD59 sugli

eritrociti di un paziente affetto da EPN

fondamentali: nello stesso paziente può essere

presente un solo Clone EPN (evenienza più frequente) o due cloni (più raramente);

l’identificazione del si ottiene osservando l’istogramma di fluorescenza relativo

Clone EPN

all’espressione delle singole proteine GPI-linked: le molecole non espresse, o espresse in

modo chiaramente difettivo, testimoniano la presenza del clone (Figura 11). Nel 2005 è stato

proposto dall’International EPN Interest Group (I-PIG) uno schema classificativo della EPN,

che prevede tre principali categorie di malattia (Tabella 1). Lo scopo di questa classificazione

è duplice: innanzitutto fornire una terminologia adatta a descrivere i differenti livelli di

presentazione della malattia; in secondo luogo far comprendere che la presenza del Clone

EPN è il requisito indispensabile sul quale costruire una diagnosi di EPN, ma che da sola essa

non consente di formulare una diagnosi clinica definitiva in assenza di informazioni come

l’emolisi e la presenza di insufficienza midollare [2].

Emolisi Stato del Dimensione del

Tipo intravascolare midollo osseo clone EPN

Midollo iper- o normo-

Florida: cellulato con iperplasia Grande

EPN classica emoglobinuria eritroide, alterazioni usualmente > 50%

macroscopica morfologiche lievi o

assenti

EPN nel contesto di Da lieve a moderata

un’altra patologia con emoglobinuria Evidente insufficienza Variabile

insufficienza midollare macroscopica midollare usualmente < 30%

(es. anemia aplastica) intermittente o assente

EPN subclinica, nel Assenza di

contesto di un’altra Evidente insufficienza Piccola

emolisi/emoglobinuria sia

patologia (es. anemia midollare usualmente < 1%

clinica che biochimica

aplastica)

Tabella 1: Classificazione clinico-citometrica della PNH

15

Caratterizzazione citometrica dell’EPN

L’obiettivo della caratterizzazione citometrica di un paziente con sospetta EPN è quindi

l’identificazione di uno o, meno frequentemente, più Cloni EPN. Le principali molecole GPI-

linked presenti sulle cellule ematopoietiche e potenzialmente utilizzabili nella

caratterizzazione fenotipica del sangue periferico in un paziente con EPN sono riportate nella

Tabella 2. Da sottolineare che nella Tabella 2 non sono stati inclusi i linfociti né le piastrine in

quanto privi di valore diagnostico. Tra le molecole alternative, che non sono suggerite dalla

Tabella 2, ma che sono ancora oggi riportate largamente in letteratura, ricordiamo CD55 per i

globuli rossi, CD16 e CD66b per i granulociti, CD48 e CD55 per i monociti. La scelta del

clone anticorpale da utilizzare come reagente per svelare la presenza di una proteina GPI-

linked è molto importante come mostrato in Figura 12. Nella Figura 12 si introduce anche la

nomenclatura per definire cellule normali e cellule di derivazione clonale nell’EPN: la sigla

EPN-I indica le cellule normali; la sigla EPN-III indica le cellule francamente patologiche

(ossia totalmente difettive per l’ancora GPI); la sigla EPN-II indica le cellule con

un’espressione intermedia dell’ancora, che fanno parte, ove presenti, di un secondo clone,

portatore di una seconda mutazione. Suggeriamo di quantificare la quota EPN-II solo in

presenza di un chiaro picco intermedio; sebbene il picco EPN-II sia sostenuto da una

mutazione diversa, le dimensioni globali della componente clonale saranno il risultato della

in realtà l’area

somma di EPN-II e EPN-III. Nei casi riportati nella Figura 12, EPN-II

delimita, più che un vero e proprio picco, un plateau di passaggio fra EPN-III e EPN-I. Pur

essendo dedicata agli anticorpi monoclonali, la Tabella 2 contiene il suggerimento di usare il

Aerolysin) come sistema indicatore della presenza o assenza dell’ancora

FLAER (Fluorescent

GPI; si tratta di una tossina batterica inattivata, che ha l’interessante proprietà di legarsi

all’ancora di GPI, e dunque è un validissimo reagente capace di identificare in un sol colpo la

presenza o l’assenza di tutte le molecole GPI-linked. Purtroppo questa molecola non è

utilizzabile sui globuli rossi, in quanto essi sono sprovvisti dell’enzima indispensabile per

attivare la funzione di legame dell’aerolisina. È da considerare come reagente di riferimento

per la ricerca citometrica di un Clone EPN in granulociti e monociti. Grazie alla sua

sensibilità, consente di identificare cloni di piccole dimensioni. Nelle mielodisplasie,

condizioni in cui già di per sé possono mancare molecole GPI-linked, il FLAER permette di

identificare con certezza la presenza di un Clone EPN. La popolazione EPN-II è più

facilmente rilevabile, ove presente, sui globuli rossi, sebbene l’introduzione del FLAER potrà

permettere di evidenziare anche la componente granulocitaria del Clone EPN-II. Nella Figura

13 è mostrato un tipico istogramma della reazione del FLAER con i granulociti neutrofili, in

16

un paziente con EPN. Come si può osservare, è presente una minoranza di cellule normali,

FLAER-positive, accanto ad una maggioranza di cellule EPN, FLAER-negative [2].

Reagenti citati dalla letteratura (nel caso degli anticorpi

Cellule Molecole monoclonali è riportato il nome del clone)

Eritrociti CD59 MEM-43, P282E, p282 [H19], VJ1/12.2

Granulociti neutrofili CD24 ALB9, ML5

Monociti CD14 MFP9, RMO52,

Granulociti neutrofili e Ancora FLAER

Monociti GPI

Tabella 2: Principali molecole da identificare per un’accurata identificazione del Clone EPN

Figura 12: Reattività di differenti cloni anticorpali rivolti contro il CD59, coniugati con lo

stesso fluorocromo (PE).

Figura 13: Tipico istogramma citometrico

relativo all’espressione dell’ancora GPI

(visualizzata mediante il reagente FLAER) sui

granulociti neutrofili, in un paziente affetto

da EPN 17

2.3 Descrizione del metodo

In quali pazienti eseguire il test citometrico

citofluorimetrico per l’EPN

Il test dovrebbe essere considerato un test di screening nelle

seguenti situazioni:

 nelle anemie aplastiche;

 nelle anemie emolitiche Coombs-negative;

 in pazienti con emoglobinuria macroscopica o biochimicamente rilevabile;

 in tutti i casi di insufficienza midollare di citopenia idiopatica;

 nelle citopenia refrattarie con displasia unilineare o multilineare;

 nei casi di trombosi (arteriose o venose) in sedi atipiche, come ad esempio la sindrome

di Budd-Chiari, le trombosi intra-addominali (vene mesenteriche e porta), le trombosi

delle vene cerebrali.

citofluorimetrico per l’EPN

Il test va considerato nelle seguenti situazioni di follow-up:

 dell’EPN

per il monitoraggio florida, classica;

 nell’Anemia Aplastica e nelle sindromi

per il monitoraggio dei Cloni EPN

mielodisplasiche [2].

A cosa serve il test citometrico

Il test citometrico rappresenta l’esame gold-standard nell’identificare un Clone EPN,

dall’assenza (totale o parziale) delle molecole GPI-linked. L’identificazione del

caratterizzato

Clone EPN rappresenta il requisito indispensabile per la diagnosi di EPN. In assenza di un

clone documentato, non è possibile porre diagnosi di EPN. Tuttavia, in presenza del clone,

vanno prese in considerazione le tre possibili condizioni riportate in Tabella 1 [2].

Fase preanalitica

1. Informazioni rilevanti sul paziente che ci accingiamo a studiare

a. se ha ricevuto trasfusioni o ha presentato episodi emolitici recenti;

b. se il paziente è alla diagnosi o in corso di monitoraggio;

i valori dell’emocromo funzionali all’analisi citometrica (numero assoluto di

c. eritrociti, granulociti neutrofili e monociti);

d. eventuali terapie specifiche in corso.

2. Caratteristiche del campione

a. prelievo di 3-4 ml di sangue periferico in eparina o EDTA o ACD; [nota: non

deve essere utilizzato il sangue midollare, in quanto la presenza di cellule

18

immature a fenotipo complesso può costituire un elemento fuorviante. Un test

per l’EPN

citometrico deve essere semplice e riproducibile, e dunque il sangue

periferico è il tessuto ideale su cui lavorare.]

b. il test va eseguito possibilmente entro le 24 ore.[nota: in casi particolari

(paziente distante, richieste di consulenza) al massimo entro 48 ore. [2]

Fase analitica

Il test di base va eseguito sui granulociti neutrofili e sugli eritrociti; in caso di presenza del

l’analisi va estesa ai monociti, che costituiscono anche un test di conferma, all’interno

clone,

dei leucociti.

La preparazione dei campioni deve essere eseguita in relazione al livello di sensibilità che si

desidera ottenere; definiamo 3 livelli di sensibilità della tecnica:

 bassa (limite di sensibilità 1%, ossia una cellula EPN su 100 cellule normali);

 media (limite di sensibilità 0,1%, ossia una cellula EPN su 1.000 cellule normali);

 alta (limite di sensibilità 0,01%, ossia una cellula EPN su 10.000 cellule normali). In

teoria, acquisendo elevati numeri di cellule ed in particolari condizioni di

ottimizzazione della lettura citometrica, è possibile scendere al di sotto di questa

soglia. Tuttavia, l’identificazione di cloni inferiori a 10-4 è priva, al momento, di

significato clinico e non va segnalata.

Quello che cambia nelle tre metodologie è il numero di cellule che devono essere acquisite al

citometro nello specifico gate. Per ottenere un’alta sensibilità bisogna acquisire cellule con

un’elevata numerosità, e ciò è possibile solo per alcune popolazioni cellulari: eritrociti e, nei

casi non marcatamente citopenici, granulociti; difficilmente per i monociti saranno possibili

rilevazioni ad alta sensibilità. Il numero minimo di eventi da acquisire al citometro nel gate

specifico, per ciascun livello di sensibilità, è definito dal numero minimo di eventi che

consente di individuare un cluster di cellule patologiche (EPN) pari o superiore a 30 (valore

che è ritenuto il numero minimo di cellule che definisce un cluster significativo). Ad esempio:

pari all’1% avremo bisogno di acquisire almeno 3.000

per identificare una popolazione EPN

eventi nel gate (30x100 = 3.000). Allo stesso modo, per identificare una popolazione EPN

pari allo 0,01% avremo bisogno di acquisire almeno 300.000 eventi nel gate (30x10.000 =

300.000). In presenza di situazioni borderline (es. un cluster di 29 cellule EPN su 300.000

va refertato come “assente”. In presenza di analoghe

eventi acquisiti nel gate), il clone

situazioni borderline, in cui però il target di 300.000 eventi acquisiti non è stato raggiunto (es.

un cluster di 29 cellule su 290.000 eventi acquisiti nel gate), l’esame, pur essendo suggestivo

deve essere refertato come “non e ripetuto

per la presenza di un clone pari a 10-4, conclusivo”

19

in occasione del successivo prelievo ematico. Come già detto, per i monociti è pressoché

impossibile acquisire il numero di eventi richiesti per una determinazione ad alta sensibilità.

Nelle citopenie più marcate è virtualmente impossibile acquisire il numero richiesto per l’alta

sensibilità anche per i granulociti. Al contrario, per gli eritrociti è sempre possibile una

determinazione ad alta sensibilità. La popolazione che meglio riflette le dimensioni del Clone

EPN è quella dei granulociti, in quanto gli eritrociti EPN possono risultare sottostimati a

causa di eventuali emotrasfusioni ricevute o della presenza di emolisi intravascolare (vedi fase

preanalitica). Applicando i tre diversi approcci di sensibilità a quanto indicato in Tabella 1 si

classica, caratterizzata dall’espansione di un

ottiene che una EPN Clone EPN al di sopra del

50%, può essere identificata utilizzando la tecnica a bassa sensibilità, mentre una EPN

è generalmente minore dell’1%, richiede una tecnica

subclinica, in cui il Clone EPN

maggiormente sensibile. Risulta ovvio che le sensibilità indicate sono quelle a cui tendere

nell’analisi: si potrebbe infatti non arrivare alle sensibilità indicate a causa della scarsa

cellularità dei campioni, come ad esempio nelle citopenie marcate [2].

Linea cellulare

Sospetto Monociti Granulociti Eritrociti

Anemia Aplastica

Citopenia Idiopatica

Insufficienza midollare Bassa/Media Media/Alta Alta

Sindrome

Mielodisplastica (MDS)

Anemia Emolitica

Emoglobinuria Bassa/Media Media Media

Trombosi AA/VV in

sedi atipiche

Sospetto non Bassa/Media Media Media

dichiarato

Tabella 3: Sensibilità da utilizzare nei vari sospetti diagnostici

20

 Passaggi operativi per caratterizzare i granulociti neutrofili

1. Risospendere accuratamente il campione di sangue prelevato al paziente.

2. Prelevare la quantità adeguata di sangue del paziente ed incubarla accuratamente in

provette da citometria oppure di maggiori dimensioni ove indicato, evitando ogni

difetto di mixing (Figura 14) fra campione e reagenti, con appropriate quantità di ogni

anticorpo monoclonale o di FLAER.

3. Agitare sul vortex in modo da essere certi che nessuna frazione di campione sia

esclusa dalla reazione.

min a 4°C, al buio (è corretta anche l’incubazione a TA, al buio).

4. Incubare per 30

Lisare miscelando l’aliquota di sangue periferico con

5. soluzione di cloruro di ammonio

in rapporto di 1:20-1:40.

6. Agitare sul vortex e lasciare lisare a temperatura ambiente per 10 min.

7. Centrifugare a 2.000 rpm per 3min in una centrifuga da banco.

8. Allontanare delicatamente il sovranatante (meglio se per aspirazione) e risospendere in

μL di PBS, o comunque nella minima quantità di tampone idonea per la

200-300

lettura al citometro.

9. Acquisire almeno 3.000 eventi nel gate granulocitario, nella tecnica a sensibilità

standard, 30.000 nella tecnica a sensibilità intermedia e 300.000 eventi nella tecnica ad

alta sensibilità [2].

Figura 14: Un errore di mescolamento del sangue del paziente con gli anticorpi monoclonali può

portare ad una falsa misura del Clone EPN, dovuta all’esclusione di parte del campione dalla miscela

di reazione. 21

 Passaggi operativi per caratterizzare i monociti

1. Risospendere accuratamente il campione di sangue prelevato al paziente.

2. Prelevare 50µl del sangue del paziente e incubarli accuratamente in provette da

citometria, evitando ogni difetto di mixing fra campione e reagenti, con appropriate

quantità di ogni anticorpo monoclonale o di FLAER (Figura 15).

3. Agitare sul vortex in modo da essere certi che nessuna frazione di campione sia

esclusa dalla reazione. (è corretta anche l’incubazione a TA, al buio).

4. Incubare per 30min a 4°C, al buio

5. Lisare con 2mL di soluzione di cloruro di ammonio.

6. Agitare sul vortex e lasciare lisare a temperatura ambiente per 10min.

7. Centrifugare a 2.000rpm per 3min in una centrifuga da banco.

8. Allontanare delicatamente il sovranatante (meglio se per aspirazione) e risospendere in

di PBS, o comunque nella minima quantità di tampone idonea per la

200-300μL

lettura al citometro.

9. Acquisire almeno 3.000 eventi nel gate, se possibile. Per i monociti non viene richiesta

sensibilità

l’alta [2].

Figura 15: Un esempio di doppia marcatura

dei monociti con anticorpo anti CD14

marcato in APC-Cy7 e con FLAER marcato

22

 Passaggi operativi per caratterizzare i globuli rossi

1. Diluire il campione di sangue periferico con PBS (1:500) per ottenere una sospensione

di globuli rossi.

Prelevare 50μl della sospensione ottenuta ed incubarli accuratamente in provette da

2. citometria, evitando ogni difetto di mixing (Figura 16) fra sospensione e reagenti, con

appropriate quantità di ogni anticorpo monoclonale.

3. Agitare sul vortex in modo da essere certi che nessuna frazione di campione sia

esclusa dalla reazione.

Incubare per 30min a 4°C, al buio (è corretta anche l’incubazione a TA, al buio).

4.

5. Lavare con 2mL di PBS a 2.000rpm per 3min in una centrifuga da banco.

6. Allontanare delicatamente il sovranatante (meglio se per aspirazione) e risospendere in

di PBS, o comunque nella minima quantità di tampone idonea per la

200-300μL

lettura al citometro.

7. Acquisire almeno 3.000 eritrociti nel gate per la tecnica standard, 30.000 per la tecnica

a sensibilità intermedia, 300.000 per la tecnica ad alta sensibilità [2].

Figura 16: Dimostrazione di come un errore di mescolamento del campione con i reagenti possa

portare alla falsa identificazione di un Clone EPN. Il pannello C mostra una falsa popolazione EPN.

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DESCRIZIONE TESI

La tesi verte sull'attività di tirocinio che ho svolto presso il laboratorio di citofluorimetria del centro trasfusionale dell'ASP di Trapani descrivendo la tecnologia in questione e il citofluorimetro (la sua struttura e il suo funzionamento). Fra le varie patologie che ho analizzato al citofluorimetro quella che ha suscitato in me un certo interesse è stata l'EPN (emoglobinuria parossistica notturna) che ho descritto in ogni suo aspetto attenzionando il test diagnostico. Voglio precisare che la prof.ssa Lo Brutto è stata la mia tutor universitaria (la relatrice durante la mia laurea) ed insegna Zoologia al CdL in Scienze Biologiche mentre la mia tutor aziendale (con la quale ho svolto il tirocinio e che mi ha supportato per stilare la tesi) è stata la dott.ssa Alfonzo del centro trasfusionale del P.O. S. Antonio Abate (ASP di Trapani).


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche (CALTANISSETTA, PALERMO, TRAPANI)
SSD:
Università: Palermo - Unipa
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher nicolamilano91 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Immunoematologia e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Palermo - Unipa o del prof Lo Brutto Sabrina.

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