Biologia cellulare

Differenziamento, Inattivazione del cromosoma X, Dinamicità

dell’espressione.

X inactivation: fenomeno di compensazione di dose, nell’organismo

femminile sono presenti due cromosomi X, ha lo scopo di ridurre la

quan9tà di espressione genica da 2 a 1. A partire dalla regione Xic (X

inactivation center) la trascrizione del gene Xist, che codifica per un

lnc RNA che sarà in grado di inattivare il cromosoma da cui è

trascritto. E’ un fenomeno casuale, temporalmente determinato per

essere passato alle cellule figlie —> ogni tessuto è un mosaico

perché metà delle cellule del tessuto hanno dei geni X-linked espressi

sull’X paterno (perché l’X materno è inattivato) e viceversa per le

cellule che hanno l’X paterno inattivato.

Concetti essenziali:

– Inattivazione strutturale perpetuata —> inattivazioni forti

dell’85% del cromosoma propagate alle cellule figlie e

modifiche strutturali forti —> Corpo di Barr: cromosoma X

inattivato è strutturalmente diverso, compatto/condensato e

visibile

– lncRNA: Xist inattiva il cromosoma all’85% perché recluta

modificatori della cromatina; la fenomenologia non è

generale, ma locale; fenomeno con timing e territorio-

specifico che permettono modifiche repressori o attivatori

che sono ereditabili e modificabili —> Gene Imprinting: ci

sono geni imprinted in maniera materna e paterna, ovvero in

una delle due copie avviene una modifica che la rende

strutturalmente incapaci di lavorare.

La stabilità della modifica è perpetuata in tutte le cellule fino alla

gametogenesi/spermatogenesi, dove si azzera la repressione e si

rinstaura la repressione in tutte le cellule di gametogenesi femminile/

spermatogenesi maschile in modo tale da dare alla prossima

generazione un gamete femminile/maschile chiuso in geni di

imprinting. —> l’imprinting riguarda modifiche epigenetiche

repressorie locali e perpetuate in tutte le cellule somatiche, che

trovano un momento di azzeramento e sono modificabili in

gametogenesi.

Cosa guida la specificità di azione dei modificatori? I modificatori

della croma9na interagiscono con 2 elementi fondamentali:

1) Fattori trascrizionali

2) RNA non codificanti

L’epigenetica sono modificazioni dell’attività genetica che non altera

la sequenza del DNA ma sono ereditarie,modificabili e controllano:

Silenziamento genico X inactivation, genomic

imprinting

Espressione genica Tessuto/sviluppo specifica

Vescicole Extracellulari

Le cellule comunicano tramite vescicole per comunicazione paracrina

o autocrina. Le classifichiamo per:

Origine Endosomiale/esosomiale

Dimensione Esosomi: 40-100nm;

Microvescicole: 100-1mm;

Corpi Apoptotici

Biogenesi Microvescicole —> Bledding

Esosomi —> ESCRT dip/indip

L’endosoma si forma per invaginazione, per endocitosi della

membrana plasmatica, formando l’endosoma precoce. Durante la

loro maturazione sviluppano delle invaginazioni intraluminari (ILVs)

della loro membrana seguita da scissione, formando vescicole

intraluminari all’interno dell’endosoma stesso, che è ora un

endosoma tardivo (corpo multi-vescicolare: MVBs).

Quando l’endosoma tardivo fonde la propria membrana con quella

della membrana plasmatica si ha il conseguente rilascio di queste

vescicole intraluminari nell’ambiente extracellulare. —> gli

esosomi sono ILVs formate dall’invaginazione della membrana dei

corpi multi-vescicolari derivati dagli endosomi precoci.

I meccanismi molecolari alla base del processo delle invaginazioni e

sintesi delle ILVs sono ESCRT dipendenti ed ESCRT indipendenti.

L’ESCRT è un complesso multiproteico, una serie si sub complessi, 0-

III, che agiscono in maniera sequenziale nel processo di invaginazione

nell’endosoma precoce per la formazione delle ILVs.

ESCRT-indipendente

c’è una prima fase di localizzazione a livello della membrana

plasmatica di tutte le proteine, componenti lipidici, proteine

transmembrana che debbano essere trasportati all’interno della

vescicola. Una seconda fase di traslocazione della molecola cargo in

queste regioni di zonazione.

Una terza fase ALIX permetterà l’invaginazione della membrana

dell’endosoma fino al rilascio all’interno del lume.

ESCRT-dipendente

ESCRT-0, raggruppa cargo transmembrana, presenti sulla membrana

endosomiale, con un meccanismo ubiquitina-dipendente in particolari

zone ristrette formando microdomini.

Questi microdomini fungono da docking-site per i successivi

complessi ESCRT I-II che consentono la formazione di una tensione a

livello del micro-dominio con conseguente invaginazione della

membrana stessa. Il complesso ESCRT-III catalizzerà la scissione

della membrana invaginata e il successivo rilascio delle ILVs a livello

intraluminare.

Grazie a studi di silenziamento con RNAi di varie subunità del

complesso ESCRT, è stata ipotizzata la possibilità dell’esistenza di

altri meccanismi molecolari per la formazione di esosomi di tipo

ESCRT indipendenti.

Inizialmente il primo complesso ad essere stato identificato come

regolatore del meccanismo è stato il complesso ESCRT.

E’ stato effettuato un silenziamento con RNAi di varie subunità del

complesso ESCRT, è stata ipotizzata la possibilità dell’esistenza di

altri meccanismi molecolari per la formazione di esosomi di tipo

ESCRT indipendenti.

Nel meccanismo ESCRT-indipendente, sappiamo che non c’è ESCRT

0, ma ci sono evidenze come la composizione in lipidi, ceramidi, e la

presenza delle tetraspanine e heat shock proteins, che risultano

importanti nel cluster di questi cargo e nella determinazione

soprattutto della curvatura della membrana e del rilascio poi.

Tra questi è stato identificato il meccanismo che utilizza la ceramide.

La ceramide è un lipide di membrana formato in conseguenza

dell’idrolisi catalizzata dall’enzima sfingomielinasi-2 su

substrato sfingomielina.

La struttura della ceramide nel doppio strato lipidico crea una

struttura rigida, una tensione passiva spontanea che porta alla

formazione dell’invaginazione della membrana endosomiale,

conseguente scissione e formazione delle ILVs.

Il meccanismo delle tetraspanine, che sono proteine con 4 domini

transmembrana, attraverso i quali interagiscono tra di loro,

raggruppandosi e creando microdomini che formano una tensione

che darà invaginazione, scissione e formazione delle ILVs.

Queste due tipologie di meccanismi non sono mutualmente esclusivi

ma cooperano con diversi equilibri alla formazione degli esosomi.

Dopo che la vescicola è stata rotta ci sono due destini:

– il rilascio del MVBs verso l’esterno

– esosomi degradati all’interno della cellula produttrice per

lisosomi o autofagia.

Nel caso in cui vengono rilasciate nell’ambiente extracellulare

targetteranno cellule bersaglio con specificità, data dalla

composizione di proteine di membrana, che hanno recettori

sulla superficie della cellula stessa e su cellula bersaglio.

L’ingresso della vescicola nella cellula bersaglio potrà avvenire

tramite riconoscimento ligando-recettore, tramite macro-endocitosi,

fagocitosi, ingresso caveola indipendente, fusione delle due

membrane fino a quando non ci sarà il rilascio del contenuto nel

citoplasma della cellula ricevente.

il sistema ESCRT dipendente è più coinvolto nell’indirizzare i corpi

multi-vescicolari al lisosoma; i sistemi ESCRT indipendenti sembra

siano coinvolti nell’indirizzamento alla membrana citoplasmatica e

quindi formazione degli esosomi. I meccanismi sono poco chiari.

Riconoscimento Cellula-Esosoma

interazione ligando-recettore, attraverso la presenza di

. proteine sulla superficie dell’esosoma che legano proteine

della membrana plasmatica della cellula target attivando un

pathway di trasduzione con una funzione a valle.

es: integrine che interagiscono con ICAM dell’esosoma, interazione

tra integrine cellula target ed esosoma che interagiscono

indirettamente grazie a componenti della matrice extracellulare

(collagene, fibronectina e componenti della matrice).

. endocitosi vescicola clatrina o caveola dipendente o

indipendente, qualsiasi sia la modalità diventerà una ILV

all’interno dei corpi multivescicolari. Da qui potrà in piccola

parte

rifondersi con la membrana citoplasmatica e riuscire fuori,

principalmente però essendo all’interno di un corpo multi-vescicolare,

potrà raggiungere il lisosoma della cellula target, essere degradato

come reservoir dei energia.

Marker Esosomi:

– ALIX + TC101: comuni, non determinano specificità,

biogenesi

– HSP

– Tetraspanine: CD63,CD,CD81 marker comuni

– marker specifici che dipendono per esempio da quale cellula

ha formato l’endosoma, dallo specifico contesto

fisiopatologico, dagli stimoli extracellulari ricevuti.

Nel laboratorio del professor Tripodi è stata identificato un motivo

hEXO, situato nella regione 3-terminale, extra-seed, riconosciuto

dall’RNA Binding protein SYNCRIP.

Questo meccanismo SYNCRIP dipendente è stato dimostrato

vedendo che mutagenizzando il dominio hEXO, SYNCRIP non era più

in grado di legare i micro-RNA e questi non venivano più caricati negli

esosomi. Viceversa, inserendo questo motivo hEXO in microRNA che

normalmente non erano legati da SYNCRIP, a questo punto venivano

legati e caricati nell’esosoma.

Metodi di separazione

Approccio terapeutico

lncRNA e Fegato

La transizione da cellula mesenchima a cellula epiteliale e viceversa è

controllata da un fattore di repressione SNAIL che reprime tutti i geni

epiteliali inducendo la mesenchimalità e HNF4 che invece è induttore

di epitelio e repressore di mesenchima.

-> SNAIL reprime HNF4 e HNF4 reprime SNAIL

Questi studi spiegano l’impatto sulla struttura della cromatina del

DNA, come l’epigenetica controlla la possibilità di questi eventi di

avvenire o non avvenire.

I microRNA, 21-23 nucleotidi, singolo filamento, con trascritti lunghi

ridotti da endonucleasi, sono parzialmente (intorno a 9 basi)

complementari ai messaggeri.

Se c’è complementarietà tra una regione del miRNA e un messaggero

nella regione 3’ UTR, il messaggero viene regolato, riguardo la

stabilità e la traducibilità e grazie alla regione 3’ UTR assume valenza

regolativa.

HNF4 (epitelio-epitelio) ha come target il miRs-29 che a sua volta

inibisce la funzione della DNMT3. L’assenza di HNF4 è n