Basi molecolari

Questi processi però sono separabili perché alcune cellule che possono

accrescersi senza dividersi

(es: oociti, cellule neuronali e muscolari) e cellule invece che si dividono senza

aumentare la loro

dimensione (es: l’uovo fecondato che si riduce man mano).

3. Duplicare i cromosomi

4. Separare i cromosomi tra le due cellule figlie

La divisione cellulare implica il trasferimento alle cellule figlie di

un'informazione genetica corretta,

non mutata, non modificata e ripartita correttamente dopo averla replicata.

*checkpoint ciclo

cellulare in cui la cellula stabilisce se la replicazione del DNA è avvenuta

correttamente nella fase

G2, e quindi è pronta per entrare in mitosi.

Livelli di controllo intrinseci del ciclo cellulare

Quando parliamo di controllo del ciclo cellulare parliamo di elementi di

regolatori intrinseci che

permettono di far proseguire il ciclo cellulare di fase in fase, assicurandosi che

si svolgano in

ordine e unidirezionalmente.

Il complesso cicline-CDK è la machinery che induce la cellula nel ciclo cellulare;

Le cicline cambiano

la loro espressione durante il ciclo cellulare e formano con le CDK il complesso

enzimatico

funzionale la cui attività è modulata durante il ciclo cellulare.Ripasso complessi:

G1 precoce: Ciclina D-CDK4/CDK6 seconda del

tipo cellulare

G1 terminale: Ciclina E-CDK2 +

S: Ciclina A-CDK2

M: Ciclina A-CDK1; Ciclina B-CDK1

complesso fondamentale per l'entrata nella

mitosi

Come abbiamo capito le funzioni di questi regolatori?

Dai più lontani esperimenti di fusione

nucleare, la formazione degli

eterocarionti (cellule con due nuclei) a

diverse fasi del ciclo cellulare.

Qui è mostrata la figura di una cellula

che entra in mitosi precocemente

dalla G1, G2 e dalla fase S e si dimostra

come queste fasi siano induttive, cioè

ci siano degli elementi nella fase

precedente che possono spingere la

fase successiva in avanti mentre i

nuclei G1 e G2 rimangono refrattari a

questa regolazione.

L'approccio loss of funcion e l'analisi

dei mutanti ha permesso di stabilire quali erano questi meccanismi.

E’ importante il complesso CiclinaB-CDK1 nella mitosi, e conosciamo anche i

target di questo

complesso che vengono attivati e disattivati in maniera temporalmente definita

che permette lo

svolgersi anche delle fasi della mitosi (e quindi della separazione dei cromatidi

fratelli, la

riformazione all'uscita della mitosi della membrana nucleare, il

disassemblaggio del fuso mitotico).

Meccanismi di Controllo dell’a7vità dei Complessi Ciclina/Cdk

Gli elementi che permettono la consecutività delle fasi in modo specifico e

unidirezionale sono

presenti e attive in tempi definiti e sequenziali, presenti solo in alcune fasi del

ciclo cellulare e altre

attive solo in una fase del ciclo cellulare à regolazioni sia temporali sia spaziali.

Controllo temporale

I complessi cyc/CDK sono attivati in maniera sequenziale per:

- L’espressione di alcune cicline in alcune fasi e altre cicline in altre

- L'espressione e l’attivazione anche in certe fasi del ciclo cellulare di altri

regolatoriimmagine: attività dei complessi nelle diverse fasi

regolata principalmente ma non solo dalle cicline.

Queste regolazioni sono sicuramente trascrizionali

inizialmente: quindi il mitogeno attiva, attraverso la

cascata di trasduzione del segnale, dei fattori

trascrizionali che up-regolano l’espressione genica

della CycD (sia attraverso dei fattori trascrizionali

ubiquitari, sia tessuto-specifici, questo perché la

versatilità delle cellule alla proliferazione cambia

a seconda del tipo cellulare)

La regolazione trascrizionale che inizia poi

diminuisce successivamente. il crollo

dell'espressione delle cicline è causato dalla

degradazione attraverso il proteasoma à i due complessi multiproteici di E3

ubiquitina ligasi

importanti nella fase G1S e G2M:

- Complesso SCF (Skp1/Cullin/f-box protein): riconosce le cicline della fase G1

che

possiedono la PEST sequence (Pro, Glu, Ser, Thr).

- Complesso APC/C (Anaphase-promoting Complex/ Cyclosome): riconosce le

cicline

mitotiche che hanno il destruction box

Complesso SCF

Complesso multiproteico con elementi per legare e

riconoscere il substrato costituito dalle proteine con F-box,

SKP1 e la cullina che fa da ponte.

Una porzione del complesso ha attività E2 E3-ligasi à

trasferimento dell’ubiquitina sul substrato che viene

riconosciuta come segnale di degradazione.

L’importante di questo complesso è che riconosce il

substrato in questo caso la ciclina (non solo, ci sono altre

CUL1: proteina scaffold

Skp1: recluta il substrato legato in modo specifico

dalla F-box protein

E2: uniqui9n coniuga9ng enzyme reclutato a<raverso

RBX1

molecole che vengono degradate durante il ciclo cellulare)

che è stata precedentemente fosforilata, tramite il gruppo

fosforico = il segnale con cui il substrato viene riconosciuto

dal complesso, ubiquitinato e poi degradato.

Spesso queste regolazioni sono determinate dai complessi

successivi perché in questo modo si controlla il feedback e

lo spegnimento della via precedente.Complesso APC/C

Il complesso APC/C riconosce le cicline mitotiche

attraverso il loro destruction box.

Il complesso contiene E3 ligasi che aggiungono alle

cicline e ad altre molecole l’ubiquitina per la

degradazione dal proteasoma.

Questo complesso contiene il ciclosoma, una molecola

di CDH1 o CDC20, a seconda della fase della mitosi che

serve ad attivare il complesso. Questo complesso

APC/C che ha una porzione catalitica e una porzione di

legame sia al ciclosoma sia al substrato prima deve

essere attivato:

• Da una precedente fosforilazione, che di solito

avviene dai complessi ciclina/cdk, nel

caso della mitosi dal complesso

ciclinaB/CDK1: quindi ogni meccanismo

iniziale prepara lo spegnimento del

segnale di sé stesso.

• Dalla presenza del ciclosoma

La ciclina è necessaria per attivare il complesso ciclina-cdk, ma non sufficiente:

servono modifiche

post-traduzionali della CDK che regolano il funzionamento del complesso à Il

complesso viene

mantenuto inattivo da due fosforilazioni su treonina e tirosina ad opera di più

chinasi, Wee1.

A. B. Quindi in questo caso c’è una fosforilazione inibitoria che blocca il

complesso ciclina-CDK

Per l’attivazione è necessaria una fosforilazione attivatoria a carico di un altro

residuo di

treonina da parte dell’enzima CAK 1 (complesso chinasico costituito dalla

ciclina H e CDK7)

C. La rimozione dei due residui fosforilati inibitori a carico della fosfatasi Cdc25

à questa

fosfatasi è presente in 3 forme A,B e C: la A è presente durante tutto il ciclo

cellulare

mentre la B e la C solo nella fase G2M)

A B C

Quindi riassumendo: serve la ciclina per formare il complesso, che però è

tenuto sotto

inattivazione da chinasi che fosforilano i due residui di treonina e tirosina; per

attivare il complesso

è necessaria l’azione di CAK1, che fosforila un’altra tirosina, e Cdc25 che

defosforila i primi due.Quando parliamo di check point dobbiamo considerare

che c’è anche una modulazione cdc25

perché per spegnere il complesso si possono: o ripristinare le fosforilazioni, o

inibire la cdc25

oppure perdere la ciclina.

Facciamo degli esempi:

1) Cellule di lievito mutate entrano prematuramente in fase M poiché si perde

l'inibizione di Wee1

oppure si ha un’attivazione costitutiva della CDK1 (o cdc2 sua equivalente in

lievito).

2) Mentre i mutanti che perdono la funzione della CDK1 non riescono ad

entrare in mitosi

Controllo spaziale

L'attivazione sequenziale è dovuta da: la trascrizione temporalmente definita

della ciclina,

l’attivazione del complesso in una fase definita del ciclo cellulare e che i

complessi cyc/CDK

vengono spazialmente distribuiti tra nucleo e citoplasma in modo da renderli

attivi o inattivi.

Esempio: la ciclina D1 up-regolata per prima durante l'entrata nel ciclo cellulare

forma il

complesso attivatorio nel nucleo con la sua CDK 4 o 6; poi la ciclina D1 rimane

presente durante il

ciclo cellulare, non ha un crollo di espressione, ma il complesso viene esportato

dal nucleo, quindi,

non è più funzionale à non c'è forte regolazione dell’espressione della ciclina

ma inattivazione del

complesso dovuta a delocalizzazione.

L'altro aspetto importante è che la ciclina B

viene sintetizzata prima dell’entrata in mitosi,

ma la formazione del complesso

ciclinaB/CDK1 non è ancora attivo, si attiva

quando il complesso entra nel nucleo.immagine di immunofluorescenza: la

ciclina è verde e il DNA blu, la ciclina

comincia a diventare nucleare solo

nella profase, all'inizio della mitosi,

poi il nucleo si dissolve, la membrana

nucleare la troviamo presente.

Nell’anafase, quando i cromosomi si

separano, il complesso deve essere

inattivato; quindi, la ciclina D viene

degradata e non è più visibile.

ciclina B ricombinante fusa alla GFP: in

G2 la ciclina è presente nel citoplasma,

ma poi diventa nucleare all’inizio della

mitosi. Successivamente subisce

modifiche post-traduzionali che

coprono un segnale di export per cui

viene mantenuta nel nucleo fino a

quando poi sarà degradata.

Non sono solo le cicline ed i complessi ad essere controllati spazialmente, ma

anche altre proteine,

per esempio la cdc25.

CDKIs: inibitori delle CDK

Un elemento importante nel controllo dello svolgimento del ciclo cellulare è

dato dagli inibitori del

ciclo che sono di due classi:

- INK 4 (inhibitors of CDK4): inibisce CDK4 e CDK6 àp16, P15, P18, P19

- Cip/Kip à p21, p27, p57

La differenza di funzione:

INK4 Cip/Kip

INK4 legano la chinasi e impediscono la

formazione del complesso con ciclina;

Cip/kip legano direttamente il complesso e lo

inibiscono;

agiscono nella prima fase del ciclo cellulare; possono agire in qualsiasi parte

del ciclo

cellulare

sono codificati in un locus genomico spesso

alterato; iper-metilato nei tumori perché la

i Cip/kip e in particolare p21, hanno

espressione nella cellula al livello basalemetilazione di questa regione

impedisce di

produrre p19, impedendo e l'attivazione di

P53 + P16 che bloccando i complessi CDK

blocca la regolazione di RB (con p53 è il

principale tumor-suppressor)

presente, mentre gli altri spesso vengono up-

regolati