Assorbimento e fissazione azoto

NO−

3 + NADH + H

+ −→ (NO2)

− + NAD+ + H2O (3.1)

Viene utilizzato alternativamente NADH o NADPH se ci troviamo rispet-

tivamente nel cloroplasto o nel plastidio.

La nitrato reduttasi utilizza NADH e NADPH nel citosol e NADH nelle

cellule verdi. L’enzima impiega 3 gruppi prostetici: un FAD, un citocromo

b557 e un complesso del molibdeno. È un omodimero che contiene questi

gruppi prostetici: il FAD lega all’estremità C-terminale il NADH, prende

un elettrone e lo passa all’eme e poi al complesso del molibdeno, che lega il

nitrato e lo riduce. È localizzata nel citoplasma delle cellule parenchimatiche

clorofilliane e delle cellule del rizoderma e del parenchima radicale. Nella

radice il donatore di elettroni è sia il NADH2 che il NADP H2.

Figura 3.13: Azione della nitrato reduttasi

La regolazione è fine e specifica, e regola anche l’enzima nitrito reduttasi

che converte il nitrito in ammonio: è inibito dalla fosforilazione e stimolato

dai livelli di nitrato (substrato).

La nitrito reduttasi catalizza la riduzione del nitrito ad ammonio con il

trasferimento di 6 elettroni, grazie alla ferridossina ridotta. La ferridossina

è un segnale di attività fotosintetica in corso e della presenza di equivalenti

riducenti e di scheletri carboniosi, sui quali l’azoto ridotto potrà essere incor-

porato nella sintesi degli amminoacidi: è ridotta quando la fotosintesi è attiva

(nella fase luminosa produce NADPH, che a sua volta riduce la ferridossina

e produce equivalenti riducenti).

Nei tessuti non fotosintetizzanti, la ferridossina viene rigenerata dal NAD-

PH proveniente dai pentoso fosfati. La ferridossina ridotta cede 6 elettroni

al nitrito −→si ottiene ammoniaca.

La struttura dell’enzima prevede la presenza di componenti in grado di

trasferire elettroni, come il F e2+: è presente un gruppo ferro-zolfo e un eme.

Gli elettroni vengono trasferiti al centro ferrozolfo, poi all’eme e infine al

nitrito con produzione di ammonio.

Figura 3.14: Azione della nitrito reduttasi

La nitrito riduttasi (64 KDa) catalizza la riduzione del nitrito ad ammo-

nio. È localizzata nei cloroplasti delle cellule del parenchima fogliare e nei pla-

stidi delle cellule della radice. Nei tessuti fotosintetici la Fd-ossidata viene ri-

dotta grazie al trasporto fotosintetico di elettroni. Nelle radici la Fd-ossidata

viene rigenerata dal NADPH prodotto dalla via dei pentosi fosfati.

Regolazione del processo La nitrato reduttasi è attivata dalla luce, dai

carboidrati e dal nitrato. L’ammonio, il buio e il glutammato la inibiscono.

Piante di pochi giorni deprivate di nitrato e poi esposte ad alti livelli di

nitrato mostrano un’iniziale assenza della nitrato reduttasi, poi un picco degli

mRNA di questo enzima, poi un calo per quanto riguarda la radice, in cui il

nitrato permane per un tempo breve, mentre resta costante nella foglia, dove

la fissazione del nitrato resta costante grazie al continuo apporto di nitrato

dallo xilema. Stessa cosa per la luce.

Fattori che fungono da attivatori hanno un effetto meno diretto sulla

sintesi dell’enzima, ma controllano l’attività dell’enzima stesso attraverso la

sua fosforilazione: quello che attiva la nitrato reduttasi promuove anche una

fosfatasi che defosforila dei residui di serina in prossimità del molibdeno;

fattori che inibiscono l’enzima attivano una chinasi che fosforila questi residui

di Ser. Questo tipo di controllo avviene anche negli mRNA ed è più rapido, a

seconda delle esigenze della pianta e della disponibilità del nitrato nel suolo.

La regolazione principale è proprio sulla nitrato reduttasi: la nitrito re-

duttasi è scarsamente oggetto di regolazione a livello della sua espressione o

della sua attivazione.

3.8.3 Assimilazione dell’ammoniaca: ciclo GS-GOGAT

La seconda metà del processo di assimilazione dell’azoto prevede l’incorpo-

razione dell’ammoniaca negli amminoacidi. La glutammina sintetasi (GS) e

la glutammato sintasi (GOGAT) sono gli enzimi chiave.

L’azoto ammoniacale viene legato ad un chetoacido con la formazione del-

l’aa corrispondente (intervengono le trasnaminasi). Inizialmente si pensava

che questa reazione fosse ad opera della glutammato deidrogenasi , che

(de)amina il glutammato, provocando la sintesi di α-chetoglutarato :

• Forma NADH dipendente nei mitocondri

• Forma NADPH dipendente nei cloroplasti

I ruoli specifici di queste GDH non sono ben chiari. Si pensa che possano

funzionare principalmente nel catabolismo del glutammato (deaminazione).

Ci sono problemi relativi a questo enizma:

• Ha affinità molto bassa per l’ammonio. Km tra i 5 e i 50 mM, è altissima

(concentrazioni non tossiche di NH4+ tra 0,2 ed 1 mM).

• Catalizza una reazione reversibile che può rilasciare ammonio −→enzima

non adatto a catalizzare la sintesi di Glu nelle piante.

La GS catalizza, a spese di un ATP, l’incorporazione dello ione ammonio

sul Glu: si forma glutammina. La glutammina, con l’α-chetoglutarato, è sub-

strato della GOGAT, che trasferisce il gruppo amminico all’α-chetoglutarato:

si formano 2 Glu (uno derivante dalla deaminazione della Gln e uno dall’am-

minazione dell’α-chetoglutarato).

La GOGAt impiega equivalenti riducenti derivati dal NADPH o dal NA-

DH o dalla ferridossina ridotta. Questi enzimi hanno varie isoforme nei tes-

suti. Alla fine, una molecola di Glu viene utilizzada dalla Gln per l’organi-

cazione di un’altra molecola di ammonio −→si produce un solo Glu.

La GS impiega ATP derivante dalla fotosintesi e richiede per l’attivazione

uno ione bivalente come mangesio o manganese o cobalto.

Figura 3.16: Ciclo GS-GOGAT

La struttura è complessa, in quanto costituita da 8 subunità identiche e

grandi. Le isoforme sono 2:

1. Plastidiale −→assimila l’azoto per la sintesi di aa per lo sviluppo locale

della radice; la forma clorosplastica ha la funzione legata all’assimilazioe

di un ammonio che deriva dalla fotorespirazione, processo tipico del

cloroplasto che utilizza ossigeno per bruciare il carbonio. L’ammonio

prodotto è tossico e quindi viene usato.

2. Citosolica →produzione di Gln per il trasporto a lunga distanza: viene

esportata nel floema e traslocata ai tessuti, a seconda della specie.

La GOGAT viene attivata dalla Gln, anche in basse concentrazioni. La

Km per l’ammonio è 10−5

. È formata da 8 subunità. La forma NADH-

GOGAT si trova nelle radici ed organica l’azoto per l’utilizzo in loco e per il

trasporto a lunga distanza.