Domande Farmacologia e farmacognosia

Domande farmacologia-farmacognosia

1. Il legame dei farmaci alle proteine plasmatiche

Il legame dei farmaci alle proteine plasmatiche è uno dei fattori che influenza maggiormente la distribuzione, l'eliminazione e l'interazione tra i farmaci. Infatti, agli equilibri caratteristici di questi processi interviene solo la quota di farmaco libero, per cui non legata a proteine plasmatiche.

La proteina plasmatica più importante è l’albumina, proteina globulare in grado di legare farmaci e molecole endogene e di trasportarle all’interno del sangue grazie alle costanti di associazione e dissociazione. È possibile comprendere qual è la quota di farmaco libero presente che può partecipare all’equilibrio di distribuzione. Infatti, maggiore è la costante di associazione, più facilmente si formerà il complesso proteina-farmaco, quindi minore sarà la quota di farmaco libero, mentre minore è la costante di associazione maggiore sarà la quota di farmaco libero. Invece, al contrario, maggiore sarà la costante di dissociazione, più facilmente il farmaco si staccherà dalla proteina, quindi maggiore sarà la quota di farmaco libero, mentre minore è la costante di dissociazione minore sarà la quota di farmaco libero.

L’albumina in condizioni fisiologiche è presente per 50g/l circa e quindi, poiché è presente in concentrazione limitata, una volta saturata non potrà più legare altro farmaco libero, ma raggiungere la saturazione con un farmaco è improbabile perché servirebbero concentrazioni eccessivamente elevate. Tuttavia, l’albumina ha affinità per diverse classi di molecole quindi può subire il fenomeno della competizione tale per cui all’albumina non si lega solo al farmaco somministrato, ma anche altre molecole quindi la quota di farmaco libero sarà maggiore perché la proteina non ha legato solo il farmaco considerato.

In condizioni normali la quota di farmaco che si lega all’albumina o ad altre proteine plasmatiche è del 90-99%, quindi solo una piccolissima parte risulta libera, ma in caso di co-somministrazione (esempio warfarin-aspirina) è possibile che la quota libera aumenti per il fenomeno della competizione e se si sta somministrando un farmaco con indice terapeutico ristretto questo può essere dannoso perché un’aumentata quota di farmaco libero può far sì che le concentrazioni risultino tossiche.

Non solo nel fenomeno dell’assorbimento è la quota di farmaco libera a partecipare agli equilibri, ma anche nel caso dell’eliminazione, solo la quota di farmaco libera può essere filtrata e quindi passare dalla circolazione sanguigna verso il lume del tubulo renale. Infatti, nei processi di filtrazione il farmaco legato a proteine plasmatiche come l’albumina non può essere eliminato per semplice filtrazione perché, a causa della selettività della barriera di filtrazione, le proteine plasmatiche non risultano affini al passaggio di tale barriera, quindi rimangono intrappolate a livello sanguigno.

Tuttavia, questo non implica che la quota di farmaco legato alle proteine plasmatiche non venga eliminato, ma significa che viene eliminato con un altro meccanismo, in particolare grazie al fenomeno della secrezione. Infatti, a livello dei tubuli renali sono presenti dei trasportatori specifici in grado di riconoscere i farmaci/molecole nel sangue e di trasportarli nel lume del tubulo; questo altera l’equilibrio tra forma libera e legata e fa sì che man mano il farmaco si dissoci dalla proteina e venga trasportato. Quindi, se i trasportatori per il farmaco sono presenti in quantità piuttosto elevate e questo meccanismo risulta rapido si può anche mediare una secrezione e una conseguente eliminazione completa del farmaco perché man mano che questo si stacca dalle proteine plasmatiche viene riconosciuto dai trasportatori. Bisogna però sottolineare che siccome il processo è reso possibile grazie alla presenza dei trasportatori, sarà influenzato dai fenomeni di saturazione e competizione.

Infatti, è possibile che il trasportatore riconosca due farmaci diversi, come la penicillina e il probenecid, ma solo uno dei due venga secreto quantitativamente e in questo caso è il probenecid perché compete positivamente con la penicillina. Quindi, la co-somministrazione probenecid-penicillina è un meccanismo per rallentare la velocità di eliminazione della penicillina grazie al fatto che al suo posto viene secreto il probenecid. Inoltre, quest’ultimo presenta anche trasportatori per il suo riassorbimento (dal tubulo al sangue) quindi non sono necessarie dosi elevate o somministrazioni successive ravvicinate di probenecid.

Inoltre, oltre al fenomeno della competizione vi è anche il fenomeno della saturazione. Infatti, a concentrazioni basse di farmaco si ha una cinetica di ordine 1 perché tutti i trasportatori risultano liberi per trasportare il farmaco in direzione della secrezione piuttosto che del riassorbimento, ma a concentrazioni elevate i trasportatori iniziano ad essere saturi e quindi a concentrazioni sempre maggiori si avrà una cinetica di ordine 0 dove la velocità di riassorbimento/secrezione risulta indipendente dalla concentrazione di farmaco.

È quindi l’equilibrio finale tra la secrezione il riassorbimento che determina quale sarà la quota di farmaco che viene effettivamente eliminata.

2. I recettori a sette domini transmembrana: caratteristiche e meccanismi di trasduzione del segnale

I recettori a 7 domini transmembrana sono una delle classi di proteine che è più rappresentata come bersaglio farmacologico, insieme a canali ionici, enzimi, trasportatori ed altri recettori. In particolare, i recettori a 7 domini transmembrana fanno parte dei recettori di membrana di tipo 2 e solitamente sono accoppiati a proteine eterotrimeriche, come la proteina G, oppure a small G protein (es: RAS). Questi recettori, come tutti i recettori di membrana, sono in grado di cogliere un segnale dall’esterno e di portarlo all’interno della cellula e generalmente l’attivazione di questi recettori porta all’attivazione di altre attività enzimatiche importanti per la trasduzione del segnale. Questo processo richiede solitamente qualche secondo.

I recettori a 7 domini transmembrana accoppiati a proteine G sono caratterizzati da un’unica catena polipeptidica che attraversa la membrana per 7 volte e che presenta l’estremità N-terminale all’esterno, responsabile del legame con il ligando, e l’estremità C-terminale all’interno della cellula che interagisce con la proteina G. A livello del terzo segmento transmembrana sono possibili delle mutazioni che possono causare un’attivazione costitutiva di recettori come quello per il TSH e l’LH, oppure mutazioni che causano un’inattivazione dei recettori come quello per la vasopressina.

La proteina G eterotrimerica è formata da 3 subunità (alfa, beta e gamma) ancorate alla membrana tramite ancore lipidiche dove la subunità alfa è quella con attività GTP-asica poiché in funzione del fatto che essa leghi GTP o GDP si ha l’attivazione o l’inattivazione della proteina stessa. Inoltre, esistono diverse subunità alfa come:

• As: promuove la sintesi di cAMP attivando l’adenilato ciclasi
• Ai: inibisce l’attivazione dell’adenilato ciclasi e quindi inibisce la produzione di cAMP
• Ao: inibisce l’attivazione dei canali per il calcio
• Aq/11: attiva la fosfolipasi C generando importanti secondi messaggeri come il diaglicerolo e l’inositolo 3-fosfato. Infatti, la fosfolipasi C, dal fosfatidilinositolo è in grado di formare DAG, che può attivare la protein chinasi C, e PIP3, che permette un aumento di calcio intracellulare.

Nel momento in cui la fosfolipasi C viene attivata e il DAG che si forma necessita di un aumento di calcio per poter attivare la protein chinasi C e questo è reso possibile dal secondo messaggero prodotto dalla fosfolipasi C che è il PIP3, che consente di attivare i canali per il calcio. Una volta che il calcio intracellulare ha aumentato le sue concentrazioni può legare la calmodulina, formando il complesso Ca-calmodulina che può andare ad attivare la protein chinasi C. Quest’ultima infatti idrolizza ATP e utilizza l’energia per fosforilare altre proteine.

Tuttavia, le subunità beta e gamma non hanno ruolo solo passivo ma esse possono andare a fosforilare alcune proteine, piuttosto che interagire con propri effettori, oppure possono attivare MAP chinasi o stimolare alcune fosfolipasi C.

Nel momento in cui il recettore lega il suo ligando esso subisce una modifica conformazionale che porta a modificare il terzo segmento transmembrana e l’estremità C-terminale, quindi il legame del ligando al recettore provoca l’attivazione del recettore stesso, ma anche un cambiamento conformazionale a livello della proteina G che si attiva. Infatti, con il recettore attivato la subunità alfa che legava il GDP ora lega il GTP e questo porta alla dissociazione delle subunità beta e gamma dalla subunità alfa. In questo modo la subunità alfa può andare a regolare l’attività di altri enzimi come l’adenilato ciclasi che viene attivato con l’interazione della subunità alfa-GTP e può sintetizzare cAMP e PPi (pirofosfato). Nel momento in cui la subunità alfa idrolizza il GTP a GDP torna nello stato inattivo e le subunità beta e gamma tornano ad associarsi. Il cAMP viene poi degradato a AMP grazie a una fosfodiesterasi e sono concentrazioni elevate di cAMP che attivano tale enzima, quindi è il cAMP stesso a esercitare un controllo di “contenimento” del suo stesso segnale.

Generalmente alle proteine G si trovano associate:

• Proteine attivatrici: in questo caso è proprio il recettore a 7 domini transmembrana essere il GEF, cioè la proteina che attiva la proteina G
• Proteine disattivartici: chiamate GAP

Il cAMP è molto importante perché permette di attivare i canali per il calcio e per il sodio, ma anche per attivare la PKA (protein chinasi cAMP dipendente). Tale chinasi è formata da due domini regolatori e due domini catalitici e a basse concentrazioni di cAMP questi due domini si trovano associati e l’enzima è inattivo. Infatti, in questo caso la subunità regolatoria, presentando uno pseudosubstrato privo di un OH fosforilabile, lega il sito attivo dei domini catalitici impedendo l’attività catalitica stessa. Tuttavia, nel momento in cui le concentrazioni di cAMP aumentano, due molecole di cAMP si legano ad ogni subunità regolatoria favorendo il distacco delle subunità regolatorie e delle subunità catalitiche, liberando quindi il sito catalitico che ora può riconoscere un OH di una serina, treonina o tirosina della sequenza segnale e fosforilarla.

Infatti, la chinasi è un enzima in grado di trasferire un gruppo P dall’ATP a un residuo OH di un amminoacido, fosforilando la proteina stessa e modificandone la sua attività. Questo ci fa capire che l’attivazione di un recettore accoppiato a proteine G porta ad un’amplificazione del segnale con possibilità di avere diversi punti di controllo prima di arrivare al prodotto finale. Infatti:

• Recettore attivato dal ligando attiva diverse proteine G
• Ogni proteina G, se presenta la subunità alfa s, attiva l’adenilato ciclasi che produce una serie di cAMP
• Ogni cAMP può andare ad attivare una chinasi che a sua volta può andare a regolare l’attività di altre proteine

Quindi, da un singolo ligando che ha legato il suo recettore il segnale si amplifica notevolmente grazie a questa cascata di eventi.

3. Interazioni farmaco-recettore: antagonisti reversibili e non reversibili; modulatori allosterici

Le interazioni tra farmaco e recettore possono essere molto diverse e per questo si avranno anche effetti diversi. Infatti, il farmaco può fungere da antagonista, cioè avere un’efficacia intrinseca uguale a zero perché quando si lega non dà nessuna attività biologica, ma il legame può essere reversibile o irreversibile.

Infatti, il farmaco può competere per il legame con l’agonista endogeno e quindi la competizione la vince la molecola che ha più affinità e/o è presente in quantità maggiore. In funzione di questo, se si lega un antagonista competitivo con legame reversibile è possibile scalzare l’antagonista aumentando notevolmente le concentrazioni di agonista endogeno in modo tale che l’antagonista si dissoci dal recettore e si leghi l’agonista endogeno. In questo modo, una volta che l’antagonista è stato scalzato, l’agonista avrà la stessa efficacia e potenza. Proprio per questo è molto importante andare a definire la Dose-ratio cioè la concentrazione di agonista endogeno affinché questo possa legarsi al suo recettore sia in presenza di antagonista che in sua assenza. Infatti, graficamente si ottiene che la concentrazione di agonista in assenza di antagonista è più bassa, quindi la curva è spostata sulla sinistra, mentre in presenza di antagonista le concentrazioni per raggiungere lo stesso effetto sono maggiori e quindi la curva è spostata sulla destra.

Invece, se il farmaco è un antagonista irreversibile, si lega al recettore in modo covalente e questo provoca il blocco permanente dell’attività del recettore senza possibilità di scalzare l’antagonista, quindi l’efficacia in questo caso diminuisce, perché non si riesce a raggiungere l’effetto massimo. Infine, nel caso di un modulatore allosterico esso si lega al sito allosterico, che è diverso dal sito attivo, quindi a mano a mano che il modulatore allosterico viene eliminato l’agonista può esercitare la sua attività biologica, ma nel momento in cui il modulatore è legato al recettore l’efficacia diminuisce.

4. Il fegato ed i processi di biotrasformazione e di eliminazione dei farmaci

Il fegato è l’organo maggiormente deputato ai meccanismi di biotrasformazione, ma non è l’unico, cioè quei meccanismi che consentono di rendere un farmaco maggiormente idrofilo (solitamente viene aggiunto un gruppo idrossile OH) in modo tale che questo possa essere eliminato a livello renale.

Tuttavia, le reazioni di biotrasformazione prevedono anche l’inattivazione di un principio attivo per modifiche chimiche, piuttosto che la formazione di molecole analoghe che presentano la stessa attività biologica oppure l’attivazione di un principio chimico per reazioni chimiche come nel caso dei profarmaci.

Tutte queste reazioni avvengono per l’appunto a livello del fegato, caratterizzato dal fatto che vi siano due vasi di entrata, l’uno che proviene dall’intestino e uno che proviene dal cuore, e un unico vaso di uscita, la vena porta che arriva a livello del cuore. Esso è caratterizzato da lobuli epatici a livello dei quali vi sono canicoli biliari dove vengono riversate sostanze che vanno a formare la bile che, dalla cistifellea, grazie a un dotto biliare comune arriva all’intestino. Il REL presenta un sistema ossidativo di citocromo P450 dipendenti, quegli enzimi deputati alla biotrasformazione di molecole e farmaci.

Le reazioni di biotrasformazioni che avvengono a livello epatico sono:

• Reazioni di fase 1: reazioni di ossidazione, riduzione ed idrolisi ad opera di diversi enzimi, tra cui il citocromo P450. Tali reazioni hanno lo scopo di aumentare l’idrofilia della molecola, solitamente con aggiunta di un gruppo idrossile, che però non sempre si nota nel prodotto finale.
• Reazioni di fase 2: reazioni di coniugazione che incrementano ulteriormente l’idrofilia della molecola. Queste reazioni possono avvenire su substrati già modificati da reazioni di fase 1 piuttosto che per aggiunta di piccole molecole. Reazioni di fase 1 e 2 non indica che necessariamente il farmaco/la molecola debba subire le reazioni di fase uno e solo successivamente quelle di fase 2. Infatti, alcuni farmaci subiscono esclusivamente o in maggioranza le reazioni di fase 2, mentre in altri casi la fase 1 è propedeutica a quella 2.

Le reazioni di fase 1 sono caratterizzate principalmente dall’ossidazione da parte di una classe enzimatica che è la citocromo P450 in grado per la maggior parte dei casi di idrossilare le molecole in modo tale che queste risultino più idrofile e maggiormente eliminabili. Questa classe prende il nome dal fatto che lo spettro di assorbimento presenti un picco a 450nm e che l’attività catalitica può essere inibita dal CO che può spiazzare l’O2. I citocromi P450 sono indicati dal prefisso “CYP” a cui segue un numero, che indica la famiglia (omologia al 40%), una lettera che indica la sottofamiglia (omologia 55%) e l’ultimo numero che indica le isoforme (le sequenze variano solo di alcuni amminoacidi). Tutti i citocromi dal punto di vista 3D risultano molto similari soprattutto per il core idrofobico in cui si inserisce il ferro. I citocromi P450 per essere attivati necessitano di NADPH che si ossida a NADP+ liberando equivalenti riducenti che permettono la riduzione della citocromo p450 reduttasi che, a sua volta, permette l’attivazione del citocromo P450 grazie al trasferimento di un elettrone che si riduce a Fe²⁺. In questo stato di ossidazione il ferro può legare l’ossigeno e tramite il passaggio di equivalenti riducenti si forma il farmaco idrossilato e liberazione di acqua che permette di far ripartire il circolo.

I citocromi P450 maggiormente importanti sono:

• CYP 3A4: metabolizza...