Domande Biologia Molecolare

ATTIVAZIONE DEGLI AMMINOACIDI

Per attivazione degli aa si intende l’attacco dell’aa con il tRNA corretto. Tutti i tRNA all’estremità 3’ presentano le stesse tre 2-regolazione genica procarioti

basi: CCA, con l’adenosina che rappresenta il bersaglio per il caricamento. L’aa viene aggiunto al tRNA mediante legame

esterico tra il suo gruppo COOH e il gruppo OH dell’adenosina. Il legame esterico è un legame energicamente sfavorito, per Una prima approssimativa regolazione dell’espressione genica dei procarioti la si ha a livello delle sequenze promotore.

ovviare a questo problema esiste l’ amminoaciltRNA-sintetasi che, essendo un enzima, riesce a scindere ATP per permettere Negli procarioti i promotori per l’RNApolimerasi sono abbastanza conservati, sono composti da 2 regioni esanucleotidiche -35

questo legame che, altrimenti, sarebbe impossibile. Il caricamento avviene in due passaggi: TTGACA e -10 TATAAT, questi rappresentano i promotori ideali, quelli cioè che meglio riconosce RNApolimerasi (fattore

1. aa+enzima+ATP  enzima-aa-AMP+2Ppi sigma), più le sequenze si somigliano a queste ideali maggiore sarà l’efficienza di trascrizione. In coli per esempio i geni che

2. enzima-aa-AMP+tRNA  aa-tRNA+enzima+AMP non devono essere particolarmente espressi hanno le sequenze promotori differenti da queste. L’RNApolimerasi tramite la

subunità alfa è in grado di riconoscere altre sequenze, se presenti, ricche di AT, dette sequunze UP, il cui riconoscimento Le DNA topoisomerasi sono enzimi che catalizzano cambiamenti nella topologia del DNA rompendo transitoriamente uno o

aumenta ulteriormente l’efficienza di trascrizione. entrambe i filamenti del DNA, facendo passare il filamento intatto attraverso l’interruzione e quindi risaldando quest’ultima. Le

Un’altra modalità di regolazione è legata al fattore sigma, subunità proteica molto importante per l’RNA polimerasi procariotica estremità generate dalla rottura non sono mai libere, ma sono manipolate esclusivamente entro i confini dell’enzima (sono

dal momento che stabilisce un’interazione stabile col filamento di DNA e riconosce il promotore. legate ad esso covalentemente). Le topoisomerasi agiscono sul DNA indipendentemente dalla sua sequenza.

Esistono diversi fattori sigma, sigma70 che si occupa dei geni che codificano per la gran parte delle proteine, sigma32 che si

occupa dei geni che codificano per proteine utili in uno shock termico, sigma28 riconosce promotori dei geni per le proteine 5

- Dna polimerasi batteriche

utili nella chemiotassi, sigma54 riconosce tutti i promotori dei geni x il metabolismo dell’azoto.

La vera e prorpia regolazione genica nei procarioti è controllata da geni regolatori, geni che codificano per le proteine la cui È un enzima specifico per la sintesi del dna usa templato di DNA e seguendo le regole di complementarietà delle basi riesce a

funzione è regolare l’espressione di altri geni. catalizzare la reazione di sintesi riconoscendo e scegliendo le corrette basi usando desossinucleotidi fosfato, polimerizzando

La regolazione può essere: progressivamente con attacco nucleofilo al 3’ oh ad alpha P del NTP con polarità chiaramente inversa rispetto al templato in

-positiva, utilizzata dai batteri ma solitamente è tipica defli eucarioti, nello stato basale il gene è inattivo; affinchè possa iniziare direzione sempre 5’-3’ necessita di un primer che le dia l’avvio( di 5/10 nucleotidi) con l’oh in 3’ pronto al legame.

la trascrizione sono necessarie delle proteine che si legano a sequenze a monte del promotore, non è sufficiente l’interazione Nei batteri sono presenti 3 tipi di polimerasi:

RNApol-DNA. Dna pol I è costituita da una singola catena di 109 kDa si presenta come un enzima notevolmente versatile oltre ad avere

-negativa, tipica dei batteri, nello stato basale il gene è attivo, cioè codifica per il proprio prodotto proteico, vi è però una un’attività dna polimerasica infatti possiede 2 attività esonucleasiche, separabili con tripsina; il frammento di Klenow di circa

proteina repressore, che ha come bersaglio l’operatore vicino al promotore che impedisce all’RNApolimerasi di iniziare la 70 kda dotato di attività di polimerizz e di pirofosfatasi con attività esonucleasica(correzione bozze, toglie i nucleotidi sbagliati

trascrizione. se ciò accade la pol I si ferma e usa l’attività 3’5’ per tornare indietro togliere il nucleotide sbagliato e continuare l’attività pol)

Un esempio di regolazione della trascrizione nei batteri è l’operon LAC: (l’attività 5’-3’ permette alla pol I di degradare il filamento di fronte alla poli in avanzamento così facendo può rimuovere e

sostiutire il filamento in un unico passaggio) e da un frammento piccolo. Può polimerizzare solamente frammenti di dna con

nicks non filamenti intatti. Si lega all’estremità 3’ del nick e inizia a polimerizz in direz 5’. Esegue attività di nick translation:

LacZ :codifica per la betagalòattosidasi, scinde galattosio in lattosio e glucosio. questo enzima per quanto riguarda attività esonucleasica ( per evitare errori di appaiamento) discrimina purine e pirimidine.

LacY :permeasi del lattosio, permette l’ingresso del lattosio dentro la cellula se presente nel terreno. Mutanti pol a= non è indispensabile anche se estremamente utile.

LacA :codifica per la transacetilasi. Dna pol II (pesa 80 kda) funziona bene nei dna con gap. È + processiva rimane legata per un tratto di basi > rispetto alla I .

P1 :sito CAP, punto in cui si lega la proteina CAP. non è in grado di eseguire nick translation e non lavora su dna cn nicks. Ha attività di gap-filling ovvero chiude i buchi se di

O : operatore, sito in cui si lega il repressore. lunghezza inferiore alle 100 pb. Non è indispensabile per replicazione

LacI : sintetizza il repressore, è il gene regolatore, non fa parte dell’operone Lac. Dna pol III indispensabile per la sopravvivenza. È un coenzima formato da due diverse sub. La piu impo è la subunità alfa, è

-In presenza di glucosio, poco lattosio viene bloccata la trascrizione dei geni dal repressore che si lega all’operatore perché le la piu’ grande ed essa è la sede dell’attività polimerasica. La sub A fnziona male in vitro se come substrato viene usato DNA

cellule preferiscono il glucosio come fonte energetica, perché è più efficiente. lacI produce il repressore che si lega all’operone con gaps e non funziona del tutto se come substrato si usa SS DNA e primer, ma in condizioni fisiologiche ovvero legato alle

e blocca la trascrizione. altre sub minori lavora 10 volte + velocemente rispetto alla dna pol I. Le altre subunità minori sono epsilon (ε) con attività di

-In presenza sia di glucosio che lattosio, non c’e il repressore LAC perché viene prodotto da LacI solo in assenza di lattosio, proofreading, teta (Θ) che ha attività di assemblaggio alfa+epsilon+ Θ per dare un core polimerasico, beta’ fattore che

anche l’attivatore CAP è inattiva perché ha bisogno di legarsi a C-amp (indice di poco glucosio) per attivarsi. La trascrizione permette di utilizzare DDNA come sub, fattori ausiliari gamma, delta. Essa sintetizza solo in modo continuo in direzione 5’-3’.

dei geni avviene con una bassa efficienza di trascrizione. Il filamento 3’-5’ è detto lagging e su esso la pol III genera i frammenti di okazaki. si è scoperto invece che essa è

-In mancanza di glucosio, in presenza di lattosio, l’allolattosio si lega al repressore e lo stacco dall’operatore, C-amp indispensabile per la sopravvivenza della cellula. Essa è costituita da 4/8 proteine; la subunità  è la più grande ed è la sede

interagisce con CAP, cambia la sua conformazione, si lega al sito CAP e attiva la trascrizione dei geni per l’utilizzo del lattosio. dell’attività polimerasica. Tuttavia per avere una corretta velocità di sintesi sono necessarie anche le altre subunità. La

DNApol III, una volta attaccata al DNA, è molto processiva e prosegue la sua attività per milioni di basi; essa forma sul DNA

3-sintesi e maturazione del tRNA una specie di struttura a doppia C invertita. In ciascuna forca replicativa sono presenti due diverse polimerasi III che allungano

ciascuno dei due filamenti. Siccome la DNApol sintetizza soltanto in direzione 5’-3’, un filamento sarà continuo (filamento

TRNA = molecole piccole conservate che presentano molte basi modificate nella zona adiacente all’anticodone. La struttura leading) mentre l’altro sarà sintetizzato per filamenti successivi detti frammenti di Okazaki (circa 1000-1200 pb) (filamento

dei trna è formata da 3 bracci che terminano in anse, il braccio della psudoipouridina, il braccio della diidrouridina, e il braccio lagging). Su questi ultimi filamenti torna a giocare un ruolo molto importante la DNApolI che con il suo Nick Translation

dell’anticodone + un piccolo braccio extra formato da 10pb e dal sito accettore a cui si legherà l’aa corretto. rimuove i primers di RNA permettendo alla DNAligasi di saldare le estremità di DNA.

la sintesi e la maturazione del tRNA è diversa tra procarioti ed eucarioti.

-PROCARIOTI: i geni che codificano per il tRNA si trovano all’interno di operoni (sequenze codificanti per più segmenti genici

che sono controllati da un unico promotore). Questi operoni vengono chiamati rrm(A-G), la lettera indica quali dei 7 operoni Dna polimerasi negli eucarioti

per il tRNA stiamo parlando. Ad esempio in coli rrmC rappresenta l’unico operone che porta il tRNA per il triptofano, una

mutazione su questo gene potrebbe essere infatti deleteria. Esistono 3 diverse DNa polimerasi eucariotiche: α,β,γ. Queste sono presenti a diverse concentrazioni nelle varie fasi della vita

Questi geni possono essere di 2 tipi: cellulare, la α pol è legata alla proliferazione dei tessuti, la β nei processi di riparo e la gamma è presente soprattutto nei

1-se hanno già la sequenza CCA in 3’ (espressi dal gene di tipo 1) mitocondri.

2-se non hanno la sequenza CCA in 3’, (espressi dal gene di tipo 2) tutti i geni per i tRNA umani sono di questo tipo. La prima ad essere scoperta è stata la alfa che copre 80/90% di tutta l’attività polimerasica tot di solito è associata ad altre

Il sistema di maturazione è composto da ribonucleasi, enzimi che tagliano l’RNA all’interno della sequenza codificante. Il proteine che hanno attività diversa come l’attività primasica e/o esonucleasica 3’5’ e 53’ con un complesso formato da 4

trascritto primario dell’operone è l’RNA 30S, il primo enzima che interviene è la ribonucleasi P, ha attività endonucleasica e polip