Domande esame Farmacologia applicata

1. Principio delle 3R: in Italia si ha un’osservazione stretta di questa norma

Secondo la normativa, le ricerche che coinvolgono animali da laboratorio devono rispettare il

principio delle 3R (Replace, Reduce, Refine) e questo stabilisce che per ogni sperimentazione che

preveda l’utilizzo dei modelli animali, il ricercatore è tenuto ad indicare:

A. Se è disponibile un metodo alternativo per sostituire (REPLACE) gli esperimenti con gli

animalià se lo stesso esperimento può essere condotto in vitro con la stessa validità ed

efficienza ed affidabilità del risultato.

B. Come intendono ridurre (REDUCE) al minimo il numero di animali, qualora siano

comunque obbligati a utilizzarlià effettuare degli studi di statistica in modo da calcolare

precisamente il numero minimo di animali necessari per ottenere dei dati sperimentali

adeguati. Se utilizzo meno animali si otterrà un dato che non sarà statisticamente

rilevante, ma si ottiene solo una tendenza. Utilizzando questi appropriati test statistici si

ottiene il numero di animali necessario per ottenere un risultato che abbia una validità

statisticamente significativa.

C. Come hanno previsto di migliorare (REFINE) le condizioni degli animali, minimizzando lo

stress e il doloreà durante tutto il processo i ricercatori devono fare in modo che siano

utilizzate tutte le procedure che possono minimizzare lo stress e il dolore e qualsiasi altra

sofferenza per gli animali a scopo di ricerca.

Le 3R devono essere tutte soddisfatte e in questo ordine: il Replace attualmente non è possibile da

soddisfare, il Reduce è soddisfabile tenendo conto che il numero minimo di animali da scegliere è

quello che fornisce una risposta e il Refine è sempre rispettato perché è interesse del ricercatore

indurre minor sofferenza possibile per avere un dato che sia credibile e riproducibile.

Quello che tutti i ricercatori devono fare prima di pensare di utilizzare un animale è:

a. Presentare un progetto di ricerca all’organismo preposto al benessere degli animali che

valuterà tutti gli aspetti relativi alla normativa, compreso il fatto che il progetto segua

tutte le regole delle 3R, e in caso chiederà al ricercatore di fare tutte le modifiche per

rendere il progetto adeguato alla normativa;

b. Il progetto sarà poi inviato al Ministero della Salute che è l’organo deputato in Italia a

dare l’autorizzazione finale a procedere alla sperimentazione animale.

In Italia il processo di utilizzo di un animale a scopo sperimentale è particolarmente difficile e

complesso, soprattutto in paragone con il resto dell’Europa e del mondo, nel senso che la normativa

italiana è una delle più stringenti e complesse e prevede questo doppio passaggio: il ricercatore

deve scrivere un progetto, presentarlo all’OPBA locale, ottenere l’approvazione e mandarlo al

Ministeroà dal momento in cui un ricercatore stabilisce un progetto di ricerca al momento in cui

viene autorizzato passano almeno 4-6 mesi.

2. Modelli animali contingenti e non contingenti dell'abuso di sostanze

I modelli animali (roditori) sono molto efficaci per lo studio delle dipendenze. Esistono due

meccanismi di somministrazione di sostanze nei modelli animali:

• Contingente: l’animale si autosomministra la sostanzaà l’animale deve eseguire un

comportamento (come premere una leva) per ottenere una sostanza e quindi avere una

gratificazione.

• Non contingente: l’operatore somministra la sostanza all’animaleà l’animale riceve la

sostanza, ottiene la gratificazione.

I due meccanismi sono differenziati sulla base della somministrazione della sostanza. Il modello

contingente è più simile al comportamento umano ma è utile comunque studiare anche il modello

non contingente.

Se la sostanza è la cocaina (stimolanteà aumento sinaptico della dopamina) l’animale riceve una

gratificazione sia se la riceve in modo contingente che non contingente. Nel caso di

somministrazione contingente l’animale associa un comportamento alla gratificazione: preme la

leva e ottiene la sostanza.

CONTINGENTE

Self Administration Paradigm

L’animale si auto-somministra la sostanza. Il topo viene messo in una gabbia che ha dei dispositivi

che una volta azionati gli danno una ricompensa. Quando si accendono le luci le due leve diventano

disponibili, una attiva (con la cocaina) e una no. L’animale riceve dirittamente in vena la sostanza

attraverso un catetere inserito nella giugulare.

1. Primo giorno arriva una dose da 0.5mg di cocainaà in 3 ore preme la leva 50 volte=25mg

2. Secondo giorno aumenti la dose a 1mgà animale preme 27 volte=27mg

3. Terzo giorno somministrazione di 0,25mgà animale preme 98 volte=24,5mg

Con questo test si possono studiare gli adattamenti indotti dalla sostanza come:

A. Escalation of cravingà animale che viene trattato per un periodo breve con la sostanza è

diverso da quando viene trattato per un lungo periodo. Nel short access di 1h l’animale segue

un pattern di somministrazione preciso e limitato, nel long access di 6h l’animale continua a

premere la leva perdendo il controllo sul dosaggio della sostanza

B. Drug seekingà valutazione di quanto si ricerca la sostanza. Le leve sono entrambe inattive,

si misura quante volte l’animale preme le leve nella speranza di ottenere la sostanza

C. Extinction trainingà il giorno dopo l’animale viene messo nella gabbia e prema la leva ma

non esce la sostanza. Si continua per 10 giorni o più, con il passare del tempo l’animale

estingue il comportamento.

D. Reinstatment testà si può modellare l’animale in lab

Yoked-operant model

Gabbia con due leve di cui una attiva e una inattiva. L’animale ‘’attivo’’ associa una leva alla

gratificazione e continua a premerla. Accanto a questa, c’è una seconda gabbia contenente un topo

‘’passivo’’ con entrambe le leve inattive; quando l’animale “attivo” preme la leva, al topo “passivo”

arriva la dose ma non capisce perché. Accanto a queste due gabbie ce n’è una terza con l’animale

controllo che quando l’animale “attivo” preme la leva, riceve una dose di salina.

Nel ratto attivo è possibile studiare come l’animale sia in grado di associare un comportamento

operante all’assunzione della sostanza mentre nel ratto passivo si può studiare l’effetto

farmacologico puro della sostanza stessa.

Ad esempio, se si scopre che una proteina è aumentata sia nell’animale attivo che nell’animale

passivo ma non in quello controllo, è possibile associare quell’aumento all’assunzione della sostanza

(puro effetto farmacologico). Se l’aumento della proteina (effetto) si osserva solo in una

determinata area cerebrale dell’animale attivo e non dell’animale passivo, si scopre che c’è

sicuramente una componente legata alla sostanza ma anche all’associazione tra il comportamento

e l’ottenimento della sostanza.

Mediante questo modello diventa possibile differenziare l’effetto di motivazione della ricerca della

sostanza ed il puro effetto farmacologico della sostanza.

NON CONTINGENTE

Conditioned Place Preference CPP

L’animale viene messo in una gabbia divisa in due parti diverse che possono essere isolate. Questo

test viene condotto in diverse fasi:

1. Pre-conditioning (15 minuti)à l’animale si muove liberamente da un compartimento

all’altro e può posizionarsi anche in mezzo; è un periodo di esplorazione della gabbia e

avviene in assenza di sostanza. Questa fase è utile per capire se l’animale ha preferenze per

uno dei due compartimenti: in questo caso, l’animale non potrà prendere parte

all’esperimento perché ha già una preferenza che non è indotta dalla sostanza.

La tempistica di permanenza nelle due parti della gabbia non deve essere significativamente

diversa: l’animale deve rimanere per un tempo molto simile nei due compartimenti.

2. Conditioning (8 giorni)à ogni giorno l’animale viene messo per 40 minuti in un

compartimento oppure nell’altro (alternati): quindi sarà 4 giorni in un compartimento e 4

giorni nell’altro. Durante questa fase, si associa ad uno dei due compartimenti la

somministrazione di cocaina: l’animale riceve la somministrazione di cocaina quindi una

gratificazione in un compartimento specifico mentre nell’altro riceve la somministrazione di

salina. L’animale va incontro quindi ad iniezioni alternate di salina e cocaina: la

somministrazione non è contingente, è l’operatore che fa la somministrazione

intraperitoneale di sostanza. L’animale in questa fase associa una situazione di piacere ad un

compartimento e una situazione neutra all’altro compartimento.

3. Test session (15 minuti)à Vengono aperti i compartimenti della gabbia, l’animale viene

messo al centro e può esplorare per 15 minuti la gabbia. Il test viene eseguito in assenza di

sostanza. L’animale si dirige verso il compartimento al quale ha associato una sensazione di

gratificazione e si posizionerà lì ad aspettare l’iniezione di cocaina.

L’esperimento misura gli effetti rinforzanti della sostanza; infatti, se si somministrasse una sostanza

che provoca avversione, l’animale rimarrebbe nel compartimento senza sostanza.

È un test molto semplice, dinamico e che permette di studiare sostanze sia piacevoli che avversive.

3. Frazionamento bioguidato e fitocomplessi: significato e utilità

Il frazionamento bioguidato è un sistema che mi permette, partendo da una pianta, di frazionarne i

componenti, sulla base dell’attività biologica, e di determinarne l’attività.

Gli aspetti positivi sulla ricerca di nuovi farmaci provenienti dal mondo vegetale sono:

Ampia fonte di piante ancora da studiare

o Possibilità di brevettare il metodo di estrazione e l’uso

o Possibilità di utilizzare il fitocomplesso, minimizzando gli effetti collaterali

o

Gli aspetti negativi:

Intenso lavoro: può durare tantissimi anni e non dare nulla

o Nessuna garanzia di arrivare ad un lead compound (sintesi di analoghi e derivati): molte volte

o frazionando l’estratto si fraziona l’attività.

La farmacologia è nata dalla farmacognosia. Solo l’1% delle piante ha un solo principio attivo e

l’azione sinergica tra i vari componenti può essere tale che eliminando un solo componente si può

avere un effetto opposto. Mentre si estrae bisogna verificare continuamente l’attività biologica.

Uno dei concetti basilari dei prodotti naturali è il fitocomplesso: generalmente, non viene usata una

molecola pura anche se esistono situazioni in cui può accadere, come nel caso della berberina (usata

da sola, purificata). Ciononostante, nel concetto alla base della fitoterapia e della farmacognosia,

ciò che realmente svolge l’attività farmacologica è il fitocomplesso, ovvero, una miscela complessa

di prodotti. All’interno della miscela si distinguono:

• Principi attivi primarià sono principalmente responsabili degli effetti e determinano

l’attività farmacologica del fitocomplesso.

• Principi attivi secondarià sono comunque attivi ma la loro efficacia è minore rispetto ai

principi attivi primari.

• Composti non attivi ma che influenzano l’attività farmacologica dei principi attivi sia primari

che secondarià di per sé non presenterebbero l’attività farmacologica propria dei principi

attivi ma influenzano e coadiuvano l’azione dei principi attivi. Ad esempio, possono

influenzare la biodisponibilità dei principi attivi (renderli più facilmente disponibili,

assorbibili).

Una pianta può contenere più fitocomplessi, questi si isolano in base alla parte di pianta utilizzata.

Il frazionamento bioguidato prevede anche che, man mano che si fraziona, si abbia un aumento

dell’attività biologica, poiché si ha una concentrazione delle molecole con attività biologica

Un esempio di malattia che si può curare con farmaci ottenuti in seguito a frazionamento bioguidato

è la malaria, ovvero una parassitosi causata dai protozoi del genere Plasmodium e trasmessa

all’uomo dalla zanzara femmina.

Il plasmodio infetta l’uomo ed entra nel globulo rosso, portando l’Hb nel suo vacuolo digestivo e la

scinde in:

• EME: è tossico quindi viene convertito in emozoina. Se si blocca questa conversione il

plasmodio muore per aumento dell’eme.

• GLOBINA: viene scissa da parte di proteasi chiamate plasmepsine (acido aspartico proteasi)

e poi in singoli aa che servono al plasmodio per costruire le sue proteine. L’inibizione di

queste proteasi quindi è un altro target per i farmaci.

La pianta su cui si è fatto il frazionamento bioguidato è la Tristaniopsis calobuxus attiva contro il

plasmodio sia su ceppi sensibili che non.

1) Prima dell’estrazione vera e propria si elimina la componente lipidica con ETERE DI PETROLIO

2) Estrazione con METANOLO in cui si mette in agitazione per 24h fino ad ottenere l’ESTRATTO

GREZZO

3) Si porta a secco l’estratto con un evaporatore. Da qui si ottengono 3 estratti:

A. Si estrae con ACQUA ottenendo l’estratto acquoso con tutto ciò che è solubile in

acqua

B. Si estrae con ETIL ACETATO, polare (qui si riscontra l’attività più alta)

C. Si estrae con CLORURO DI METILENE, apolare

Dall’estratto di etilacetato ottengono 214 frazioni. Alla fine, il frazionamento ha portato

all’individuazione di due molecole ad attività antimalarica:

• ACIDO ELLAGICOà ha attività maggiore perché oltre ad inibire l’acido aspartico proteasi

inibisce anche la conversione dell’eme in emozoina. Aumentando la polarità aggiungendo

OH si ha un aumento dell’attività. Risulta essere molto attivo soprattutto per via peritoneale.

• TMFGGà quantità molto basse nella pianta e quindi si produce per semi-sintesi. Inibisce

l’acido aspartico proteasi.

4. Vantaggi delle tecniche di imaging

CRAVING

Secondo il DSM-5, il craving è il desiderio intenso o irresistibile per la sostanza (urge for the drug)

che può verificarsi in qualsiasi momento ma più probabilmente in un ambiente dove questa veniva

usata in precedenza. Il craving è l’unico item che può rimanere soddisfatto anche nelle condizioni di

remissione precoce/protratta. La misurazione puntuale e continua del craving attuale può essere

utilizzato come una misura dell’esito del trattamento (outcome) e come segnale di imminente

ricaduta.

Il Neuroimaging aiuta a mappare il craving: giro del cingolo e corteccia orbitofrontale attivati

durante un’intervista sul tema “sostanze d’abuso”. Nell’immagine è evidente l’attivazione

orbitofrontale in consumatori di cocaina durante una intervista su un tema neutro (in alto) e durante

una intervista riguardante cocaina (in basso).

Il Neuroimaging aiuta a mappare il craving: il Nucleus Accumbens si attiva anche solo per

l’anticipazione della ricompensa da gioco/sostanza.

EFFETTI DELLE DROGHE D’ABUSO

L’immagine mostra il cervello di un individuo normale in paragone al cervello di un individuo che ha

utilizzato cocaina per 10 giorni e dopo 100 giorni dall’ultimo utilizzo. Quello che si è misurato (zona

gialla) è la capacità dell’individuo di utilizzare fluoro-desossi-glucosio, somministrato agli individui

per svolgere le proprie attività cognitive: si osserva una differenza molto marcata nella capacità di

usare il glucosio per fare ATP e dare energia alle cellule cerebrali, cosa che è quasi scomparsa

nell’individuo che abusa di sostanze e che sta riprendendosi solo dopo 3 mesi che l’individuo ha

terminato l’abuso di cocainaà questo è il cervello di una persona malata sia nel breve che nel lungo

termine. Questo dimostra che i cambiamenti che sono indotti anche acutamente da queste sostanze

sono cambiamenti rapidi ma che poi persistono nel tempo e spesso il cervello non recupera

completamente come era precedentemente.

L’immagine mostra uno spaccato della corteccia cerebrale prima e dopo abuso cronico di ecstasy

(sostanza allucinogena). Dopo esposizione cronica si ha la morte dei neuroni, dei quali ne

sopravvivino molti pochi che non fanno contatti tra di loro. Solo dopo 7 anni la situazione comincia

a ripristinarsi, ma è comunque molto diversa rispetto alla normalità: ci sono meno cellule neuronali

e bisogna controllare che i neuroni siano ubicati nei layer corretti (se il neurone deve essere nel

layer 1 dove svolge determinate funzioni e l’esposizione alla sostanza ha provocato non solo la

morte ma anche la migrazione verso un layer diverso, si contano dei neuroni, che possono dare

l’idea che il sistema ha recuperato, ma in realtà questi neuroni non sono funzionali).

Queste sostanze possono causare degli effetti anche quando sono assenti per via della sindrome di

astinenza. L’immagine mostra il cervello di un individuo che ha abusato in maniera persistente e

ripetuta di cocaina e viene messo di fronte a due video: uno con immagini naturali e un altro con

immagini che ricordano la cocaina. Durante la visione di questi filmanti si analizza l’amigdala (area

che gestisce la sfera delle emozioni): quando l’individuo guarda il video di eventi naturali l’amigdala

è dormiente, quando invece guarda il video che ricorda la cocaina, si osserva una iperattivazione dei

neuroni a livello dell’amigdalaà pur in assenza della sostanza, non appena c’è un qualcosa che la

ricorda, l’individuo risponde da un punto di vista emozionaleà queste sost