Appunti di laboratorio (teoria + pratica) + domande d'esame e alcuni esercizi svolti

Biomolecolari

Subclonaggio= trasferimento di un frammento di DNA (genomico o prodotto di PCR sintetizzato) /cDNA (derivante da RNA) ed

inserirlo in un plasmide (vettore adatto all’utilizzo, che può essere l’amplificazione in un ospite batterico o l’espressione di un prodotto

di interesse in un ospite batterico, come E. coli): creare una molecola di DNA ricombinante di interesse.

Isolato attraverso una reazione con enzimi di restrizione + eventuali trattamenti aggiuntivi.

Le 2 molecole possono essere unite tramite una ligazione.

Caratteristiche di base del plasmide:

-​ DNA circolare

-​ può essere duplicato autonomamente

-​ contiene di base: un'origine di replicazione, un marcatore selezionabile (conferisce una proprietà selezionabile, es:

resistenza ad antibiotico)

Il plasmide deve prima essere trattato in modo da generare estremità compatibili con quelle del frammento per potersivi appaiare.

Procedimento:

1.​ Allestire una miscela di ligazione: vettore + inserto (volumi noti), facendo attenzione al rapporto molare tra le 2 componenti;

soprattutto se queste sono stati trattate con un unico enzima di restrizione, perché avendo estremità compatibili, il

plasmide potrebbe circolarizzare= richiudersi a rigenerare il plasmide originario anziché ricombinare (reazione

intramolecolare favorita rispetto reazione intermolecolare).

Per impedire questa reazione si potrebbe mettere tanto inserto, ma ciò è sconsigliato dal momento che potrebbe creare dei

concatameri: molecole in cui l’inserto si appaia con altri inserti; il rapporto più favorevole per ottenere il prodotto

desiderato è 3:5 molecole di inserto per ogni molecola di vettore (mol).

Come si fa a dosare questa proporzione? le molecole di DNA sono eterogenee per composizione e dimensione e per questo

hanno pesi molecolari diversi.

Per trasformare un rapporto molare a nanogrammi utilizzare il PM delle basi (lunghezza inserto: 660 bp= ng/nmol)

� / 660 ��

→

� �

� � = =

� /660 �

Il rapporto tra i PM dipende solamente dal peso delle molecole, quindi 660 bp si può eliminare, si ottiene:

��

= · ( )

�

�

La soluzione della reazione di ligazione non deve avere un volume troppo elevato (max 20µl).

Le cellule competenti vengono rese tali attraverso un trattamento e poi vengono congelate in un dato volume; nel momento un cui

vengono scongelate sono molto delicate, per cui non è possibile pipettarle o aliquotarle, ma si deve aggiungere un volume che non sia

rilevante rispetto al volume delle cellule stesse.

Per impedire al vettore di richiudersi: la ligasi è in grado di ricostituisce i ponti fosfodiesterici (sfruttando l’energia derivante dal

consumo di atp), utilizzando il fosfato che si trova sull'estremità 5’. Tutti gli enzimi di restrizione quando tagliando lasciano il fosfato

sull'estremità 5’ e un -OH libero sull’estremità 3’. Per impedire la reazione basta quindi defosforilare l’estremità 5’ con una fosfatasi

alcalina (enzima extracellulare che E. coli secerne nel mezzo di coltura quando c’è carenza di fosfato). Il vettori così trattato non sarà

più substrato della DNA ligasi ma in presenza dell’inserto questo fornirà i fosfati e la ligasi potrà ricostituire i ponti fosfodiesterici.

La molecola avrà 2 nick all’estremità dell’inserto, sui 2 filamenti, tuttavia questi saranno appaiati per tutta la lunghezza dell'inserto

quindi risultano essere molto resistenti. E. coli tratterà i nick come un danno al DNA.

I plasmidi che usiamo in laboratorio sono della serie pGEM, che possono operare uno screening sulle molecole ricombinanti grazie ad

un frammento (l’inizio) del gene LacZ’ sul vettore (gene di coli che codifica per un frammento N-terminale della -galattosidasi,

chiamato Questo viene utilizzato in ceppi di E. coli difettivi del gene LacZ, cioè che hanno una delezione a livello del DNA

ⲁ-peptide).

genomico per cui il gene LacZ produce una che non ha l’ⲁ-peptide, denominata e non ha attività

ѡ-peptide

-galattosidasi

-galattosidasica.

L'a-peptide e l'ѡ-peptide sono in grado di riassociarsi e complementare in trans il difetto di attività.

I batteri vengono piastrati su terreno selettivo con Ampicillina e X-gal, un substrato cromogenico della Batteri non

-galattosidasi.

trasformati non sopravvivono sull'ampicillina, batteri trasformati con il vettore senza inserto (plasmide originale) daranno colonie blu

perché producono l'a-peptide; batteri trasformati con il vettore ricombinante, cioè che ha incorporato l'inserto, non produrranno l'

a-peptide perché il gene LacZ' è stato distrutto dall'incorporazione dell'inserto e quindi produrranno colonie non colorate.

Al terreno viene aggiunto anche l’induttore gratuito IPTG per permettere la produzione dell’ѡ-peptide da parte dell’operone Lac nel

genoma dell'ospite. Le molecole, vengono fornite già purificate ma normalmente devono essere ripulite, cioè isolate da ogni DNA

contaminante, ma anche dal mezzo di reazione in cui si trovano.

La ligasi è sensibilissima a minime concentrazioni di Mg2+, quindi va controllata perfettamente, non ci devono essere contaminazioni

di magnesio o di EDTA che è un chelante dei cationi bivalenti e quindi ha un'alta affinità per il magnesio, dentro le soluzioni

dell’inserto e del vettore, che devono essere in acqua ultra-pura (unica specie molecolare sospesa in H 0).

2

Come si ottiene questa purificazione? Elettroforesi su gel (che consente di separare in base al PM) con successiva purificazione su

colonna (trattiene solo frammenti di DNA linearizzati, interagendo con i fosfati delle estremità, elimina anche l’agarosio, anche se non

completamente). Oppure un altro metodo, più efficace è la purificazione con resina in petch?. Una volta purificata la soluzione

dobbiamo sapere quanto DNA utilizzare (massa), quindi occorre un metodo per avere la concentrazione di DNA nella nostra soluzione:

dosaggio in base all’assorbimento allo spettrofotometro (a 260

λ =

nm: ultravioletto lontano. assorbimento max e a 280 nm per

λ =

verificare l’affidabilità del dosaggio).

Picco di assorbimento tipico delle basi azotate →

Assorbanza → 1�� = 50 µ/�

260

La curva dello spettro di assorbimento del DNA a doppia elica ha il picco di

assorbimento a 260 nm.

In particolare il rapporto tipico del dsDNA è 1.8:

�� 1��

/

260 280

-​ Un valore troppo basso potrebbe essere legato ad una contaminazione

di proteine, che assorbono a 280 nm

-​ Un valore troppo alto può essere dovuto a contaminazione di solventi

usati per estrarre proteine contaminanti, quindi a tracce di fenolo dovute

ad un'estrazione con miscela di solventi

(fenolo/cloroformio/isoamilalcool 25:24:1).

PCR= processo di amplificazione di DNA su larga scala; tecnica utilizzata sia a scopi analitici che preparativi: attraverso questa è quindi

possibile identificare la presenza di una sequenza basandosi sulla sua amplificazione o prepararne un quantitativo sufficiente per il suo

clonaggio. Si sintetizza in-vitro, in poche ore, un frammento fino a migliaia di coppie di basi di una sequenza target, a partire da poche

copie di un templato.

La base della PCR è costituita dalle variazioni di temperatura e dall'effetto che queste variazioni di temperatura hanno sul DNA. In una

reazione di PCR, la seguente serie di passi viene ripetuta 20-40 volte (nota: 25 cicli di solito richiedono circa 2 ore e amplificano il

frammento di DNA di interesse 100.000 volte).

3 FASI PRINCIPALI DELLA PCR:

1.​ Denaturazione del DNA permette l’accesso al DNA stampo

→

2.​ Ibridazione del primer (annealing) corte sequenze di oligonucleotidi da quali l’enzima può procedere con la sintesi

→

3.​ Sintesi del DNA (estensione del primer) formazione di tali ibridi (primer + enzima) ha luogo la reazione di sintesi

→dalla

Il ciclo termico della PCR:

1.​ Step: Denaturazione del DNA

A 95°C, il DNA è denaturato (cioè i due filamenti sono separati)

2.​ Step: Annealing dei Primer/oligonucleotidi

Ad una temperatura specifica dipendente dalle sequenze dei primers, che è comunemente compresa tra 45°C e 55°C, i

primer si legano alle loro sequenze target complementari sui singoli filamenti di DNA templato; la scelta della T di

annealing è estremamente critico perché impostando una T troppo elevata riduce la stabilità degli ibridi, all'opposto

riducendo troppo la T in questa fase (al di sotto della T

stimata per il melting dell’ibrido) si rischia di avere la

stabilizzazione anche di appaiamenti non

completamente corretti

3.​ Step 3: Sintesi del DNA

A 72-74°C (temperatura ottimale per l'attività

enzimatica) la DNA Polimerasi termostabile, es Taq

DNA polimerasi, sintetizza il DNA aggiungendo

nucleotidi all'estremità 3' dei primer, dal momento che

servono ripetuti passaggi ad alte T.

Ad ogni ciclo si ha un raddoppio delle molecole corrispondenti alla sintesi del frammenti di DNA contenuto tra i 2 oligonucleotidi che

rappresentano l’amplicone. Si utilizzano sempre 2 primers in modo che ognuno dei 2 si appai a uno dei 2 filamenti del DNA templato.

L’orientamento dei primer deve essere convergente, solo in questa condizione estendendoli si riesce a sintetizzare il tratto di DNA

compreso tra i 2 oligonucleotidi. La dimensione del frammento di DNA prodotto in PCR dipende solo dai primer

La reazione di PCR amplificherà il tratto di DNA tra i due primer. Se la sequenza di DNA è nota, possono essere progettati dei primer

per amplificare qualsiasi frammento di DNA di un qualsiasi organismo.

Nel disegno degli oligonucleotidi ce ne sarà 1, definito “forward primer”, che contiene la sequenza omologa al DNA templato; invece, il

“primer reverse”, che dovrà appaiarsi al filamento complementare, nella sua progettazione dovrà necessariamente avere la sequenza

complementare e questa dovrà essere orientata correttamente.

Tutte le componenti che entrano in campo in una reazione di PCR

ricalcano ciò che avviene nell’apparato replicativo della cellula.

Per eseguire una PCR in laboratorio sono necessari i seguenti

componenti:

Template DNA (il DNA di interesse che contiene la sequenza target che desiderate copiare): non deve necessariamente

●​ essere circoscritto all’amplicone, ma può essere anche più esteso (DNA eterogeneo 9. COMUNEMENTE PER PCR preparative

si opera in una condizione agevolata di un templato omogeneo (molecole tutte uguali, plasmide con molecole tutte

d’interesse), in questo caso si può lavorare con un quantitativo limitato di DNA templato (1-10 ng)

DNA polimerasi termostabile (come la Taq Polimerasi)

●​ 2 brevi molecole di DNA a singolo filamento che fungono da primer

●​ Tutti e 4 i trifosfati nucleotidici, dNTPs (in quantità bilanciata)

●​ Tampone (soluzione salina contenente ioni e cofattori necessari), determina le condizioni ottimali al lavoro dell'enzima

●​ Mg2+, all’interno del sito attivo delle DNA polimerasi questo ione contribuisce al corretto posizionamento ed orientamento

●​ del templato della catena nascente e dei nucleotidi (substrato); non deve essere limitante, ma nemmeno largamente

eccedente, a discapito della specificità della reazione

La reazione assemblata in specifici microtubi a parete sottile viene infine caricata in un termociclatore (un dispositivo che può

cambiare drasticamente la temperatura in un periodo di tempo molto breve per eseguire il ciclo termico desiderato).

Progettazione dei primers:

-​ I primer comunemente hanno una lunghezza tra 20 e 25 basi (min 18)

-​ Il contenuto di G/C dovrebbe essere del 45-55%

-​ Le temperature di annealing della coppia di primer dovrebbero essere entro 1/2°C l'una dall'altra

-​ La base all’estremità 3’ è preferibile che sia G o C

-​ I primer devono evitare regioni di DNA ripetute

-​ I primer non devono formare appaiamenti tra loro o formare forcine con se stessi (intraoligo o tra i 2 oligo)

-​ Le Tm dei primer possono essere calcolate per determinare la temperatura di annealing; il calcolo della T alla quale il 50%

dell’oligo è stabilmente legato in un ibrido con il proprio templato complementare:

Tm= 69,3 + 0,41(%G+C) - 650/N

dove N è il numero di basi

69,3 termine fisso derivato empiricamente dalla valutazione della stabilità degli ibridi

questo algoritmo rende comprensibile qual è il contributo del contenuto positivo in GC alla stabilità delle ibrido

ed il contributo negativo della lunghezza dell’oligo (la lunghezza stabilizza)

-​ Tm di primer possono essere ottimizzati:

a.​ aumentando/diminuendo il contenuto di GC

b.​ estendendo/accorciando il primer

La DNA polimerasi termostabile:

Dato che la PCR comporta temperature molto elevate, è imperativo che nella reazione venga utilizzata una DNA polimerasi

●​ termostabile. La maggior parte delle DNA polimerasi denaturerebbe (e quindi non funzionerebbe correttamente) alle alte

temperature della PCR

La Taq DNA polimerasi è stata isolata dal batterio Thermus aquaticus delle sorgenti calde nel 1976

●​ Taq ha un'attività enzimatica massima a 75 °C a 80 °C, e un'attività sostanzialmente ridotta a temperature più basse

●​ Taq Pol ha un elevata processività Taq Pol non ha attività di proofreading

●​ spesso Taq DNA Polimerasi o un’altra delle polimerasi termostabili naturali o ricombinanti

●​ Stabile a T fino a 95° C

●​ Alta processività

●​ Taq Pol non ha proofreading activity

●​

Fedeltà dell’amplificazione:

-​ Taq DNA polimerasi manca dell'attività di proofreading, attività esonucleasica 3’ 5' comunemente presente in altre

→

-​ Taq incorpora mediamente 1 base sbagliata ogni 10^4 nucleotidi: per esempio, un target di 400 bp conterrà un errore nel

33% delle molecole dopo 20 cicli

-​ La distribuzione dell'errore sarà casuale; gli errori sono un problema se si vuole clonare il DNA amplificato (una singola

molecola può contenere diverse mutazioni), ma non lo è se si utilizza DNA amplificato per rilevare la presenza di uno

specifico gene/sequenza in un campione

-​ Per ottenere prodotti ad alta fedeltà utilizzare un enzima con attività di proofreading come ad esempio Pfu o Vent

Ottimizzazione della resa (quantitativa e qualitativa) della PCR:

1.​ T di annealing dei primer: se il tempo è insufficiente si causa una ridotta efficienza nel formare gli ibridi tra il primer ed il

templato

2.​ concentrazione di Mg2+ nella reazione: in presenza di Mg eccedente esso è in grado di instaurare ponti ionici in bolle di

locale denaturazione ,che vanno a stabilizzare l’associazione tra i primer e la regione a cui si è appaiato, nonostante non sia

il suo corretto target (può quindi stabilizzare appaiamenti scorretti laddove c’è solo una parziale complementarietà fra il

primer e la sequenza di DNA che non è il suo templato canonico)

3.​ tempo di estensione: se il tempo è limitante si espone a rischio di avere sintesi incomplete

e potrebbe esserci disponibilità insufficiente di DNA templato per promuovere la sintesi

della sequenza d’interesse

4.​ tempi di denaturazione e di annealing: I primer hanno una Tm calcolata (es. 54°C). La

temperatura di annealing può essere testata utilizzando il termociclatore a gradiente. Si

possono variare le temperature di annealing con variazioni di +/-2°C ————→

5.​ T di estensione

Si effettuano infine varie reazioni di controllo in cui sono stati eliminati vari componenti alla volta, al

fine di valutare la specificità del processo, perché è abbastanza frequente il rischio di falsi positivi nei

risultati di PCR che possono avere origine da vari fattori.

Falsi positivi nei risultati di PCR:

-​ Generati da contaminazioni al momento della raccolta dei campioni (preparazione del templato di partenza)

-​ Contaminazione scambi in laboratorio con altri campioni o con materiale di controllo positivo

-​ I primer non sono abbastanza specifici

-​ In tutte le amplificazioni servono controlli negativi utilizzati per rilevare la contaminazione

Estrazione di DNA plasmidico=

Il clonaggio di una molecola di DNA in un vettore richiede che vengano eseguiti i seguenti passaggi:

1.​ il DNA vettore, che deve contenere un’origine di replicazione, deve essere purificato ed aperto

2.​ la molecola di DNA che si vuole clonare deve essere inserita nel vettore per creare la molecola artificiale ricombinante:

taglio del DNA target e del vettore con enzimi di restrizione

→ ligazione molecola di DNA ricombinante

→

3.​ la reazione di taglio deve poter essere monitorata (gel di agarosio)

4.​ trasformazione: la molecola ricombinante deve essere inserita in E. coli/ ospite

5.​ selezione dei cloni ricombinanti

6.​ estrazione della molecola di DNA ricombinante

7.​ caratterizzazione (mappa di restrizione, sequenziamento)

Dopo la selezione clonale si attua la purificazione di DNA plasmidico a partire da una coltura di E. coli. Il processo parte da cellule

integre e consente di isolarne una componente macromolecolare, eliminando progressivamente tutte le altri componenti non

diinteresse. Partendo da cloni isolati su piastra si allestiscono delle colture inoculando E. coli su un opportuno terreno (crescita in

condizione di pressione selettiva determinata dall’aggiunta di un antibiotico specifico nel terreno). Per le caratteristiche si E. coli è

necessario un periodo d’incubazione di una notte alla T ottimale di 37° per raggiungere una densità cellulare sufficiente a poter isolare

un qua