Topi transgenici

Vantaggi nell’iniezione dei pronuclei

Il DNA esogeno non deve necessariamente essere clonato in un vettore.

I frammenti di DNA contenenti il gene d’interesse, andranno ad integrarsi nel genoma

dell’animale in copie multiple in tandem in modo casuale.

Svantaggi nell’iniezione dei pronuclei

L’integrazione random non sostituisce i geni malati e non è controllabile

I livelli di espressione genica sono variabili.

Può originare animali “mosaico” e quindi l’espressione genica è limitata solo a

determinati tessuti o organi.

2. Utilizzo di cellule staminali embrionali (ES)

Le ES cell sono cellule pluripotenti, indifferenziate, derivate da cellule embrionali precoci

⇒ (cellule della massa interna della blastocisti di topo).

Le ES cell vengono mantenute in coltura in vitro, sopra uno strato di fibroblasti feeder, per

⇒ evitare che differenzino

L’introduzione del transgene può avvenire per elettroporazione o infezione retrovirale.

⇒ Il transgene si deve integrare per ricombinazione e non in maniera casuale

⇒ Le cellule transfettate con successo possono essere identificate prima dell’iniezione nella

⇒ blastocisti eccettrice.

Le cellule ES possono essere modificate rimanendo pluripotenti. Viene inserito DNA nel loro

genoma mediante due tecniche:

Trasfezione: Diversi tipi di sostanze chimiche sono in grado di legarsi al DNA e ne mediano

l’ingresso nella cellula.

Calcio Fosfato: La procedura prevede il mescolamento di una soluzione Tampone

• HEPES contenente ioni fosfato insieme a una soluzione di cloruro di calcio (CaCl2) e il

DNA da trasfettare. Il mescolamento delle due soluzioni produce un precipitato di

calcio fosfato, che andrà a legare la molecola di DNA. Il precipitato viene prelevato,

risospeso e aggiunto al terreno di coltura (di solito una coltura mono strato). Con un

processo ancora non ben noto le cellule legano il precipitato e permettono l'ingresso

del DNA

Un metodo biologico molto efficace sfrutta i liposomi, piccole vesicole lipidiche che

• inglobano il DNA e sono indotte ad entrare con esso nella cellula simulando i processi

di endocitosi cellulare.

Elettroporazione: il DNA entra nella cellula mediante una scarica elettrica controllata, che

altera la permeabilità della membrana. Lo shock elettrico provoca la formazione di pori nella

membrana che permettono l'ingresso del materiale genetico. Ha come difetto l'alta

percentuale di cellule che non sopravvivono in seguito al trattamento. (Applicazione di un

Differenzia di potenziale )

Costrutti di DNA per la ricombinazione:

I vettori di DNA usati per generare KO hanno il gene di interesse interrotto dal gene per la

• resistenza ad un antibiotico (igromicina o G418/geneticina)

Per ottenere l’integrazione “indirizzata” avvenga le regioni che fiancheggiano il DNA

• contengono il gene per la timidina chinasi (TK) come marker. Se la TK si integra

(integrazione casuale), allora le cellule trasfettate muoiono quando vengono mantenute in

un terreno selettivo (gancyclovir)

Selezione delle ES cell:

Le ES cells resistenti al Gancyclovir e a G418 crescono in piccoli “grumi” sopra delle

• cellule feeder

Le colonie possono essere “picked” e trasferite in nuove piastre che contengono cellule

• feeder

Quando si ha il numero sufficiente di cellule:

• - Si congelano per sicurezza

- Si analizzano per Southern blotting o PCR per determinare la natura dell’evento

di integrazione

Si microiniettano nel blastocele, la cavità della blastocisti

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