Tecniche cromatografiche - Analisi dei medicinali

Materiale di supporto per lo studio delle tecniche cromatografiche

Non abbiamo trattato:

• Cromatografia di affinità
• Cromatografia planare (su strato sottile)
• Cromatografia SFC

Non ho eliminato le slides perché avrei reso incomprensibili alcune parti... un’occhiata potete comunque darla!

Cromatografia

Il termine indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo. Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa.

Le tecniche sono molto utilizzate in campo archeometrico, essendo particolarmente utili nell’analisi di miscele complesse come sono la maggior parte dei campioni di natura organica.

Nascita della cromatografia

La cromatografia è nata all’inizio del XX secolo come tecnica per la separazione di pigmenti fogliari, inventata dal botanico russo Mikhail Semenovich Tswett. Egli intendeva separare i pigmenti presenti nella clorofilla; fece un estratto di foglie verdi in etere di petrolio, lo depositò in testa ad una colonna di vetro e lo eluì con carbonato di calcio ed, in seguito, con solfuro di carbonio. I vari pigmenti si separano in bande colorate, in particolare clorofilla A e B, carotene e xantofilla. Tswett chiamò questa tecnica cromatografia, dal greco "scrittura del colore", anche in riferimento al significato del suo cognome in russo, "scrittura di Tswett".

Cenni preliminari

Le tecniche cromatografiche sono sempre distruttive (anche se in senso strettamente analitico possono in alcuni casi essere non distruttive), in quanto operano esclusivamente su campioni in soluzione o in fase vapore. I materiali oggetto di analisi vanno quindi disciolti in un opportuno solvente. Non è possibile l’analisi in situ senza prelievo di campione (tranne con strumenti miniaturizzati).

Nonostante questa premessa scoraggiante, è bene precisare che il consumo di campione è minimo. Sono sufficienti da 1 ml a 1 µl di soluzione, corrispondenti a pochi mg di campione solido.

Basi del procedimento cromatografico

• Il campione è introdotto nella fase mobile, che può essere un gas, un liquido o un fluido supercritico.
• La fase mobile viene fatta eluire in continuo attraverso la fase stazionaria, che deve essere immiscibile nell’eluente.
• La fase stazionaria (liquida o solida) si trova all’interno di una superficie piana oppure è supportata su una colonna.
• La fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi.
• I componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema.
• I componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente.
• La separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una distribuzione caratteristica tra le due fasi (costante di ripartizione K = C_s/C_m).

Visualizzazione della separazione

Ponendo all’uscita della colonna un rivelatore che misuri la concentrazione del soluto nell’eluito (cioè la fase mobile che esce dalla colonna) e riportando il segnale in funzione del tempo, si può ottenere un cromatogramma. La posizione dei picchi sull’asse dei tempi, o tempi di ritenzione, serve per identificare i componenti del campione. L’area sottesa dai picchi è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo.

Tempo di ritenzione

Il tempo di ritenzione t_R è il tempo che impiega un componente della miscela a uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal detector. Un tipico cromatogramma per una miscela a due componenti ha due situazioni diverse:

• Il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, t_M.
• Il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo t_R > t_M.

Tempo di ritenzione aggiuntivo

Oltre al tempo di ritenzione t_R, è possibile quantificare l’interazione di un soluto con la fase stazionaria in due modi:

• Mediante il volume di fase mobile V_R necessario per eluire il soluto, dove V_R = t_R x F con F = velocità di flusso.
• Mediante il fattore di capacità K’, espresso come la differenza tra il tempo di ritenzione ed il tempo morto in unità di tempo morto: K' = (t_R - t_M)/t_M.

Piatti teorici

Per descrivere il processo cromatografico è utilizzata una similitudine derivante dalla teoria della distillazione. Il sistema cromatografico è immaginato simile a una colonna di distillazione, cioè composta da una serie di strati sottili chiamati piatti teorici; in ognuno di questi microelementi della colonna si realizza l’equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fase mobile. Lo spostamento del soluto lungo la colonna è dovuto all’azione dinamica della fase mobile.

I termini numero di piatti teorici (N) e altezza del piatto (HETP, Height Equivalent to Theoretic Plate) sono comunemente utilizzati in cromatografia per quantificare le prestazioni dei sistemi cromatografici: N = 16 (t_R/W)², HETP = lunghezza colonna / N.

Risoluzione cromatografica

La possibilità di separare due o più sostanze è descritta dal parametro detto risoluzione, che misura la capacità di un sistema cromatografico di separare due analiti con caratteristiche simili:

• ΔR = 2 × (Z/(W_A + W_B))

Se la risoluzione non è sufficiente (R < 1), i due picchi non possono essere quantificati in maniera corretta.

Separazione ottimale

• a) Separazione con scarsa risoluzione e basso N
• b) Migliora la risoluzione ma è sempre basso N
• c) Ottima risoluzione e buono N

Interazione soluto-fasi

Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli: se così non fosse non ci sarebbe trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione. Sono sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni:

• Legami a idrogeno
• Interazioni dipolo-dipolo
• Interazioni dipolo-dipolo indotto
• Forze di Van der Waals
• Formazione di composti di interazione
• Attrazione coulombiana
• Interazioni steriche

In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico.

Meccanismi della separazione

In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo suddividere i meccanismi di separazione impiegati in cromatografia in:

• Adsorbimento
• Ripartizione
• Scambio ionico
• Esclusione
• Affinità

Adsorbimento

La fase stazionaria è un solido in polvere steso su un supporto; sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono stabilire legami deboli (reversibili) con le molecole della miscela da separare. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento, che può essere gas-solido o liquido-solido a seconda della natura della fase mobile.

La cromatografia di adsorbimento è utilizzata per separare sostanze neutre polari o non polari, di natura organica o inorganica.

Ripartizione

La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte o è ad esso chimicamente legato; in questo liquido le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e la fase mobile devono invece essere immiscibili. Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la diversa solubilità di ognuna. Si parla quindi di cromatografia di ripartizione, che può essere gas-liquido o liquido-liquido, a seconda della natura della fase mobile.

La cromatografia di ripartizione è chiamata fase normale se la fase stazionaria è più polare della fase mobile, mentre è chiamata inversa se la fase stazionaria è meno polare della fase mobile. Si tratta della tecnica più comunemente impiegata per la separazione di sostanze organiche.