Tecniche cromatografiche - Analisi dei medicinali

R

iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal

cromatogramma

detector..

detector Un tipico per una miscela a due componenti ha due

situazioni diverse

diverse::

• il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase

stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, t M

• il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase

stazionaria ed esce al tempo t > t

R M

Tempo di ritenzione

Oltre al tempo di ritenzione t , è possibile quantificare

R

l’interazione di un soluto con la fase stazionaria in due modi

modi::

• mediante il volume di fase mobile V necessario per eluire il

R

soluto, dove V = t x F con F = velocità di flusso

R R

• mediante il fattore di capacità K’, espresso come la differenza

tra il tempo di ritenzione ed il tempo morto in unità di tempo

morto::

morto −

t t

R M

=

K' t M

Piatti teorici

Per descrivere il processo cromatografico è utilizzata una similitudine

derivante dalla teoria della distillazione.

distillazione

. Il sistema cromatografico è

immaginato simile ad una colonna di distillazione, cioè composta da una

piatti teorici

serie di strati sottili chiamati ; in ognuno di questi

microelementi della colonna si realizza l’equilibrio di distribuzione del

soluto tra fase stazionaria e fase mobile.

mobile

. Lo spostamento del soluto lungo

la colonna è dovuto all’azione dinamica della fase mobile

numero di

I termini

piatti teorici (N) e

altezza del piatto (HETP,

Height Equivalent to

Theoric Plate) sono

comunemente utilizzati

in cromatografia per

quantificare le

prestazioni dei sistemi

cromatografici 2

N = 16 a (t /W)b , HETP = lunghezza colonna /N

R

Risoluzione cromatografica

La possibilità di

separare due o più

sostanze è descritta dal

parametro detto

risoluzione

, che misura

la capacità di un sistema

cromatografico di

separare due analiti con

caratteristiche simili:

simili

:

∆

R = 2•∆

2• Z/(W + W )

A B

Se la risoluzione non è

sufficiente (R < 1 ), i due

picchi non possono

essere quantificati in

maniera corretta

Separazione ottimale

a) separazione con

scarsa risoluzione

e basso N

b) migliora la

risoluzione ma è

sempre basso N

c) ottima risoluzione

e buono N

Interazione soluto-

soluto -

fasi

Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi

(mobile e stazionaria) sono deboli

deboli:: se così non fosse non ci sarebbe

trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione

eluizione.. Sono

sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni

interazioni::

• legami a idrogeno

• interazioni dipolo

dipolo--

dipolo

• interazioni dipolo

dipolo--dipolo indotto

• forze di Van der Waals

• formazione di composti di interazione

• attrazione coulombiana

• interazioni steriche

In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità

delle due fasi

fasi.. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello

stesso processo cromatografico

Meccanismi della separazione

In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo

suddividere i meccanismi di separazione impiegati in

cromatografia in:

in : • adsorbimento

• ripartizione

• scambio ionico

• esclusione

• affinità

Adsorbimento

La fase stazionaria è un solido in polvere steso su un supporto

supporto;;

sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono

stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della miscela

cromatografia di adsorbimento

da separare

separare.. Si parla quindi di , che

gas

gas-- solido liquido

liquido-- solido

può essere o a seconda della natura della

fase mobile

La cromatografia di adsorbimento

è utilizzata per separare sostanze

neutre polari o non polari, di

natura organica o inorganica

Ripartizione

La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare

inerte o è ad esso chimicamente legato;

legato ; in questo liquido le

molecole da separare sono solubili

solubili;; la fase stazionaria e la fase

mobile devono invece essere immiscibili.

immiscibili

. Durante l’eluizione le

molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la

cromatografia di

diversa solubilità di ognuna

ognuna.. Si parla quindi di

ripartizione gas

gas-- liquido liquido

liquido-- liquido

, che può essere o a seconda

della natura della fase mobile

La cromatografia di ripartizione è

fase normale

chiamata in se la fase

stazionaria è più polare della fase

fase

mobile, mentre è chiamata

inversa se la fase stazionaria è meno

polare della fase mobile.

mobile

. Si tratta

della tecnica più comunemente

impiegata per la separazione di

sostanze organiche

Scambio ionico

La fase stazionaria è costituita da un polimero inerte contenente

siti attivi ionizzati o ionizzabili, i cui controioni possono essere

scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno.

segno . Il

meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di

scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel

cromatografia di scambio ionico

campione..

campione Si parla di (IEC)

La cromatografia a

scambio ionico è

impiegata per la

separazione di

sostanze ioniche o

ionizzabili

Esclusione dimensionale

La fase stazionaria è un solido poroso o un gel

gel.. Le molecole

dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le

loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo

tempo;;

tempo le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed

escono dalla colonna in tempi brevi

cromatografia di

Si parla di

esclusione dimensionale (SEC)

Gel permeazione

con le varianti

per la separazione di sostanze

Gel

insolubili in acqua e

filtrazione per la separazione

di sostanze solubili in acqua

La tecnica è impiegata per la

separazione di molecole di

grandi dimensioni Affinità

In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reversibili

e molto specifiche, in modo che le molecole da separare

interagiscano con la fase stazionaria e si ottenga così l’eluizione

selettiva di alcuni componenti della miscela.

miscela

. Si parla di

cromatografia di affinità (AFC)

La cromatografia di

affinità è impiegata nella

separazione di molecole di

interesse prevalentemente

biochimico

Stato fisico della fase mobile

In base allo stato fisico della mobile possiamo

classificare le tecniche cromatografiche come segue:

segue :

Cromatografia Liquida

• (LC)

(LC):: la fase mobile è un liquido

nel quale siano solubili i componenti della miscela da

separare;;

separare la fase stazionaria deve essere insolubile

nella fase mobile

Gascromatografia

• (GC)

(GC):: la fase mobile è un gas che

funge da carrier per i componenti della miscela

Cromatografia fluida supercritica

• (SFC):

(SFC)

: la fase

mobile è un fluido supercritico, con proprietà

intermedie tra un liquido e un gas

Forma del letto cromatografico

In base alla forma del letto cromatografico su cui è

realizzato il processo separativo, possiamo le seguenti

varianti::

varianti

Cromatografia su colonna

• : la fase stazionaria è

contenuta all’interno di una colonna cilindrica, che può

colonna impaccata

riempire completamente ( ) oppure

colonna tubulare

rivestirne la superficie interna ( )

Cromatografia planare

• : la fase stazionaria è

distribuita su una superficie piana, che può essere un

cromatografia su carta

, PC) o una

supporto cartaceo ( cromatografia su

lastrina in vetro o altri materiali (

strato sottile , TLC)

Tecniche cromatografiche

• In base alla forma del letto cromatografico

Cromatografia su colonna (impaccata, open-

open -

tubular)

• Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)

•

• In base allo stato fisico della fase mobile

Cromatografia Liquida (LC)

• Gascromatografia (GC)

• Cromatografia fluida supercritica (SFC)

•

• In base al meccanismo di separazione

Adsorbimento

• Ripartizione

• Scambio ionico

• Esclusione

• Affinità

• Schema delle tecniche

Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti citati, si possono

avere numerose varianti di tecniche cromatografiche

CROMATOGRAFIA

GAS SFC LIQUIDA

GSC GLC Colonna Planare

NP RP IEC SEC TLC Carta

GPC GFC

Cromatografia liquida

La cromatografia liquida è impiegata per la separazione

di sostanze non volatili, neutre o ioniche, e di sostanze

termolabili..

termolabili Si presta facilmente a misure quantitative

quantitative..

Si possono separare sostanze appartenenti a varie

classi tra cui, di interesse archeometrico

archeometrico::

• aminoacidi, peptidi e proteine

• idrocarburi

• carboidrati

• terpenoidi

• ioni inorganici

Cromatografia planare

Si tratta di un gruppo di tecniche di cromatografia

liquida di semplicissima applicazione, spesso impiegate

per avere informazioni preliminari

preliminari.. La fase stazionaria

è supportata su lastre di vetro, fogli di alluminio o di

plastica nella versione TLC (Thin Layer

Chromatography) e su fogli di carta da filtro nella

versione PC (Paper Chromatography)

Le fasi stazionarie più usate sono il gel di silice e

l’allumina per la cromatografia di adsorbimento, la

cellulosa per la ripartizione liquido

liquido--

liquido (in questo

caso la fase stazionaria è l’acqua adsorbita sulle

particelle di cellulosa)

Cromatografia planare

L’esecuzione dell’analisi è molto semplice:

semplice

: la miscela da separare va

depositata sulla superficie, posandone con un tubo capillare una goccia su

una linea che segna l’inizio del processo di eluizione

Quindi il foglio o la lastrina si pongono in una

vaschetta contenente la fase mobile che pe