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Tecniche cromatografiche - Analisi dei medicinali Appunti scolastici Premium

Tutto quello che bisogna sapere per superare l'esame di analisi dei medicinali per quanto riguarda la cromatografia. Nozioni teoriche e pratiche. Appunti basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Anzini dell’università degli Studi di Siena - Unisi. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Analisi dei medicinali docente Prof. M. Anzini

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ESTRATTO DOCUMENTO

Cromatografia

cromatografia

Il termine indica un insieme di tecniche che hanno

lo scopo di separare una miscela nei suoi componenti, per

permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo

Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei

fase fissa fase

vari componenti fra due fasi, una chiamata o

stazionaria fase mobile eluente

e l’altra chiamata o , che fluisce in

continuo attraverso la fase fissa

Le tecniche sono molto utilizzate in campo archeometrico, essendo

particolarmente utili nell’analisi di miscele complesse come sono la

maggior parte dei campioni di natura organica

Nascita della cromatografia

La cromatografia è nata all’inizio del XX secolo come tecnica per

la separazione di pigmenti fogliari, inventata dal botanico russo

Mikhail Semenovich Tswett

Tswett.. Egli intendeva separare i pigmenti

presenti nella clorofilla;

clorofilla

; fece un estratto di foglie verdi in etere

di petrolio, lo depositò in testa ad una colonna di vetro impaccata

eluì

con carbonato di calcio ed , (cioè versò in continuo) con solfuro

di carbonio

carbonio:: i vari pigmenti si separano in bande colorate, in

particolare clorofilla A e B, carotene e xantofilla

Tswett chiamò questa

cromatografia

tecnica scrittura del

dal greco

colore o, visto il

significato del suo

cognome in russo,

scrittura di Tswett

Cenni preliminari

Le tecniche cromatografiche sono sempre distruttive

(anche se in senso strettamente analitico possono in

alcuni casi essere non distruttive), in quanto operano

esclusivamente su campioni in soluzione o in fase

vapore::

vapore i materiali oggetto di analisi vanno quindi

disciolti in un opportuno solvente

solvente.. Non è possibile

l’analisi senza prelievo di campione né tanto meno

in situ

l’analisi (tranne con strumenti miniaturizzati)

Nonostante questa premessa scoraggiante, è bene

precisare che il consumo di campione è minimo.

minimo

. Sono

sufficienti da 1 ml a 1 µl di soluzione, corrispondenti a

pochi mg di campione solido

Basi del procedimento cromatografico

• il campione è introdotto nella fase mobile, che può essere un gas, un

liquido o un fluido supercritico

• la fase mobile viene fatta eluire in continuo attraverso la fase

stazionaria, che deve essere immiscibile nell’eluente colonna

• la fase stazionaria (liquida o solida) si trova all’interno di una

superficie piana

oppure è supportata su una

• la fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti

della miscela da separare si distribuiscano tra le due fasi

• i componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in

questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il

sistema

• i componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più

velocemente

• la separazione dei componenti avviene in quanto ogni sostanza ha una

distribuzione caratteristica tra le due fasi (costante di ripartizione

K =C /C )

d s m

Visualizzazione della separazione

Ponendo all’uscita della colonna

un rivelatore che misuri la

concentrazione del soluto

eluato

nell’ (cioè la fase mobile

che esce dalla colonna) e

riportando il segnale in

funzione del tempo si può

cromatogramma

ottenere un

La posizione dei picchi sull’asse

tempo di

dei tempi, o

ritenzione , serve per

identificare i componenti del

campione

L’area sottesa dai picchi è

proporzionale alla quantità di

ogni singolo componente e può

essere utilizzata a scopo

quantitativo Tempo di ritenzione

Il tempo di ritenzione t è il tempo che impiega un componente della miscela

R

iniettata ad uscire dalla colonna o, tecnicamente, ad essere rivelato come picco dal

cromatogramma

detector..

detector Un tipico per una miscela a due componenti ha due

situazioni diverse

diverse::

• il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase

stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, t M

• il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase

stazionaria ed esce al tempo t > t

R M

Tempo di ritenzione

Oltre al tempo di ritenzione t , è possibile quantificare

R

l’interazione di un soluto con la fase stazionaria in due modi

modi::

• mediante il volume di fase mobile V necessario per eluire il

R

soluto, dove V = t x F con F = velocità di flusso

R R

• mediante il fattore di capacità K’, espresso come la differenza

tra il tempo di ritenzione ed il tempo morto in unità di tempo

morto::

morto −

t t

R M

=

K' t M

Piatti teorici

Per descrivere il processo cromatografico è utilizzata una similitudine

derivante dalla teoria della distillazione.

distillazione

. Il sistema cromatografico è

immaginato simile ad una colonna di distillazione, cioè composta da una

piatti teorici

serie di strati sottili chiamati ; in ognuno di questi

microelementi della colonna si realizza l’equilibrio di distribuzione del

soluto tra fase stazionaria e fase mobile.

mobile

. Lo spostamento del soluto lungo

la colonna è dovuto all’azione dinamica della fase mobile

numero di

I termini

piatti teorici (N) e

altezza del piatto (HETP,

Height Equivalent to

Theoric Plate) sono

comunemente utilizzati

in cromatografia per

quantificare le

prestazioni dei sistemi

cromatografici 2

N = 16 a (t /W)b , HETP = lunghezza colonna /N

R

Risoluzione cromatografica

La possibilità di

separare due o più

sostanze è descritta dal

parametro detto

risoluzione

, che misura

la capacità di un sistema

cromatografico di

separare due analiti con

caratteristiche simili:

simili

:

R = 2•∆

2• Z/(W + W )

A B

Se la risoluzione non è

sufficiente (R < 1 ), i due

picchi non possono

essere quantificati in

maniera corretta

Separazione ottimale

a) separazione con

scarsa risoluzione

e basso N

b) migliora la

risoluzione ma è

sempre basso N

c) ottima risoluzione

e buono N

Interazione soluto-

soluto -

fasi

Le interazioni che si verificano tra le sostanze da separare e le due fasi

(mobile e stazionaria) sono deboli

deboli:: se così non fosse non ci sarebbe

trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, eluizione

eluizione.. Sono

sfruttate a scopo separativo le seguenti interazioni

interazioni::

• legami a idrogeno

• interazioni dipolo

dipolo--

dipolo

• interazioni dipolo

dipolo--dipolo indotto

• forze di Van der Waals

• formazione di composti di interazione

• attrazione coulombiana

• interazioni steriche

In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità

delle due fasi

fasi.. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello

stesso processo cromatografico

Meccanismi della separazione

In base ai tipi di interazione prima descritti possiamo

suddividere i meccanismi di separazione impiegati in

cromatografia in:

in : • adsorbimento

• ripartizione

• scambio ionico

• esclusione

• affinità

Adsorbimento

La fase stazionaria è un solido in polvere steso su un supporto

supporto;;

sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono

stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della miscela

cromatografia di adsorbimento

da separare

separare.. Si parla quindi di , che

gas

gas-- solido liquido

liquido-- solido

può essere o a seconda della natura della

fase mobile

La cromatografia di adsorbimento

è utilizzata per separare sostanze

neutre polari o non polari, di

natura organica o inorganica

Ripartizione

La fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare

inerte o è ad esso chimicamente legato;

legato ; in questo liquido le

molecole da separare sono solubili

solubili;; la fase stazionaria e la fase

mobile devono invece essere immiscibili.

immiscibili

. Durante l’eluizione le

molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi secondo la

cromatografia di

diversa solubilità di ognuna

ognuna.. Si parla quindi di

ripartizione gas

gas-- liquido liquido

liquido-- liquido

, che può essere o a seconda

della natura della fase mobile

La cromatografia di ripartizione è

fase normale

chiamata in se la fase

stazionaria è più polare della fase

fase

mobile, mentre è chiamata

inversa se la fase stazionaria è meno

polare della fase mobile.

mobile

. Si tratta

della tecnica più comunemente

impiegata per la separazione di

sostanze organiche

Scambio ionico

La fase stazionaria è costituita da un polimero inerte contenente

siti attivi ionizzati o ionizzabili, i cui controioni possono essere

scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno.

segno . Il

meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di

scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel

cromatografia di scambio ionico

campione..

campione Si parla di (IEC)

La cromatografia a

scambio ionico è

impiegata per la

separazione di

sostanze ioniche o

ionizzabili

Esclusione dimensionale

La fase stazionaria è un solido poroso o un gel

gel.. Le molecole

dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le

loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo

tempo;;

tempo le molecole più grandi sono invece escluse dai pori ed

escono dalla colonna in tempi brevi

cromatografia di

Si parla di

esclusione dimensionale (SEC)

Gel permeazione

con le varianti

per la separazione di sostanze

Gel

insolubili in acqua e

filtrazione per la separazione

di sostanze solubili in acqua

La tecnica è impiegata per la

separazione di molecole di

grandi dimensioni Affinità

In questo caso si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reversibili

e molto specifiche, in modo che le molecole da separare

interagiscano con la fase stazionaria e si ottenga così l’eluizione

selettiva di alcuni componenti della miscela.

miscela

. Si parla di

cromatografia di affinità (AFC)

La cromatografia di

affinità è impiegata nella

separazione di molecole di

interesse prevalentemente

biochimico

Stato fisico della fase mobile

In base allo stato fisico della mobile possiamo

classificare le tecniche cromatografiche come segue:

segue :

Cromatografia Liquida

• (LC)

(LC):: la fase mobile è un liquido

nel quale siano solubili i componenti della miscela da

separare;;

separare la fase stazionaria deve essere insolubile

nella fase mobile

Gascromatografia

• (GC)

(GC):: la fase mobile è un gas che

funge da carrier per i componenti della miscela

Cromatografia fluida supercritica

• (SFC):

(SFC)

: la fase

mobile è un fluido supercritico, con proprietà

intermedie tra un liquido e un gas

Forma del letto cromatografico

In base alla forma del letto cromatografico su cui è

realizzato il processo separativo, possiamo le seguenti

varianti::

varianti

Cromatografia su colonna

• : la fase stazionaria è

contenuta all’interno di una colonna cilindrica, che può

colonna impaccata

riempire completamente ( ) oppure

colonna tubulare

rivestirne la superficie interna ( )

Cromatografia planare

• : la fase stazionaria è

distribuita su una superficie piana, che può essere un

cromatografia su carta

, PC) o una

supporto cartaceo ( cromatografia su

lastrina in vetro o altri materiali (

strato sottile , TLC)

Tecniche cromatografiche

• In base alla forma del letto cromatografico

Cromatografia su colonna (impaccata, open-

open -

tubular)

• Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)

• In base allo stato fisico della fase mobile

Cromatografia Liquida (LC)

• Gascromatografia (GC)

• Cromatografia fluida supercritica (SFC)

• In base al meccanismo di separazione

Adsorbimento

• Ripartizione

• Scambio ionico

• Esclusione

• Affinità

• Schema delle tecniche

Dalla combinazione dei meccanismi e dei supporti citati, si possono

avere numerose varianti di tecniche cromatografiche

CROMATOGRAFIA

GAS SFC LIQUIDA

GSC GLC Colonna Planare

NP RP IEC SEC TLC Carta

GPC GFC

Cromatografia liquida

La cromatografia liquida è impiegata per la separazione

di sostanze non volatili, neutre o ioniche, e di sostanze

termolabili..

termolabili Si presta facilmente a misure quantitative

quantitative..

Si possono separare sostanze appartenenti a varie

classi tra cui, di interesse archeometrico

archeometrico::

• aminoacidi, peptidi e proteine

• idrocarburi

• carboidrati

• terpenoidi

• ioni inorganici

Cromatografia planare

Si tratta di un gruppo di tecniche di cromatografia

liquida di semplicissima applicazione, spesso impiegate

per avere informazioni preliminari

preliminari.. La fase stazionaria

è supportata su lastre di vetro, fogli di alluminio o di

plastica nella versione TLC (Thin Layer

Chromatography) e su fogli di carta da filtro nella

versione PC (Paper Chromatography)

Le fasi stazionarie più usate sono il gel di silice e

l’allumina per la cromatografia di adsorbimento, la

cellulosa per la ripartizione liquido

liquido--

liquido (in questo

caso la fase stazionaria è l’acqua adsorbita sulle

particelle di cellulosa)

Cromatografia planare

L’esecuzione dell’analisi è molto semplice:

semplice

: la miscela da separare va

depositata sulla superficie, posandone con un tubo capillare una goccia su

una linea che segna l’inizio del processo di eluizione

Quindi il foglio o la lastrina si pongono in una

vaschetta contenente la fase mobile che per

discendente

gravità (modalità ), per

ascendente

capillarità (modalità ) o per diffusione laterale (modalità

orizzontale

) fluisce sulla fase fissa trascinando gli analiti e separandoli

Cromatografia planare

ascendente

(a) camera di sviluppo a flusso orizzontale

(b) camera di sviluppo a flusso

Cromatografia planare

Il risultato è (spesso ma non sempre) visualizzabile sotto forma di

macchie colorate, ognuna dovuta ad un componente della miscela.

miscela .

Il riconoscimento delle sostanze può avvenire effettuando

separazioni su miscele standard;

standard

; in questo caso il parametro che

fattore di

caratterizza i soluti separati è il cosiddetto Rf o

ritardo . Per ogni analita il valore di Rf si

ottiene misurando la distanza percorsa

dal centro della macchia e

confrontandola con la distanza percorsa

dal fronte dell’eluente

dell’eluente::

Rf = d / d

analita eluente

Il valore di Rf degli analiti è quindi

sempre compreso tra 0 e 1

. I valori

ottimali sono compresi tra 0 . 4 e 0 . 8

Visualizzazione dei risultati

Nel caso le macchie non siano colorate, è possibile ricorrere a due

metodi per visualizzare il risultato della separazione:

separazione

:

• utilizzare una lampada UV per irraggiare la lastrina, se le

sostanze separate non assorbono la luce visibile ma assorbono

λ

nell’ultravioletto ( < 400 nm)

nm);; può essere necessario addizionare

alla fase stazionaria o alla fase mobile un indicatore di

fluorescenza che permette di localizzare le macchie

• spruzzare la lastrina con una soluzione contenente sostanze in

grado di reagire con i costituenti della miscela separata,

generando composti colorati;

colorati ; può essere necessario scaldare

leggermente la lastrina per favorire la reazione

Irraggiamento con UV

Separazione di coloranti

antrachinonici con TLC e

illuminazione con lampada

UV a 254 nm (dx)

(dx);;

l’intensità delle macchie può

essere valutata con un

colorimetro (sotto) O

O

Addizione di reagenti cromogeni

Nell’immagine sotto è mostrato un contenitore per

l’aspersione di ninidrina su lastrine TLC o PC

Alcuni esempi di reagenti correntemente impiegati per

evidenziare le macchie sono riportati nella tabella

sottostante Reagente Utilizzo

Iodio in EtOH per composti azotati

AgNO in NH per sostanze riducenti

3 3

Alizarina per cationi

Ninidrina per amminoacidi e ammine

HS per cationi e metalli pesanti

2

Cromatografia planare bidimensionale

Per aumentare la separazione tra gli analiti e quindi la

loro identificazione è possibile effettuare l’eluizione

lungo due dimensioni, prima lungo un asse e poi, girando

a 90°

90

° la lastrina, lungo l’asse ortogonale, evenutalmente

con una fase mobile differente

differente:: in questo modo le

macchie sono separate in maniera più efficiente

Sotto::

Sotto separazione di aminoacidi


PAGINE

69

PESO

1.15 MB

AUTORE

Pipps91

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Chimica e tecnologie farmaceutiche
SSD:
Università: Trieste - Units
A.A.: 2017-2018

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Pipps91 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Analisi dei medicinali e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Trieste - Units o del prof Anzini Maurizio.

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