Che materia stai cercando?

Tecniche Biomolecolari per lo studio del sistema nervoso

Appunti di Neurobiologia molecolare sulle Tecniche Biomolecolari per lo studio del sistema nervoso basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Presutti dell’università degli Studi La Sapienza - Uniroma1, facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Neurobiologia molecolare docente Prof. C. Presutti

Anteprima

ESTRATTO DOCUMENTO

Le tecniche che stanno dando dati migliori sono tecniche che o fanno un knock in (inseriscono un

gene modificato) o un KO condizionale (cioè un KO solo in certi tessuti ed in certe fasi del topo e

questo risolve il problemna della letalità perché molto spesso non si riesce ad avere il topo perché

quel gene è fondamentale e dà letalità nell’embrione e l’organismo cerca di riassestarsi su questa

modificazione e quindi alla fine il fenotipo è alterato da diversi punti di vista che non sono più

indicativi del ruolo del nostro gene).

Una grossa fetta delle sue lezioni vertirà sulla descrizione del controllo dell’espressione genica nel

sistema nervoso ma prima di questo è necessario focalizzarsi su due concetti:

1) la complessità del sistema nervoso è insita nel sistema nervoso stesso per la sua funzione

(teleology), la funzione del sistema nervoso è di mediare l’interazione dell’organismo con

l’ambiente per permettere la sopravvivenza dell’individuo, la sopravvivenza della sua prole

e la sua riproduzione. Quindi per eseguire un compito così complesso era chiaro che

nell’evoluzione si sarebbero selezionate delle strutture estremamente complesse,

compartimentalizzate, ridondanti (che permette di sfruttare una via alternativa),

estremamente plastiche.

2) Il sistema nervoso è una struttura molto recente ed è il prodotto di un’evoluzione

lunghissima che ha portato alla creazione di varianti strutturali degli elementi stessi del

sistema nervoso.

Quello che noi sappiamo oggi riguarda molto i recettori di membrana che sono ionotropici e

accoppiati alle G proteine (detti anche metabotropici) questi recettori non solo nell’uomo ma già nel

verme appartengono a delle famiglie multigeniche.Quindi i recettori sono costituiti da proteine che

sono estremamente simili dal punto di vista della sequenza ma contengono delle piccole variazioni

che hanno un ruolo fondamentale nella loro funzione.Il sequenziamento di queste famiglie

multigeniche ha permesso di ricostruire la storia evolutiva di certi recettori ma anche

dell’organismo di appartenenza e ad esempio si è visto che i recettori ionotropici che appartengono

ad una famiglia contenente un grossissimo numero di isoproteine diverse in realtà tutti i recettori

ionotropici si possono dividere in due grosse classi che sono la classe dei recettori per il glutammato

e la classe il cui prototipo è il recettore nicotinico per l’acetilcolina.

Ciascuna classe deriva da un unico gene ancestrale che ha dato luogo ad un’estrema varietà di

recettori che differiscono in quanto specificità di

ligando ma differiscono anche nella localizzazione

in diverse aree e anche in proprietà funzionali.

Lo stesso dicasi per il recettore nicotinico

dell’acetilcolina che si è estremamente

differenziato ed ha avuto origine da un unico gene

ancestrale che codificava per un poro per cationi

metre la sottoclasse dei recettori per il GABA

deriva da un gene ancestrale specifico per gli

anioni.

Un concetto importante è che questa

diversificazione genica è andata in parallelo con un

aumento della complessità del sistema, quindi a

partire da organismi inferiori passando per

organismi superiori l’aumento delle varianti quindi

l’aumento del numero delle isoforme della subunità α e della subunità β è proprio funzionale alla

creazione di un sistema con una funzionalità più complessa.

Partendo dal sequenziamento delle varianti in diversi organismi (lavoro di Changeux) riesce a

ricostruire come la diversificazione dei recettori sia andata in parallelo con l’aumento della

complessità del sistema colinergico.

L’analisi della complessità molecolare che sottende alla complessità cellulare del sistema

nervoso

In realtà la complessità cellulare non dà l’idea della complessità dei sistemi perché parlando del

verme C. Elegans che ha solamente 302 neuroni ma ha un sistema nervoso estremamente

sofisticato, se si passa al cervello umano il numero dei neuroni e la loro specializzazione aumenta

con 100 miliardi di neuroni che vengono suddivisi in classi che si distinguono per morfologia e

funzionalità.

Un contributo enorme alla complessità del sistema è dato dalle interazioni tra le diverse cellule

(ciascuna cellula interagisce con 100000 cellule diverse).

La complessità molecolare rivelata dagli studio di biologia molecolare ha fatto capire meglio il

sistema e le sue funzioni.

Questa complessità molecolare non è statica e può cambiare nel tempo per cui la complessità dei

sistemi neuronali può cambiare sia nel tempo che nello spazio e questo è il presupposto che stà alla

base della plasticità del sistema nervso.

Parlando di complessità ci concentriamo sui recettori ionotropici e metabotropici.

Sicuramente i recettori metabotropici hanno una varietà genica maggiore, nel solo C.Elegans

sembra ci siano più di 1100 recettori associati alle G proteine che costituiscono il 5% del genoma e

considerando il ruolo dei recettori associati alle G proteine quale pressione selettiva ci sia stata per

ampliare la variabilità del sistema recettoriale e questo si deduce dal fatto che questi recettori sono

coinvolti in processi fondamentali di interazione con l’ambiente perché sono responsabili del

riconoscimento di stimoli che vanno dalla luce (quindi i fotoni) fino a riuscire a legare grandi

proteine di tipo ormonale; quindi è chiaro che su questi recettori c’è stata una grossa pressione

selettiva che già nel 1977 si cominciava a capire anche se a quell’epoca si pensava che l’evoluzione

passasse attraverso una “migrazione molecolare”,in realtà però è proprio la variabilità molecolare

che ha dato le basi all’evoluzione dei sistemi.

I recettori associati alle G proteine sono probabilmente il modello migliore di questo sistema

estremamente complesso perché estremamente evoluto.

La stessa variabilità si ottiene per i recettori ionotropici che sono eteroligomeri.

Il recettore nicotinico di TORPEDO contiene 5 subunità diverse, nell’uomo sono solo 2 le subunità

ma ciascuna subunità si presenta in una forma isoproteica quindi sono 9 le subunità di α e 5 di β.

Quindi se anche non è così complessa la famiglia genica dei recettori ionotropici è dalla

combinazione delle diverse subunità che si genera complessità.

Fino adesso abbiamo visto quindi una variabilità legata ai geni e una variabilità che và alla

creazione di complessi eteroligomerici.

Questa variabilità strutturale porta ad una variabilità funzionale e infatti nel caso dei recettori

nicotinici per l’acetilcolina le diverse varianti hanno una diversa localizzazione anatomica ma anche

cellulare infatti certe forme sono presinaptiche ed altre postsinaptiche, modificano la sensibilità al

ligando e quindi modificano tutta una serie di caratteristiche funzionali.

In realtà la situazione è più complessa come dicevamo prima se uno guarda alla complessità genica

e magari introduce altri concetti come la creazione di forme oligomeriche comunque non riesce a

dare una giustificazione all’enorme varietà del sistema e infatti l’osservazione che nasce da quella

che è una delle più grosse scoperte che nasce indiscutibilmente dalla biologia moderna che nasce

proprio dal sequenziamento dei genomi dei diversi organismi l’idea che ci fosse una regolazione

ulteriore che probabilmente risiedeva,così come è stato dimostrato,in una ridondanza di sequenze

non codificanti ma oggi non tratteremo questo aspetto.

Oggi parleremo di uno dei primi step di rielaborazione del prodotto genico, in particolare parliamo

della modificazione del trascritto primario di un gene per editing della sua sequenza nucleotidica.

Questa modificazione enzimatica è specifica del sistema nervoso, esiste in altri distretti ma

estremamente raro, mentre avviene come ad esempio nel caso del recettore GLUR2 nel 99% delle

subunità GLUR2, quindi è estremamente importante per la rielaborazione dell’informazione genica

contenuta nel trascritto primario.

Importante è vedere quando avviene l’editing: esistono una serie di meccanismi di controllo

dell’espressione genica a monte di tipo epigenetico,di tipo trascrizionale, quando è prodotto il

trascritto primario quidi un trascritto che contiene sia le sequenze introniche che esoniche questo

prodotto genico è estremamente instabile e quindi deve essere modificato attraverso l’aggiunta del

cap e della coda di poliadenilazione, ma deve essere anche rielaborato non solo per rimuovere le

sequenze introniche ma prima ancora per generare dei prodotti che conferiscono una funzione in più

che può essere utile al sistema di appartenenza (parlando in termini evoluzionistici).

Infatti sul trascritto primario in concomitanza con la trascrizione all’interno del trascrittoma, può

avvenire la modificazione di singoli residui nucleotidici presenti non solo sugli esoni ma anche

sugli introni (più comunemente nel sistema nervoso sugli esoni).

L’editing può essere nei mammiferi di due tipi: 1)l’editing può essere la modificazione di una

citidina in uridina(CU) 2) l’editing può essere la modificazione di una adenosina in inosina(AI).

In entrambi i casi si tratta di reazioni di deaminazione ossidativa quindi reazione che modificano

l’identità strutturale e funzionale della base azotata.

È una reazione di tipo enzimatico e quindi richiede energia ed avviene prima dello splicing,

vedremo come lo stesso editing può influenzare lo splicing.

Lo stesso editing modifica l’identità delle basi e noi parleremo soprattutto di editing AI che è quello

che si verifica nel sistema nervoso.

Più comunemente la modificazione è a carico di una adenosina contenuta in un esone ed in

particolar modo contenuta in una struttura secondaria particolare.

Quindi perché gli enzimi responsabili di quella modificazione possano riconoscere quella sequenza

devono trovare una struttura a forcina o detta a stem-loop, che si può creare in realtà a partire da

sequenze molto distanti quindi è molto difficile studiare l’editing.

Perciò abbiamo una adenosina che viene inserita in una struttura secondaria che viene modificata

per deaminazione ossidativa in inosina e perciò il gruppo amminico è sostituito da un ossigeno

Questa è una cosa che influenza molto la reattività della base perché l’inosina in realtà è molto

diversa dalla adenosina ed ha una struttura più simile alla guanina, quindi la reattività chimica

dell’inosina è più simile a quella della guanina e questo vuol dire che se la nostra adenosina

(secondo le regole di Watson e Creek) interagisce chimicamente con l’uracile sull’RNA e con la

timidina sul DNA, nel nostro caso però si parla di espressione genica quindi interagisce

chimicamente con l’uracile sull’RNA, l’inosina comportandosi più come una guanosina tende ad

interagire con la citosina e questo chiaramente tende a sconvolgere tutto il codice genetico per cui

l’effetto finale è la modificazione di un amminoacido in una posizione corrispondente alla tripletta

in cui è avvenuta la deaminazione.

L’immagine qui sotto è di un mRNA maturo a livello citoplasmatico che viene caricato sui

ribosomi, quindi viene caricato sul tRNA che porta l’amminoacido; quindi se prima su questo

codone che era AUU veniva caricato un tRNA per l’isoleucina in questo caso il riconoscimento è

da parte di un tRNA in questo caso per la valina che avrà una citosina. L’unica differenza rispetto al

tRNA per l’isoleucina è una

citosina al posto dell’uracile.

Quindi questa reazione è di

tipo enzimatico e perciò noi

abbiamo una struttura a

forcina che viene

riconosciuta dagli enzimi

responsabili della

deaminazione che sono le

ADAR, che stà per

adenosine deaminase acting

on RNA, quindi sono

adenosine deaminasi che

agiscono specificamente

sull’RNA, che nell’uomo

sono in due forma ma ne

esiste una in particolare

specifica per il sistema

nervoso, in Drosophila ne

esiste una sola.

Se noi stiamo lavorando su

un sistema cellulare

neuronale abbiamo il

sospetto che nelle nostre cellule ci sia l’editing di un certo recettore in risposta ad un certo stimolo,

perché queste modificazioni hanno una plasticità e vengono indotte in certe situazioni particolari,

qual è la cosa più semplice da fare per rivelare la presenza di editing nei nostri mRNA? IL

CONFRONTO DELLA SEQUENZA DEL GENE.

Se noi abbiamo il cromatogramma della sequenza del DNA di Drosophila, noi abbiamo i picchi che

corrispondono a ciascun nucleotide. Questo è il cromatogramma del cDNA, e c’è un doppio picco e


PAGINE

10

PESO

822.50 KB

AUTORE

ludide

PUBBLICATO

7 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in neurobiologia
SSD:
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher ludide di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Neurobiologia molecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università La Sapienza - Uniroma1 o del prof Presutti Carlo.

Acquista con carta o conto PayPal

Scarica il file tutte le volte che vuoi

Paga con un conto PayPal per usufruire della garanzia Soddisfatto o rimborsato

Recensioni
Ti è piaciuto questo appunto? Valutalo!

Altri appunti di Neurobiologia molecolare

Ruolo dei microRNA nella plasticità sinaptica
Appunto
Regolazione genica a livello post trascrizionale
Appunto
Il sistema dei microRNA neuronali
Appunto
Meccanismi di controllo delle proteine  sull'RNA
Appunto