Tecniche Biomolecolari per lo studio del sistema nervoso

La complessità del sistema nervoso

Le lezioni cercheranno di affrontare un argomento che è quello della complessità del sistema nervoso, in particolare saranno analizzate le strategie e i meccanismi che il sistema biologico ha sviluppato per realizzare questa complessità molecolare che è alla base della complessità del sistema nervoso. Il concetto apparentemente è semplice ma è molto importante per diversi motivi:

• In primo luogo perché conoscerne le dimensioni e le sfaccettature permette di conoscere meglio il sistema nelle sue funzioni.
• È l’effetto finale di un lunghissimo percorso evolutivo che, nel caso dei mammiferi, è intorno ai milioni di anni.

Il ruolo della biologia molecolare

Il ruolo della biologia molecolare nel definire la dimensione della complessità soprattutto molecolare del sistema nervoso è stato fondamentale perché negli ultimi vent’anni l’introduzione di tecniche di biologia molecolare ha permesso di aprire delle porte su aspetti della regolazione del sistema nervoso. Questa finestra si è aperta anche per rispondere alle grosse domande che si erano poste dopo il sequenziamento del genoma umano, poiché nel momento in cui è stato sequenziato il genoma umano, trovare nell’uomo 35.000 geni, poco più del doppio che quello del verme, ha posto il problema di capire come questa variabilità venga realizzata e cosa ci fosse in più oltre alla variabilità genetica.

Il sistema nervoso ha utilizzato delle strategie di controllo dell’espressione genica estremamente fini che contribuiscono enormemente ad aumentare l’output proteico.

Tecniche utilizzate per lo studio del sistema nervoso

• Sequenziamento: Dal sequenziamento del genoma dei diversi organismi si sono individuate famiglie multigeniche, è stato possibile ricostruire il percorso evolutivo di organismi diversi attraverso l’allineamento della sequenza genica di organismi che appartengono a diversi step delle fasi evolutive.
• Una cosa importantissima che è derivata dal sequenziamento del genoma è stata la possibilità di caratterizzare meglio i DNA complementari ottenuti per trascrizione inversa dell’mRNA (cDNA). Una volta ottenuti questi DNA complementari clonati, una tecnica che ormai è classica soprattutto per studi di neuroscienze è quella di esprimere, ad esempio, un certo recettore ottenuto per clonaggio sulla base di sequenze genomiche e di cDNA, quindi esprimere in seguito questi recettori all’interno di organismi modello, come le uova di Xenopus. Le uova di Xenopus sono un modello molto utile perché sono grosse e sotto un microscopio è possibile microiniettare un plasmide che esprima un recettore ionotropico e vedere come l’espressione di questo recettore modifica il potenziale di membrana. Su queste uova si può fare una misurazione elettrica.
• Più recentemente si sono sviluppate tecniche di genomica funzionale (analisi dei profili di espressione dei mRNA), proteomica; questo ha cominciato a porre problemi perché i trascritti ottenuti da un certo genotipo erano molto di più di quelli previsti.

La tecnica di sequenziamento ora sta avendo un ritorno di gloria per l’introduzione di tecnologie di tipo deep sequencing, che è il sequenziamento di cDNA o genomi di diversi organismi su larga scala. In tempi molto veloci si può sequenziale un grossissimo numero di paia di basi e, ad esempio, vedere il profilo di espressione di un organismo sottoposto a stress in un'area particolare come l’ippocampo, rispetto a un organismo di base che non ha subito lo stesso tipo di manipolazione. Quindi l’idea è di prendere il tessuto dell’ippocampo dall’organismo stressato piuttosto che dall’organismo naive, estrarre l’RNA, farne il cDNA e poi con questa tecnica fare un sequenziamento su larga scala. Quello che ci si aspetta è che ci siano delle informazioni molto più definitive di quelle che avevamo con l’uso di tecniche classiche di biologia molecolare.

Importanza della mouse neurogenetics

Importante è anche la mouse neurogenetics: KI, KO, mutanti condizionali. Cioè creazione di modelli animali su cui c’è stato un grosso investimento. Capire che problemi ha un topo è molto difficile, ossia creare un topo knock out per individuare la funzione di una proteina deletata in questo topo e dedurne la funzione dal fenotipo del topo è molto difficile. Questa tecnica si sta sviluppando sempre di più, prima di tutto con la creazione di cliniche del topo, cioè il laboratorio crea il suo topo mutante ed il topo viene messo in una clinica del topo che esegue un check-up completo per vedere qual è il fenotipo e cioè qual è la funzione alterata.

Le tecniche che stanno dando dati migliori sono tecniche che fanno un knock in (inseriscono un gene modificato) o un KO condizionale (cioè un KO solo in certi tessuti e in certe fasi del topo); questo risolve il problema della letalità perché spesso non si riesce ad avere il topo poiché quel gene è fondamentale e provoca letalità nell’embrione. L’organismo cerca di riassestarsi su questa modifica e quindi il fenotipo è alterato da diversi punti di vista, che non sono più indicativi del ruolo del nostro gene.

Controllo dell’espressione genica nel sistema nervoso

Una grossa parte delle lezioni verterà sulla descrizione del controllo dell’espressione genica nel sistema nervoso, ma prima di questo è necessario focalizzarsi su due concetti:

1. La complessità del sistema nervoso è insita nel sistema nervoso stesso per la sua funzione (teleology). La funzione del sistema nervoso è di mediare l’interazione dell’organismo con l’ambiente per permettere la sopravvivenza dell’individuo, della sua prole e la sua riproduzione. Quindi, per eseguire un compito così complesso, era chiaro che nell’evoluzione si sarebbero selezionate strutture estremamente complesse, compartimentalizzate, ridondanti (che permettono di sfruttare una via alternativa) ed estremamente plastiche.
2. Il sistema nervoso è una struttura molto recente ed è il prodotto di un’evoluzione lunghissima che ha portato alla creazione di varianti strutturali degli elementi stessi del sistema nervoso.

Quello che sappiamo oggi riguarda molto i recettori di membrana che sono ionotropici e accoppiati alle G proteine (detti anche metabotropici). Questi recettori, non solo nell’uomo ma già nel verme, appartengono a famiglie multigeniche. Quindi i recettori sono costituiti da proteine che sono estremamente simili dal punto di vista della sequenza, ma contengono piccole variazioni che hanno un ruolo fondamentale nella loro funzione.

Il sequenziamento di queste famiglie multigeniche ha permesso di ricostruire la storia evolutiva di certi recettori ma anche dell’organismo di appartenenza. Ad esempio, si è visto che i recettori ionotropici appartenenti a una famiglia contenente un grosso numero di isoproteine diverse, in realtà, si possono dividere in due grosse classi: la classe dei recettori per il glutammato e la classe il cui prototipo è il recettore nicotinico per l’acetilcolina. Ciascuna classe deriva da un unico gene ancestrale che ha dato luogo a un’estrema varietà di recettori che differiscono in quanto specificità di ligando, ma differiscono anche nella localizzazione in diverse aree e proprietà funzionali.

Lo stesso dicasi per il recettore nicotinico dell’acetilcolina che si è estremamente differenziato ed ha avuto origine da un unico gene ancestrale che codificava per un poro per cationi, mentre la sottoclasse dei recettori per il GABA deriva da un gene ancestrale.