Tecniche Biomolecolari per lo studio del sistema nervoso

La complessità del sistema nervoso

Le lezioni cercheranno di affrontare un argomento che è quello della complessità del sistema

nervoso, in particolare saranno analizzate le strategie e i meccanismi che il sistema biologico ha

sviluppato per realizzare questa complessità molecolare che è alla base della complessità del

sistema nervoso.

Il concetto apparentemente è semplice ma è molto importante per diversi motivi: 1) in primo luogo

perché conoscerne le dimensioni e le sfaccettature permette di conoscere meglio il sistema nelle sue

funzioni 2) è l’effetto finale di un lunghissimo percorso evolutivo che nel caso dei mammiferi è

intorno ai milioni di anni.

Il ruolo della biologia molecolare nel definire la dimensione della complessità soprattutto

molecolare del sistema nervoso è stato fondamentale perché gli ultimi vent’anni l’introduzione di

tecniche di biologia molecolare ha permesso di aprire delle porte su degli aspetti della regolazione

del sistema nervoso, in realtà questa finestra si è aperta anche per rispondere alle grosse domande

che si erano poste dopo il sequenziamento del genoma umano, poiché nel momento in cui è stato

sequenziato il genoma umano trovare nell’uopo 35000 geni che sono poco più del doppio che quelli

del verme ha posto il problema di capire come questa variabilità venga realizzata e cosa ci fosse in

più oltre alla variabilità genetica.

Il sistema nervoso ha utilizzato delle strategie di controllo dell’espressione genica estremamente fini

che contribuiscono enormemente ad aumentare l’output proteico.

Tecniche utilizzate per lo studio del sistema nervoso: 1)sequenziamento: dal sequenziamento del

genoma dei diversi organismi si sono individuate famiglie multigeniche, è stato possibile ricostruire

il percorso evolutivo di organismi diversi attraverso l’allineamento della sequenza genica di diversi

organismi che appartengono a diversi step delle fasi evolutive 2)Una cosa importantissima che è

derivata dal sequenziamento del genoma è stata la possibilità di caratterizzare meglio i DNA

complementari che venivano ottenuti per trascrizione inversa dell’mRNA (cDNA), una volta

ottenuti questa DNA complementari clonati una tecnica che ormai è classica soprattutto per studi di

neuroscienze è quella di esprimere ad esempio un certo recettore ottenuto per clonaggio sulla base

di sequenze genomiche e di cDNA, quindi esprimere in seguito questi recettori all’interno di

organismi modello normalmente facili da manipolare come le uova di Xenopus. Le uova di

Xenopus sono un modello molto utile perché sono grosse e sotto un microscopio è possibile

microiniettare un plasmide che esprima ad esempio un recettore ionotropico e vedere come

l’espressione di questo recettore modifica il potenziale di membrana perché su queste uova si può

fare una misurazione elettrica 3) più recentemente si sono sviluppate tecniche di genomica

funzionale (analisi dei profili di espressione dei mRNA), proteomica e questo ha cominciato a porre

dei problemi perché i trascritti ottenuti da un certo genotipo erano molto di più di quelli previsti.

La tecnica di sequenziamento ora stà avendo un ritorno di gloria per l’introduzione di tecnologie di

tipo deep sequencing che è il sequenziamento di cDNA o genomi di diversi organismi su larga scala

e in tempi molto veloci si può sequenziale un grossissimo numero di paia di basi e ad esempio

vedere il profilo di espressione di un organismo che è stato sottoposto ad uno stress in un area

particolare come l’ippocampo rispetto ad un organismo di base che non ha subito lo stesso tipo di

manipolazione;quindi l’idea è di prendere il tessuto dell’ippocampo dall’organismo stressato

piuttosto che l’organismo naive quindi estrarre l’RNA farne il cDNA e poi con questa tecnica fare

un sequenziamento su larga scala e quello che ci si aspetta è che ci siano delle informazioni molto

più definitive di quelle che avevamo con l’uso di tecniche classiche di biologia molecolare.

Importante è anche la mouse neurogenetics: KI, KO, mutanti condizionali. Cioè creazione di

modelli animali su cui c’è stato un grossissimo investimento. Capire che problemi ha un topo è

molto difficile ossia creare un topo knock out per individuare la funzione di quella proteina che è

stata deleta in questo topo e dal fenotipo del topo dedurre questa funzione è molto difficile.

Questa tecnica si stà sviluppando sempre di più prima di tutto con la creazione di cliniche del topo

cioè il laboratorio crea il suo topo mutante ed il topo viene messo in una clinica del topo che fa un

check up completo e vede qual è il fenotipo e cioè qual’è la funzione alterata.

Le tecniche che stanno dando dati migliori sono tecniche che o fanno un knock in (inseriscono un

gene modificato) o un KO condizionale (cioè un KO solo in certi tessuti ed in certe fasi del topo e

questo risolve il problemna della letalità perché molto spesso non si riesce ad avere il topo perché

quel gene è fondamentale e dà letalità nell’embrione e l’organismo cerca di riassestarsi su questa

modificazione e quindi alla fine il fenotipo è alterato da diversi punti di vista che non sono più

indicativi del ruolo del nostro gene).

Una grossa fetta delle sue lezioni vertirà sulla descrizione del controllo dell’espressione genica nel

sistema nervoso ma prima di questo è necessario focalizzarsi su due concetti:

1) la complessità del sistema nervoso è insita nel sistema nervoso stesso per la sua funzione

(teleology), la funzione del sistema nervoso è di mediare l’interazione dell’organismo con

l’ambiente per permettere la sopravvivenza dell’individuo, la sopravvivenza della sua prole

e la sua riproduzione. Quindi per eseguire un compito così complesso era chiaro che

nell’evoluzione si sarebbero selezionate delle strutture estremamente complesse,

compartimentalizzate, ridondanti (che permette di sfruttare una via alternativa),

estremamente plastiche.

2) Il sistema nervoso è una struttura molto recente ed è il prodotto di un’evoluzione

lunghissima che ha portato alla creazione di varianti strutturali degli elementi stessi del

sistema nervoso.

Quello che noi sappiamo oggi riguarda molto i recettori di membrana che sono ionotropici e

accoppiati alle G proteine (detti anche metabotropici) questi recettori non solo nell’uomo ma già nel

verme appartengono a delle famiglie multigeniche.Quindi i recettori sono costituiti da proteine che

sono estremamente simili dal punto di vista della sequenza ma contengono delle piccole variazioni

che hanno un ruolo fondamentale nella loro funzione.Il sequenziamento di queste famiglie

multigeniche ha permesso di ricostruire la storia evolutiva di certi recettori ma anche

dell’organismo di appartenenza e ad esempio si è visto che i recettori ionotropici che appartengono

ad una famiglia contenente un grossissimo numero di isoproteine diverse in realtà tutti i recettori

ionotropici si possono dividere in due grosse classi che sono la classe dei recettori per il glutammato

e la classe il cui prototipo è il recettore nicotinico per l’acetilcolina.

Ciascuna classe deriva da un unico gene ancestrale che ha dato luogo ad un’estrema varietà di

recettori che differiscono in quanto specificità di

ligando ma differiscono anche nella localizzazione

in diverse aree e anche in proprietà funzionali.

Lo stesso dicasi per il recettore nicotinico

dell’acetilcolina che si è estremamente

differenziato ed ha avuto origine da un unico gene

ancestrale che codificava per un poro per cationi

metre la sottoclasse dei recettori per il GABA

deriva da un gene ancestral