Struttura e funzione dei tessuti umani

Introduzione (lezione 1)

Per studiare un campione istologico è necessario attuare un protocollo. Solitamente la procedura convenzionale che si segue prevede come primo passaggio la fissazione del tessuto. In alcuni casi si può ovviare la fissazione ed effettuare il congelamento a -182°C in azoto liquido. Questa tecnica è un’alternativa alla fissazione e qualora si decidesse di seguirla, è necessario attuare un protocollo diverso. Sia fissazione che congelamento servono per evitare la degradazione del tessuto. Bisogna considerare che ciò che limita queste tecniche è l’acqua, il componente prevalente in un tessuto. Quindi per poter preservare al meglio il tessuto è necessario eliminare l’acqua contenuta al suo interno (circa il 60-70%).

Con il congelamento si cerca di evitare che si formino dei cristalli perché questi potrebbero alterare la morfologia del tessuto, mentre con la fissazione (procedura che viene effettuata in ambiente liquido) si cerca di estrarre l’acqua e sostituirla con il fissativo (soluzione liquida). Dopodiché si passa alla colorazione del tessuto. Questo passaggio è importante perché qualsiasi sezione di tessuto che si osserva al microscopio è trasparente, a meno che in esso non siano presenti delle cellule pigmentate come melanociti che conferiscono una colorazione al tessuto. Questi coloranti interagiscono con i componenti molecolari della cellula (ovvero DNA, proteine, lipidi). In base al tipo di tessuto che si studia, si sceglie il tipo di colorazione da utilizzare.

Parametri di fissazione

La fissazione è una tecnica che va eseguita ad un giusto pH. Questo pH si sceglie in base al tipo di fissativo che si utilizza ed al tipo di tessuto che si vuole analizzare. Inoltre, può essere effettuata a temperatura ambiente (25°C), a temperature più basse (4°C) o addirittura si possono raggiungere i 37°C per effettuarla ad una temperatura fisiologica. Il parametro più importante del processo di fissazione è la penetrazione del fissativo nel tessuto che è direttamente correlato al volume del tessuto. Quindi più è spesso il tessuto, più lungo sarà il tempo di incubazione del tessuto nel fissativo (cioè calibrare il tempo di fissazione in base allo spessore del tessuto).

Altri parametri più fini che incidono nel processo sono il tipo di fissativo che si utilizza ed il tipo di tessuto che si analizza. Ad esempio, il tessuto osseo o il cartilagineo sono dei tessuti in cui il processo di fissazione è più lento rispetto al tessuto gelatinoso. Quindi è determinante anche la composizione del tessuto stesso.

Fissatori utilizzati

• Acido acetico: usato da solo al posto degli alcol o in piccole concentrazioni con alcol. Un altro componente alternativo è l’acetone.
• Formaldeide: presente nella sua forma più grezza, ovvero formalina al 10%. È un fissativo universale, è ottimo per la maggior parte dei tessuti. Con essa si ottiene un giusto compromesso tra mantenimento della morfologia e utilizzo di diverse colorazioni. Va bene per tutta la microscopia ottica. Se si vuole eseguire l’elettronica bisogna integrare (con la formalina) la glutaraldeide che fissa bene le strutture lipidiche a differenza della formaldeide che invece fissa molto bene proteine e carboidrati ma non lipidi.

Se si vogliono eseguire le fasi di congelamento è necessario eseguire un pre-fissaggio con etanolo o metanolo.

Processamento del tessuto: deidratazione, cleaning, embedding

Dopo avere eseguito le fasi di fissazione si procede con il processamento del tessuto, ovvero bisogna effettuare la deidratazione del tessuto per eliminare quel poco di liquido che rimane dalle procedure di fissazione. Si inizia con una percentuale di etanolo al 30% per poi aumentarla gradatamente fino al 99,5% (non si raggiunge mai il 100%). Successivamente si utilizza un solvente organico che rimuove l’eccesso di etanolo in un processo chiamato cleaning (lavaggio). Infine bisogna includere il tessuto in paraffina per renderlo visibile in microscopia ottica (fase di embedding). La paraffina viene sciolta a temperature elevate (>65°C), viene fatta leggermente raffreddare per lasciarla ancora fluida ed infine si procede con l’inclusione del campione in paraffina.

Quest’ultimo passaggio è fondamentale per l’osservazione del tessuto al microscopio ottico (per l’elettronico si utilizzano altre tecniche). L’inclusione è un processo che viene svolto a 55/56°C, ovvero a temperature più basse rispetto alla temperatura di bollitura della paraffina. L’intero processo di inclusione può essere effettuato interamente a mano oppure interamente automatizzato. Infine bisogna lasciare raffreddare in modo tale che si ottengano dei blocchetti di tessuto da cui si possano ricavare delle sezioni di tessuto. Queste sezioni sono ottenute dal microtomo, un macchinario costituito da una parte fissa con lama in acciaio ed una parte mobile in cui vengono posti i campioni. Quest’ultima parte oscillando avanti e indietro crea delle sottili fette di tessuto osservabili al microscopio ottico.

A livello rutinario lo spessore di taglio che si sceglie va dai 5 ai 10 μm. Ci sono altri strumenti, come il criostato (o criotomo) che servono per raffreddare e mantenere bassa la temperatura del campione (circa a -20°C). Sono strumenti che presentano un coperchio scorrevole in alto da cui si inserisce il campione e grazie alla presenza di una lama mobile (a differenza di quella del microtomo che è fissa) effettua il taglio del blocchetto che rimane fermo. Lo spessore di taglio che si ottiene è dai 10 ai 30 μm. Non si riescono ad ottenere delle fette sottili minori di 2 μm perché i polimeri utilizzati rimangono fluidi a temperature basse e solidi a temperatura ambiente. Quindi siccome queste sostanze a -20°C non solidificano come la paraffina è impensabile che si possano ottenere tagli così sottili.

Per l’utilizzo del microscopio elettronico, invece, è necessario utilizzare qualcosa di più resistente della paraffina, ovvero le resine. Esse hanno la stessa consistenza della plastica, sono molto dure e consentono di ottenere dei tagli sottili da 1 μm in giù (fino ai nm). In questo caso, lo strumento utilizzato per creare sezioni di tessuto è l’ultramicrotomo che ha una lama di diamante. Si usa questo tipo di lama perché solo il diamante riesce a tagliare le resine. L’ambiente in cui si lavora con questo strumento deve essere sterile perché si parla di nanometri quindi di tagli non visibili ad occhio nudo, di conseguenza nell’ambiente di lavoro non devono essere presenti vibrazioni che disturbano il taglio, spifferi d’aria e polvere. Tutto queste accortezze sono necessarie per ottenere un taglio preciso.

Staining (colorazione)

Dopo il taglio è necessario colorare la sezione di tessuto per poterlo osservare al microscopio. La colorazione più utilizzata è l’ematossilina/eosina. Per prima cosa è necessario eliminare la paraffina in eccesso presente nel tessuto e poi avviare la colorazione. L’ematossilina è un colorante che ha un’alta affinità per molecole acide e cariche negativamente come il DNA, quindi marca il nucleo, mentre l’eosina ha un’alta affinità per le proteine citoplasmatiche e marca il citosol della cellula.

Visualizzazione del campione

• Microscopio ottico: si serve di un fascio di luce diretto verso il campione.
• Scanning probe microscope (microscopio a forza atomica): utilizzo di una sonda. Viene usato per poter rilevare la topografia del campione, ovvero mette in evidenza le irregolarità del campione a livello superficiale. È molto utilizzato nelle industrie per saggiare la qualità dei materiali. In ambito biologico invece, riesce a far vedere la superficie delle cellule vive immerse nel liquido con la sonda.
• Microscopio elettronico a trasmissione: si serve di un fascio di elettroni che attraversa il campione, raggiunge un rilevatore e quest’ultimo ricostruisce l’immagine del campione. Sono microscopi che lavorano sotto vuoto. La rilevazione del campione dipende da tanti fattori, ovvero dalla preparazione del campione, dalla composizione stessa del tessuto da analizzare e dalla complessità dello strumento utilizzato.
• Microscopio elettronico a scansione: lavora con la stessa logica di quello a trasmissione. Scannerizza il campione sulla superficie e viene utilizzato dagli entomologi per la classificazione degli insetti.

Tessuti (lezione 2)

Tessuto epiteliale

Il principale tessuto nel nostro corpo è il tessuto epiteliale, presente soprattutto nella cute e nelle cavità degli organi interni. Di questo tessuto di può fare una ulteriore suddivisione: epiteli di rivestimento ed epiteli di secrezione. Il principale epitelio di rivestimento è la cute; ma anche organi interni come apparato digerente e respiratorio, che presentano strutture tubulari. Il tessuto epiteliale di secrezione invece è quello che per definizione si trova in tutti i piccoli organi, strutture che presentano ghiandole, che sono deputate a secernere materiale (muco e composti molecolari più complessi).

A livello embrionale questo tessuto ha la peculiarità di derivare da tutti e tre i foglietti embrionali; infatti nelle prime fasi di sviluppo si ha, a seconda delle specie, l’embrione è una struttura discoide (negli uccelli), nei mammiferi e anche nell’uomo è una struttura ovale. Come composizione interna ritroviamo 3 strutture che sono i foglietti embrionali ectoderma, mesoderma, endoderma. In altre specie animali meno evolute (dove è presente una struttura sferica dell’embrione) l’epitelio riveste tutto l’esterno, il mesoderma e l’endoderma sono localizzati internamente. Questa peculiarità non vale per gli altri tessuti; infatti il tessuto connettivo e il tessuto muscolare derivano esclusivamente dal mesoderma, mentre il tessuto nervoso origina dall’ectoderma.

Il tessuto epiteliale presenta delle caratteristiche: le cellule sono altamente polarizzate e questa polarizzazione deve essere mantenuta per garantire il corretto funzionamento delle cellule stesse e in ultima analisi per consentire il funzionamento dell’organo in questione. Inoltre è un tessuto coeso, cioè le cellule sono strettamente coese tra di loro e questo garantisce una certa contiguità. Inoltre il tessuto epiteliale è ancorato al resto del corpo; il mancato ancoraggio di questo tessuto comporta serissimi problemi molto spesso fatali. È un tessuto avascolare, cioè non contiene vasi all’interno ma i vasi si trovano tutti intorno al tessuto. Sorge una problematica: bisogna capire se il tessuto epiteliale è in grado di autorigenerarsi oppure c’è qualche altra struttura che partecipa al processo di rigenerazione.

Questo dipende dall’età anagrafica dell’individuo, se la persona è giovane il tessuto epiteliale sta quasi alla pari con l’osso e la cartilagine. Se la persona è anziana il tessuto epiteliale è nettamente superiore. Il tessuto per definizione si organizza in “mantelli” e anche in diversi strati (cioè multipli strati cellulari). Tornando alla polarità distinguiamo porzione apicale, porzione basale o basolaterale. Nella parte apicale ritroviamo le giunzioni strette che non fanno passare nessuna molecola e giunzioni aderenti che tengono le cellule unite, ma nella regione basale sono presenti le giunzioni comunicanti.

Coesione: a livello della matrice extracellulare chiamata anche lamina basale o membrana basale. Se facciamo una sezione trasversale del tessuto epiteliale (lungo l’asse di polarità) vedremo la parte più apicale con la corteccia cellulare con molti filamenti di actina accumulati a livello delle giunzioni strette, poi troveremo le giunzioni ancoranti caderiniche e nella parte sottostante troviamo i desmosomi, infine la porzione basolaterale deputata alla comunicazione tra le cellule e ancoraggio.

Membrana basale: composta da lamina lucida, lamina densa e lamina reticolare. Quando si è iniziato a fare colorazioni istologiche, soprattutto volte a evidenziare il tessuto epiteliale, si è visto che a livello microscopico era presente una parte chiara, una più scura e una dove erano presenti reti molecolari. Quando poi si è iniziato a studiare la membrana basale anche in situ, cioè sul tessuto stesso, con tecniche di colorazioni più sofisticate non si vedevano più le differenze ma comunque si riconosceva il punto di contatto della membrana basale con la cellula a livello emidesmosomico, dove ci sono molecole ancorate alla superficie cellulare e a questo livello c’è una maggiore densità proteica data da una maggiore quantità di recettori. Le fibre collageniche (soprattutto collagene 4 e 8), che sono a contatto con la membrana basale e iniziano dove termina la membrana basale, creano la struttura a rete.

Vascolarizzazione: è un tessuto avascolarizzato e la vascolarizzazione arriva dal tessuto connettivo che gli sta a ridosso.

Cute: è uno degli epiteli più stratificati ed è normale che sia tale perché è la parte esposta verso l’esterno. Ci sono almeno 5 strati cellulari: uno strato basale, dove ritroviamo le cellule staminali della cute, che è a diretto contatto con la membrana basale. Molte di queste cellule sono in proliferazione, mentre le cellule staminali sono molto spesso in fase quiescente. Per il fatto che le cellule proliferano si può parlare di rigenerazione e rimodellamento (es. scottature). Avviene rigenerazione e riparazione quando ci sono dei danni. Una parte intermedia, strato spinoso, deriva da una cellula basale che si è divisa. Presenta cellule altamente immature, non specializzate.

Il successivo è lo strato granulare, in cui le cellule hanno subìto tutto il processo di maturazione e differenziamento e sono arrivate a formare il fenotipo finale che nella cute si chiama cheratinocita. Da qui in poi il cheratinocita va incontro a una ipermaturazione e va incontro a una morte programmata formando lo strato cornificato. Questo strato è quello più esterno e le cellule che lo compongono non sono solo quelle derivanti dalla morte programmata ma anche dalla matrice extracellulare complessata e riorganizzata in una struttura solida.

Classificazione dei tessuti epiteliali

Esiste una classificazione che si basa sulla stratificazione delle cellule; ci sono cellule singole, oppure tessuto stratificato (classico esempio è la cute). Possiamo avere anche tessuti pseudo stratificato, è composto solo da due strati cellulari, però le cellule non sono perfettamente allineate ma distribuite in modo più o meno casuale. Inoltre se guardiamo la geometria delle cellule avremo tessuto epiteliale stratificato cuboidale, t. e. s. colonnare, t. e. s. squamoso. La parte apicale della membrana del tessuto epiteliali è predisposto ad avere una serie di interazioni con la parte più interna; ricordiamo che non bisogna pensare solo alla cute, perché il tessuto epiteliale presente all’interno del corpo ha la porzione apicale che è a contatto con altre cellule e quindi c’è interazione. A livello strutturale questa porzione apicale può contenere delle strutture aggiuntive che sono microvilli, stereociglia, e ciglia. Sono tutti collegati con il citoscheletro actinico della corteccia (cioè la parte sottostante la membrana cellulare); i primi due tipi sono costituiti da microfilamenti di actina, il terzo tipo è composto da microtubuli ed è quasi esclusivamente presente nell’apparato uditorio in piccola parte nell’apparato urogenitale. Gli altri due tipi invece sono più diffusi ad es. nell’apparato respiratorio e apparato digerente (sono presenti anche in alcune ghiandole).

Tessuto connettivo

È quello deputato al riempimento degli spazi tra gli altri tipi di tessuti (epiteliale, muscolare e nervoso) e gli organi, ma anche all’interno degli organi stessi. Si può distinguere un tessuto connettivo lasso e un tessuto connettivo denso. Il primo lo ritroviamo nel derma (sotto la cute) oppure intorno a molti organi, ad esempio. Il secondo invece va a comporre le ossa e la cartilagine. La cartilagine, come il muscolo, non ha un meccanismo di riparazione così evoluto (a differenza dell’epiteli), così come l’osso. In presenza di disfunzioni a questo livello la capacità rigenerativa diventa molto bassa. Ad esempio, in presenza di situazioni autoimmuni si ha l’artrite reumatoide che è una delle patologie più diffuse al mondo. Un tipo di tessuto connettivo è il tessuto adiposo.

Tessuto muscolare

Muscolo scheletrico (prevalente), che è quello sotto il controllo della nostra volontà grazie agli impulsi nervosi. Muscolo liscio, involontario, presente soprattutto nei vasi e a livello intestinale. Tessuto muscolare cardiaco, il cuore. Ha una più bassa capacità rigenerativa rispetto all’epitelio (pensiamo alle distrofie muscolari). Anche qui c’è la problematica dell’età: ad esempio uno strappo muscolare in giovane età è facilmente recuperabile, man mano che l’età aumenta è sempre più difficile.

Tessuto nervoso

Dobbiamo distinguere due tipi di sistema nervoso (SNC, Sistema nervoso centrale e SNP, Sistema nervoso periferico) e di conseguenza anche i tessuti che li compongono sono diversi perché cambiano i fenotipi cellulari.

Specializzazioni degli epiteli (lezione 3)

Giunzioni strette o tight junction: presenti nella parte più apicale per prevenire il passaggio di molecole fra due cellule. Queste giunzioni sono visibili solo