sistemi biomimetici

12/03/19

(Ciofani)

Fotopolimerizzazione a due fotoni

La fotolitografia tradizionale (approfondita nel corso di bionanotecnologie) è un

processo utilizzato in ambito elettronico che si basa su un film chimico,

substrato reattivo dal punto di vista chimico e una sorgente irradiante che va a

modificare le proprietà chimiche di questa resina. È u processo fondamentale

che consente di realizzare strutture molto precise e complesse ma con una

seire di limitazioni fra cui: siamo costretti a lavorare in una situazione

bidimensionale, non si riescono a ottenere costrutti 3D se non con processi

molto complessi e non troppo efficienti. La litografia è uno dei 4 processi

fondamentali di lavorazione nanotecnologica top-down, essenzialmente da un

substrato chimico (resist) sensibile a una determinata lunghezza d’onda (in

genere si lavora nell’UV) e quando viene colpito da questa radiazione cambia le

sue proprietà di solubilità. Per andare a microstrutturare una superficie

realizzata con questo resist ci occorre una maschera attraverso la quale passa

un fascio di luce che avrà la geometria che noi vogliamo realizzare sul resist. La

luce passa attraverso questa maschera, variando le proprietà chimiche del

resist in tutte le zone che vengono colpite. Questo processo ha una serie di

difficoltà che rendono impegnativo ottenere delle strutture a una risoluzione

molto alta o strutture complesse tridimensionali. A seconda della tipologia del

resist possiamo rendere solubile o insolubile il substrato. Dopo questo processo

si fa un bagno in un solvente che elimina le porzioni di resist superflue. La

prima difficoltà di questo processo sta nella realizzazione della maschera che

deve essere trasparente alla radiazione. Servono materiali ad alta prestazione

mentre il pattern deve essere in grado di schermare il passaggio della luce.

Inoltre non si possono ottenere delle strutture che sono più piccole della

lunghezza d’onda del fascio luminoso problema della risoluzione. Infine



rimane sempre il problema della tridimensionalità, con degli strati troppo spessi

di resist non si riesce a selezionare un punto ben preciso, quando la radiazione

incontra la superficie del resist polimerizza solo il primo strato che incontra

dopo di che viene fermata. Anche con resist molto spessi se ne lavora solo la

superficie. Anche avendo una radiazione luminosa in grado di attraversare il

resist vado a colpire tutto lo spessore del resist senza riuscire a variarne le

proprietà chimiche di tutto il volume ma solo di quella parte che viene colpita

dalla radiazione luminosa. A seconda delle proprietà del resist si parla di

fotoresist positivo se questo diventa solubile dopo l’esposizione, durante il

processo di sviluppo il fotoresist positivo che non è stato colpito dalla

radiazione luminosa rimane mentre quello che è stato colpito viene lavato via.

Il fotoresist negativo ha il comportamento opposto, quando viene esposto

diventa insolubile, durante il lavaggio viene via tutta la porzione di resist che

non è stata colpita durante la radiazione luminosa.

La fotopolimerizzazione a due fotoni nasce dalla necessità di superare

l’impossibilità di realizzare strutture 3D, la macchinosità del processo

fotolitografico, la presenza della maschera che è difficilmente realizzabile.

Alcuni tentativi son stati fatti per superare questi limiti e alla fine la

fotolitografia a due fotoni si è dimostrata la scelta vincente per superare questi

limiti. La fotolitografia a due fotoni impiega una diversa sorgente luminosa:

utilizziamo una sorgente luminosa nell’infrarosso e nel vicino infrarosso a patto

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però di utilizzare dei laser a due fotoni, che siano in grado di far arrivare al

substrato due fotoni in un tempo molto ristretto in modo che il substrato veda

questi due fotoni arrivare contemporaneamente. È un processo non lineare,

non siamo più legati ai limiti della diffrazione ottica andando oltre alla

lunghezza d’onda utilizzata. Si lavora con due fotoni a una lunghezza d’onda

tale per cui la maggioranza dei materiali con cui si lavora sono trasparenti. Il

materiale per cambiare le sue proprietà chimiche deve percepire l’arrivo di

questi due fotoni nello stesso momento, attraverso un sistema di lenti a valle

del laser si riesce a indirizzare il fascio laser in un box ben preciso all’interno

del resist in modo che solo quel box subisca la modificazione delle proprietà

chimiche. Diventa possibile con un sistema confocale indirizzare i fotoni in un

box preciso del materiale. I due fotoni sono nel vicino infrarosso, arrivando

contemporaneamente hanno lo stesso pacchetto energetico che avrebbe un

singolo fotone alla metà della lunghezza d’onda, riusciamo quindi a lavorare

materiali sensibili nell’ultravioletto ma che riusciamo a penetrare in profondità

ottenendo delle strutture tridimensionali. Lavorando un laser che può essere

focalizzato anche lungo l’asse z non è più necessaria la maschera. Il tempo

dell’operatore è molto ridotto rispetto alla stereolitografia, il tempo di

lavorazione però può essere molto molto lungo, limite principale di questa

tecnologia. Per realizzare superfici estese o complesse sono necessari dei

tempi di lavorazione molto lunghi, anche 3-4 giorni.

Si parte dal substrato che in genere è un vetrino, si deposita il fotoresist e si

dice alla macchina la struttura che vogliamo realizzare e si da il via. Il laser

disegna la struttura tridimensionale, al termine abbiamo la struttura 3D

desiderata e si procede allo sviluppo col lavaggio. I vantaggi sono l’assenza di

maschera, possibilità di strutture tridimensionali e con una definizione che va

oltre il limite della lunghezza d’onda del laser. Gli svantaggi principali sono la

lentezza della tecnica e il costo della macchina (mezzo milione di euro). Questi

due inconveniente hanno rallentato un pochino la diffusione di questi sistemi

ma si stanno comunque diffondendo (5 in Italia).

Sono stati sviluppati dei fotoresist che derivano da polimeri naturali modificati

in modo da poter essere lavorati con i due fotoni (collagene e gelatina

modificati e resi reattivi all’ultravioletto).

La macchina è lenta ma ha un sistema di automatizzazione molto sviluppato, si

possono programmare anche 10 strutture diverse e andarle a recuperare dopo

una settimana. Le applicazioni sono molte, è nata per applicazioni in fotonica,

microfisica. Vengono utilizzati anche dei materiali per ottenere delle maschere

che poi servono da … per la lavorazione di materiali che non possono essere

impiegati in questo processo. Vengono realizzate delle maschere con un resist

e poi viene depositato l’oro all’interno di queste maschere per ottenere delle

risoluzioni molto buone non ottenibili con i metodi tradizionali.

Il problema della lentezza della macchina si ripercuote sulla possibilità di

ottenere strutture abbastanza grandi in tempi accettabili, la macchina essendo

molto complessa è molto sensibile anche alle variazioni ambientali

(temperatura e umidità) ed è molto difficile tenere costanti questi parametri

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(Tonda Turo)

Ci interessa ottenere dei supporti biomimeticità per influenzare la

differeziazione cellulare. quello che si perde completamente sono i fattori

solubili che non sono legati a una struttura quindi nella fase di

decellularizzazione questa parte viene rimossa. La matrice decellularizzata

deve essere colonizzata dalle cellule prima di essere impiantato nel paziente.

Fegato decellularizzato e ricellularizzato e poi impiantato all’interno di un

animale, la ricellularizzazione si osserva che il tessuto viene ripopolato con

un’organizzazione anche abbastanza complessa. Anche nell’approccio di

ricellularizzazione ci sono una serie di variabili: il metodo di ricellularizzazione

comporta diversi valori del numero di cellule che vanno a ripopolare il tessuto

(fino a 100 milioni di cellule). L’ECM decellularizzata può anche non mantenere

la struttura 3D ottenendo delle matrici decellularizzate, che contengono i

componenti ma non viene mantenuta la micro e la macro struttura. Si ottiene

una polvere multiproteica. È stato il primo approccio di matrici decellularizzate,

vengono poi processati attraverso tecnologie avanzate come il 3D printing

realizzando degli idrogeli che diventano un ambiente estremamente utile per la

sopravvivenza cellulare. questo approccio è uno dei più utilizzati nello sviluppo

di strutture 3D tramite 3D printing, ottenendo questa polvere dal tessuto

specifico e poi utilizzarlo come la base per la costruzione dello scaffold. La

possibilità di poter partire da una matrice decellularizzata patologica ci

permette di creare dei modelli più affini al tessuto originale anche a livello

patologico.

La struttura 3D è data dalla fase di processing, il materiale è un materiale

similfisiologico. Questa è la strategia maggiormente applicata. Il principale

problema associato alla ricellularizzazione dello scaffold è quello che nella fase

di ricellularizzazione in vitro non si riesce a ottenere una distribuzione uniforme

delle cellule nello scaffold. Usando tecniche di 3D printing posso formare lo

scaffold layer by layer, le cellule sono distribuite all’interno dello scaffold nella

fase di processo e non devo fare una fase successiva di semina. Di fatto quello

che si cerca di fare è ottenere queste matrice in forma di polvere, ottenere

biomateriali utilizzabili nelle tecnologie 3d printing e viene sfruttata la

caratteristica di termosensibilità di questi materiali, la temperatura corporea è

superiore alla temperatura ambiente quindi sfruttando questa differenza si può

passare da una soluzione facilmente processabile quindi liquida a una soluzione

a 37 gradi con una maggiore viscosità in grado di mantenere una struttura

tridimensionale complessa. Diverse popolazioni cellulari, tessuto specifico.

Volendo ottenere un tessuto cartilagineo si utilizzano condrociti immersi in un

idrogelo di ECM derivata dalla cartilagine, per il tessuto cardiaco si inseriranno i

cardiomiociti in ECM cardiaca…

Inizialmente quindi venivano decellularizzati i tessuti ottenendo delle polverine

che venivano usate per colmare lacune tissutali, poi si è cercato di mantenere

la struttura e attualmente vengono utilizzati come biomateriali di partenza per

creare degli idrogeli tessuto-specifici.

L’ecm può essere mimata utilizzando degli scaffold, abbiamo visto la matrice

decellularizzata che però non riesce a ripercorrere le quattro caratteristiche ella

matrice fisiologica. Non si riesce a mantenere la parte delle proprietà fisico-

chimiche e i fattori solubili che vengono rimossi durante le fasi di

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decellularizzazione quindi non si possono usare le matrici decellularizzate per

fare richiamo in vivo delle cellule una volta impiantato lo scaffold.

Osservando l’ECM vediamo che le cellule si trovano immerse in questa

struttura, sono completamente circondate da questa struttura principalmente

fibrosa che avvolgono e ricoprono completamente le cellule, con questa

struttura le cellule interagiscono. Bisogna andare verso delle tecnologie che ci

permettano di superare questi limiti, tra le tecnologie disponibili per mimare

l’ECM quella più utilizzata è la tecnologia dell’elettrospinning che prevede di

partire da una soluzione polimerica di materiale variabile e processarlo per

ottenere una struttura che mima l’ECM perché si ottengono delle fibre molto

piccole in conformazione random. Non è banale ottenere delle strutture che

mimino l’ECM perché la scala è molto piccola, è molto difficile raggiungere

delle definizioni nanometriche. Ci interessa arrivare a una scala nanometrica

perché le cellule sono immerse nella matrice perché formano nella

tridimensionalità della struttura dei legami in tutte le direzioni. I legami cellula

substrato rientreranno nelle dimensioni nanometriche quindi bisogna riformare

questa struttura per avere biomimeticità. Per questo motivo l’elettrospinning è

molto utilizzato perché si riescono ad ottenere queste scale con uno strumento

abbastanza banale che sfrutta una ddp: una soluzione polimerica caricata

all’interno di una siringa collegata a una pompa. La siringa è connessa a un

generatore di tensione che ha come polo opposto un collettore che può essere

piano o rotante che permettono di ottenere diverse orientazioni delle fibre

8random o allineate). La ddp che si genera permette di caricare la soluzione

polimerica e la direziona verso il collettore che la attrae e durante la fase di

volo le interazioni nella soluzione polimerica fanno si che il getto si rompa

formando delle fibre sempre più piccole. Quella che raggiunge il collettore è

una fibra rotta di dimensioni molto piccole. Nella fase di volo evapora il

solvente quindi sul collettore ottengo una matrice che ha rimosso il solvente ed

è composta solo da soluto, la componente di solvente viene fatta evaporare. il

processo è piuttosto semplice, non richiede un’attrezzatura particolarmente

complessa, il sistema è molto utilizzato anche per questo motivo.

L’elettrospinning quindi permette di mimare la morfologia della matrice, oltre

alla morfologia si deve curare la composizione che ha un effetto rilevante sulle

proprietà chimico-fisiche del susbstrato. I materiali processabili tramite

elettrospinning sono quasi tutti però si devono usare dei solventi che non

rimangono all’interno della struttura perché sono quasi tutti citotossici (esclusa

l’acqua). Si possono usare materiali di origine sintetica e di origine naturale

(gelatina, collagene…) che però hanno la problematica di non essere ripetibili

nella fornitura, si utilizzano dei materiali bioartificiali. Si possono anche

spinnare delle matrici più simili al tessuto osseo a cui vengono aggiunti fosfati

di calcio (idrossiapatite).

Per aggiungere degli stimoli solubili attraverso l’elettrospinning si può

implementare il sistema per avere una morfologia adeguata, ottenere la

composizione ottimale e aggiungere dei fattori solubili all’interno della

struttura. Con fattori solubili si intendono principalmente i fattori di crescita che

sono popolazoni di proteine che si trovano nell’ambiente extracellulare, non

sono legati a nulla, interagiscono coi recettori di membrana attivando una

cascata di eventi che raggiunge il nucleo attivando processi di codifica genica.

Sono dei messaggeri che interagiscono con la membrana dando informazioni di

attivare qualche processo interno. Questi fattori sono prodotti solitamente dalle

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cellule che poi ne influenzano il comportamento. Un approccio alternativo è la

terapia genica che di fatto invece di permetterci di rilasciare nel sistema un

sistema che da una determinata informazione possiamo unserire nell’ambiente

un elemento che può essere integrato nel genoma cellulare delle cellule

presenti influenzandole a rilasciare dei fattori solubili. Infatti andando

semplicemente a inserire questi fattori solubili nello scaffold questi prima o poi

terminano. Andando a modificare le cellule in situ posso direttamente

influenzare questo processo rendendo le cellule produttrici del fattore di

crescita voluto. È minore la probabilità di terminare il fattore di crescita. Mentre

i fattori di crescita sono molecole da sole per la terapia genica l’elemento

funzionale di solito viene incorporato all’interno di un vettore perché questo

fattore deve entrare nel nucleo per avere un effetto quindi il vettore che lo

trasporta deve essere in grado di portarlo nel nucleo e di proteggerlo. Il

delivery genico deve essere fatto su DNA. Quello che è importante nella

definizione del processo ideale di incapsulamento di biomolecola (fattore di

crescita o vettore) è che questi fattori devono raggiungere il sito attivo

mantenendo la loro funzionalità, sono molecola molto sensibili alle condizioni

esterne e le modifiche dell’ambiente circostante possono andare a denaturarle,

l’obiettivo finale è quello di mantenere la bioattività di queste molecole. La

cinetica di rilascio inoltre deve essere tale da permettere di avere un effettivo

beneficio fisiologico, se non ottengo il quantitativo limite per avere un’attività

funzionale non riesco a influenzare una popolazione di cellule abbastanza alta

per attivare il processo rigenerativo. È fondamentale che si raggiunga il livello

minimo di funzionalità. Sapere quanto vale questa soglia è praticamente

impossibile, dal punto di vista teorico si prendono diversi quantitativi di

biomolecola, si trattano popolazioni cellulari e a diversi quantitativi vedo qual è

il uantitativo che da la risposta migliore una volta trovato il livello soglia posso

capire quanta biomolecola mettere, approcci sperimentale, non si ricava da

informazioni fisiologiche. Una vlta trovato questo livello soglia devo definire

una metodologia appropriata per inserire la biomolecola nello scaffold.

19/03/18

(Ciofani)

Ingegnerizzazione del tessuto nervoso

Il sistema nervoso svolge prevalentemente tre funzioni

Funzione sensoriale per monitorare l’ambiente sia esterno che interno

 Una funzione motoria che ci permette il movimento

 Funzionalità di integrazione, interpretazione dei segnali sensoriali che

 arrivano dalle fibre afferenti, l’integrazione ad alta scala che ci permette

di decidere cosa fare attraverso il sistema motorio

Il sistema nervoso si può suddividere il due parti: sistema nervoso centrale e

periferico.

Il sistema nervoso centrale è costituito dal cervello e dal midollo spinale, a

partire dal sistema nervoso centrale dipartono tutti i sistemi che afferiscono al

sistema periferico che comprende tutto il tessuto neuronale nel sistema

centrale, tutte le strutture