sistemi biomimetici

Fotopolimerizzazione a due fotoni

La fotolitografia tradizionale (approfondita nel corso di bionanotecnologie) è un processo utilizzato in ambito elettronico che si basa su un film chimico, substrato reattivo dal punto di vista chimico e una sorgente irradiante che va a modificare le proprietà chimiche di questa resina. È un processo fondamentale che consente di realizzare strutture molto precise e complesse ma con una seria di limitazioni fra cui: siamo costretti a lavorare in una situazione bidimensionale, non si riescono a ottenere costrutti 3D se non con processi molto complessi e non troppo efficienti.

La litografia è uno dei 4 processi fondamentali di lavorazione nanotecnologica top-down, essenzialmente da un substrato chimico (resist) sensibile a una determinata lunghezza d'onda (in genere si lavora nell'UV) e quando viene colpito da questa radiazione cambia le sue proprietà di solubilità. Per andare a microstrutturare una superficie realizzata con questo resist ci occorre una maschera attraverso la quale passa un fascio di luce che avrà la geometria che noi vogliamo realizzare sul resist. La luce passa attraverso questa maschera, variando le proprietà chimiche del resist in tutte le zone che vengono colpite.

Questo processo ha una serie di difficoltà che rendono impegnativo ottenere delle strutture a una risoluzione molto alta o strutture complesse tridimensionali. A seconda della tipologia del resist possiamo rendere solubile o insolubile il substrato. Dopo questo processo si fa un bagno in un solvente che elimina le porzioni di resist superflue. La prima difficoltà di questo processo sta nella realizzazione della maschera che deve essere trasparente alla radiazione. Servono materiali ad alta prestazione mentre il pattern deve essere in grado di schermare il passaggio della luce.

Inoltre non si possono ottenere delle strutture che sono più piccole della lunghezza d'onda del fascio luminoso, problema della risoluzione. Infine, rimane sempre il problema della tridimensionalità, con degli strati troppo spessi di resist non si riesce a selezionare un punto ben preciso, quando la radiazione incontra la superficie del resist polimerizza solo il primo strato che incontra dopo di che viene fermata. Anche con resist molto spessi se ne lavora solo la superficie.

Anche avendo una radiazione luminosa in grado di attraversare il resist, vado a colpire tutto lo spessore del resist senza riuscire a variarne le proprietà chimiche di tutto il volume ma solo di quella parte che viene colpita dalla radiazione luminosa. A seconda delle proprietà del resist si parla di fotoresist positivo se questo diventa solubile dopo l'esposizione; durante il processo di sviluppo il fotoresist positivo che non è stato colpito dalla radiazione luminosa rimane mentre quello che è stato colpito viene lavato via. Il fotoresist negativo ha il comportamento opposto, quando viene esposto diventa insolubile; durante il lavaggio viene via tutta la porzione di resist che non è stata colpita durante la radiazione luminosa.

La fotopolimerizzazione a due fotoni

La fotopolimerizzazione a due fotoni nasce dalla necessità di superare l'impossibilità di realizzare strutture 3D, la macchinosità del processo fotolitografico, la presenza della maschera che è difficilmente realizzabile. Alcuni tentativi sono stati fatti per superare questi limiti e alla fine la fotolitografia a due fotoni si è dimostrata la scelta vincente per superare questi limiti.

La fotolitografia a due fotoni impiega una diversa sorgente luminosa: utilizziamo una sorgente luminosa nell'infrarosso e nel vicino infrarosso a patto però di utilizzare dei laser a due fotoni, che siano in grado di far arrivare al substrato due fotoni in un tempo molto ristretto in modo che il substrato veda questi due fotoni arrivare contemporaneamente. È un processo non lineare, non siamo più legati ai limiti della diffrazione ottica andando oltre alla lunghezza d'onda utilizzata.

Si lavora con due fotoni a una lunghezza d'onda tale per cui la maggioranza dei materiali con cui si lavora sono trasparenti. Il materiale per cambiare le sue proprietà chimiche deve percepire l'arrivo di questi due fotoni nello stesso momento, attraverso un sistema di lenti a valle del laser si riesce a indirizzare il fascio laser in un box ben preciso all'interno del resist in modo che solo quel box subisca la modificazione delle proprietà chimiche.

Diventa possibile con un sistema confocale indirizzare i fotoni in un box preciso del materiale. I due fotoni sono nel vicino infrarosso, arrivando contemporaneamente hanno lo stesso pacchetto energetico che avrebbe un singolo fotone alla metà della lunghezza d'onda, riusciamo quindi a lavorare materiali sensibili nell'ultravioletto ma che riusciamo a penetrare in profondità ottenendo delle strutture tridimensionali. Lavorando un laser che può essere focalizzato anche lungo l'asse z non è più necessaria la maschera.

Il tempo dell'operatore è molto ridotto rispetto alla stereolitografia, il tempo di lavorazione però può essere molto molto lungo, limite principale di questa tecnologia. Per realizzare superfici estese o complesse sono necessari dei tempi di lavorazione molto lunghi, anche 3-4 giorni. Si parte dal substrato che in genere è un vetrino, si deposita il fotoresist e si dice alla macchina la struttura che vogliamo realizzare e si dà il via. Il laser disegna la struttura tridimensionale, al termine abbiamo la struttura 3D desiderata e si procede allo sviluppo col lavaggio.

I vantaggi sono l'assenza di maschera, possibilità di strutture tridimensionali e con una definizione che va oltre il limite della lunghezza d'onda del laser. Gli svantaggi principali sono la lentezza della tecnica e il costo della macchina (mezzo milione di euro). Questi due inconveniente hanno rallentato un pochino la diffusione di questi sistemi ma si stanno comunque diffondendo (5 in Italia).

Sono stati sviluppati dei fotoresist che derivano da polimeri naturali modificati in modo da poter essere lavorati con i due fotoni (collagene e gelatina modificati e resi reattivi all'ultravioletto). La macchina è lenta ma ha un sistema di automatizzazione molto sviluppato, si possono programmare anche 10 strutture diverse e andarle a recuperare dopo una settimana. Le applicazioni sono molte, è nata per applicazioni in fotonica, microfisica.

Vengono utilizzati anche dei materiali per ottenere delle maschere che poi servono da … per la lavorazione di materiali che non possono essere impiegati in questo processo. Vengono realizzate delle maschere con un resist e poi viene depositato l'oro all'interno di queste maschere per ottenere delle risoluzioni molto buone non ottenibili con i metodi tradizionali. Il problema della lentezza della macchina si ripercuote sulla possibilità di ottenere strutture abbastanza grandi in tempi accettabili, la macchina essendo molto complessa è molto sensibile anche alle variazioni ambientali (temperatura e umidità) ed è molto difficile tenere costanti questi parametri.

Supporti biomimetici per la differenziazione cellulare

Ci interessa ottenere dei supporti biomimetici per influenzare la differenziazione cellulare. Quello che si perde completamente sono i fattori solubili che non sono legati a una struttura quindi nella fase di decellularizzazione questa parte viene rimossa. La matrice decellularizzata deve essere colonizzata dalle cellule prima di essere impiantato nel paziente. Fegato decellularizzato e ricellularizzato e poi impiantato all'interno di un animale, la ricellularizzazione si osserva che il tessuto viene ripopolato con un'organizzazione anche abbastanza complessa.

Anche nell'approccio di ricellularizzazione ci sono una serie di variabili: il metodo di ricellularizzazione comporta diversi valori del numero di cellule che vanno a ripopolare il tessuto (fino a 100 milioni di cellule). L'ECM decellularizzata può anche non mantenere la struttura 3D ottenendo delle matrici decellularizzate, che contengono i componenti ma non viene mantenuta la micro e la macro struttura. Si ottiene una polvere multiproteica. È stato il primo approccio di matrici decellularizzate, vengono poi processati attraverso tecnologie avanzate come il 3D printing realizzando degli idrogeli che diventano un ambiente estremamente utile per la sopravvivenza cellulare.

Questo approccio è uno dei più utilizzati nello sviluppo di strutture 3D tramite 3D printing, ottenendo questa polvere dal tessuto specifico e poi utilizzarlo come la base per la costruzione dello scaffold. La possibilità di poter partire da una matrice decellularizzata patologica ci permette di creare dei modelli più affini al tessuto originale anche a livello patologico. La struttura 3D è data dalla fase di processing, il materiale è un materiale similfisiologico. Questa è la strategia maggiormente applicata.

Il principale problema associato alla ricellularizzazione dello scaffold è quello che nella fase di ricellularizzazione in vitro non si riesce a ottenere una distribuzione uniforme delle cellule nello scaffold. Usando tecniche di 3D printing posso formare lo scaffold layer by layer, le cellule sono distribuite all'interno dello scaffold nella fase di processo e non devo fare una fase successiva di semina. Di fatto quello che si cerca di fare è ottenere queste matrice in forma di polvere, ottenere biomateriali utilizzabili nelle tecnologie 3D printing e viene sfruttata la caratteristica di termosensibilità di questi materiali, la temperatura corporea è superiore alla temperatura ambiente quindi sfruttando questa differenza si può passare da una soluzione facilmente processabile quindi liquida a una soluzione a 37 gradi con una maggiore viscosità in grado di mantenere una struttura tridimensionale complessa.

Diverse popolazioni cellulari, tessuto specifico. Volendo ottenere un tessuto cartilagineo si utilizzano condrociti immersi in un idrogelo di ECM derivata dalla cartilagine, per il tessuto cardiaco si inseriranno i cardiomiociti in ECM cardiaca… Inizialmente quindi venivano decellularizzati i tessuti ottenendo delle polverine che venivano usate per colmare lacune tissutali, poi si è cercato di mantenere la struttura e attualmente vengono utilizzati come biomateriali di partenza per creare degli idrogeli tessuto-specifici.

L'ecm può essere mimata utilizzando degli scaffold, abbiamo visto la matrice decellularizzata che però non riesce a ripercorrere le quattro caratteristiche della matrice fisiologica. Non si riesce a mantenere la parte delle proprietà fisico-chimiche e i fattori solubili che vengono rimossi durante le fasi di decellularizzazione quindi non si possono usare le matrici decellularizzate per fare richiamo in vivo delle cellule una volta impiantato lo scaffold. Osservando l'ECM vediamo che le cellule si trovano immerse in questa struttura, sono completamente circondate da questa struttura principalmente fibrosa che avvolgono e ricoprono completamente le cellule, con questa struttura le cellule interagiscono.

Elettrospinning: tecnologia per mimare l'ECM

Bisogna andare verso delle tecnologie che ci permettano di superare questi limiti, tra le tecnologie disponibili per mimare l'ECM quella più utilizzata è la tecnologia dell'elettrospinning che prevede di partire da una soluzione polimerica di materiale variabile e processarlo per ottenere una struttura che mima l'ECM perché si ottengono delle fibre molto piccole in conformazione random. Non è banale ottenere delle strutture che mimino l'ECM perché la scala è molto piccola, è molto difficile raggiungere delle definizioni nanometriche.

Ci interessa arrivare a una scala nanometrica perché le cellule sono immerse nella matrice perché formano nella tridimensionalità della struttura dei legami in tutte le direzioni. I legami cellula substrato rientreranno nelle dimensioni nanometriche quindi bisogna riformare questa struttura per avere biomimeticità. Per questo motivo l'elettrospinning è molto utilizzato perché si riescono ad ottenere queste scale con uno strumento abbastanza banale che sfrutta una ddp: una soluzione polimerica caricata all'interno di una siringa collegata a una pompa. La siringa è connessa a un generatore di tensione che ha come polo opposto un collettore che può essere piano o rotante che permettono di ottenere diverse orientazioni delle fibre (random o allineate).

La ddp che si genera permette di caricare la soluzione polimerica e la direziona verso il collettore che la attrae e durante la fase di volo le interazioni nella soluzione polimerica fanno sì che il getto si rompa formando delle fibre sempre più piccole. Quella che raggiunge il collettore è una fibra rotta di dimensioni molto piccole. Nella fase di volo evapora il solvente quindi sul collettore ottengo una matrice che ha rimosso il solvente ed è composta solo da soluto; la componente di solvente viene fatta evaporare. Il processo è piuttosto semplice, non richiede un'attrezzatura particolarmente complessa, il sistema è molto utilizzato anche per questo motivo.

L'elettrospinning quindi permette di mimare la morfologia della matrice, oltre alla morfologia si deve curare la composizione che ha un effetto rilevante sulle proprietà chimico-fisiche del substrato. I materiali processabili tramite elettrospinning sono quasi tutti però si devono usare dei solventi che non rimangono all'interno della struttura perché sono quasi tutti citotossici (esclusa l'acqua). Si possono usare materiali di origine sintetica e di origine naturale (gelatina, collagene…) che però hanno la problematica di non essere ripetibili nella fornitura, si utilizzano dei materiali bioartificiali. Si possono anche spinnare delle matrici più simili al tessuto osseo a cui vengono aggiunti fosfati di calcio (idrossiapatite).

Per aggiungere degli stimoli solubili attraverso l'elettrospinning si può implementare il sistema per avere una morfologia adeguata, ottenere la composizione ottimale e aggiungere dei fattori solubili all'interno della struttura. Con fattori solubili si intendono principalmente i fattori di crescita che sono popolazioni di proteine che si trovano nell'ambiente extracellulare, non sono legati a nulla, interagiscono coi recettori di membrana attivando una cascata di eventi che raggiunge il nucleo attivando processi di codifica genica.

Sono dei messaggeri che interagiscono con la membrana dando informazioni di attivare qualche processo interno. Questi fattori sono prodotti solitamente dalle cellule che poi ne influenzano il comportamento. Un approccio alternativo è la terapia genica che di fatto invece di permetterci di rilasciare nel sistema un sistema che dà una determinata informazione possiamo inserire nell'ambiente un elemento che può essere integrato nel genoma cellulare delle cellule presenti influenzandole a rilasciare dei fattori solubili. Infatti andando semplicemente a inserire questi fattori solubili nello scaffold questi prima o poi terminano. Andando a modificare le cellule in situ posso direttamente influenzare questo processo rendendo le cellule produttrici del fattore di crescita voluto.

È minore la probabilità di terminare il fattore di crescita. Mentre i fattori di crescita sono molecole da sole per la terapia genica l'elemento funzionale di solito viene incorporato all'interno di un vettore perché questo fattore deve entrare nel nucleo per avere un effetto quindi il vettore che lo trasporta deve essere in grado di portarlo nel nucleo e di proteggerlo. Il delivery genico deve essere fatto su DNA. Quello che è importante nella definizione del processo ideale di incapsulamento di biomolecola (fattore di crescita o vettore) è che questi fattori devono raggiungere il sito attivo mantenendo la loro funzionalità, sono molecole molto sensibili alle condizioni esterne e le modifiche dell'ambiente circostante possono andare a denaturarle, l'obiettivo finale è quello di mantenere la bioattività di queste molecole.

La cinetica di rilascio inoltre deve essere tale da permettere di avere un effettivo beneficio fisiologico, se non ottengo il quantitativo limite per avere un'attività funzionale non riesco a influenzare una popolazione di cellule abbastanza alta per attivare il processo rigenerativo. È fondamentale che si raggiunga il livello minimo di funzionalità. Sapere quanto vale questa soglia è praticamente impossibile, dal punto di vista teorico si prendono diversi quantitativi di biomolecola, si trattano popolazioni cellulari e a diversi quantitativi vedo qual è il quantitativo che dà la risposta migliore una volta trovato il livello soglia posso capire quanta biomolecola mettere, approcci sperimentali, non si ricava da informazioni fisiologiche. Una volta trovato questo livello soglia devo definire una metodologia appropriata per inserire la biomolecola nello scaffold.

Ingegnerizzazione del tessuto nervoso

Il sistema nervoso svolge prevalentemente tre funzioni:

• Funzione sensoriale per monitorare l'ambiente sia esterno che interno
• Una funzione motoria che ci permette il movimento
• Funzionalità di integrazione, interpretazione dei segnali sensoriali che arrivano dalle fibre afferenti, l'integrazione ad alta scala che ci permette di decidere cosa fare attraverso il sistema motorio

Il sistema nervoso si può suddividere in due parti: sistema nervoso centrale e periferico. Il sistema nervoso centrale è costituito dal cervello e dal midollo spinale, a partire dal sistema nervoso centrale dipartono tutti i sistemi che afferiscono al sistema periferico che comprende tutto il tessuto neuronale nel sistema centrale, tutte le strutture...