Schema su Dna e tecniche di base

La sonda è un segmento di DNAss marcato. Northern Blotting: trasferimento di RNA,

Durante la fase di ibridazione riconosce e lega il rilevamento per ibridazione con sonde di DNA Differisce dal Southern per due

DNA bersaglio presente sulla membrana. Analoghi al Southern Blotting in aspetti: 1.Il trasferimento di

quanto basati sul trasferimento proteine avviene per passaggio

Western Blotting: trasferimento di proteine separate

di molecole da gel di di corrente elettrica e non per

mediante PAGE; rilevamento con anticorpi marcati

Il metodo si basa su: 1.La produzione elettroforesi a membrana sono: capillarità 2.Il rilevamento si

di una replica del gel su membrana basa sul legame di anticorpi

2.La complementarità fra DNA sonda South-Western Blotting: trasferimento di proteine; rilevamento con sonde di

e DNA fissato su membrana DNA; consente l'identificazione di proteine in grado di legare DNA

Southern Blotting permette di 1. Lisi cellulare con metodi vari

individuare frammenti di DNA secondo il tipo cellulare

Step principali:

Purificazione

con sequenza specifica DNA genomico

all'interno di una popolazione 2. Rimozione dei frammenti cellulari

Applicazioni del Southern: medicina

eterogenea di frammenti. mediante centrifugazione

1.Trattamento con

legale (DNA fingerprint) gli RFLP di detertente (pH12)

particolari marcatori sono evidenziati e Step principali: 3. La parte solubile è trattata con solventi

confrontati tramite Southern Blotting

Southern 1975 organici per allontanare le proteine

2.Neutralizzazione

Purificazione DNA (pH5.2)

plasmidico

Purificazione DNA

DNA e tecniche di base 4. Precipitazione degli acidi

Blotting ed applicazioni nucleici rimasti nella fase acquosa

3. Eliminazione dei precipitato

Il metodo si basa sul fatto che dopo mediante centrifugazione

trattamento alcalino il DNA circolare 5.Rimozione dell'RNA:

Consente di separare e analizzare molecole di plasmidico ma non quello lineare rinatura trattamento con enzima RNAsi

DNA. Molecole cariche come acidi nucleici e 4.Purificazione del DNA in soluzione

più facilmente in seguito a neutralizzazione

proteine possono essere separate mediante (con cromatografie a scambio ionico o

elettroforesi: migrazione in un campo elettrico. 6.Centrifugazione in gradiente di densità per

con gel-filtrazione)

Essendo cariche negativamente le molecole di I vettori separare diversi tipi di DNA

DNA migrano verso il polo positivo Elettroforesi su gel I vettori assicuro la propagazione e replicazione

del DNA esogeno nell ospite. I vettori sono Vettori di clonaggio:

In un gel il DNA si può visualizzare molecole di DNA costruite combinando e amplificazione del DNA inserito

con coloranti fluorescenti come il modificando le sequenze naturali. Esistono vari

bromuro di etidio, che emette luce vettori, scelti in base alla applicazione e

La matrice del gel è un polimero che Vettori di espressione: traduzione in

quando sottoposto a UV dimensione del frammento da clonare

forma un reticolo di maglie che le proteina del DNA inserito

molecole devono attraversare. Dalla

concentrazione di matrice nel gel dipende Schwartz e Cantor 1984

il range di dimensione dei frammenti Molecole di DNA circolari

Un esempio di vettore

separabili con buona risoluzione. extra-cromosomali: diffusi in

Matrice polimerica: è il plasmide

La gel-elettroforesi in campo procarioti e alcuni eucarioti

•Poliacrilammide (PAGE)-> pori sottili I didesossiribonucleotidi pulsato (PFGE) permette di (lievito) dimensioni di 1-20kb

•Agarosio-> pori grossolani interferiscono con la normale separare molecole di DNA molto

sintesi del DNA e bloccano lunghe (fino 10Mb) consentendo

All'interno del gel la

Le cellule sono incluse direttamente in blocchi l'estensione. Nel gel si separano l'analisi di interi cromosomi

velocità di migrazione

di agarosio per ottenere DNA integro: 1.Si frammenti diversi per lunghezza

del DNA è influenzata

mescola agarosio sciolto con cellule, si lascia anche di una sola base. Ciò

dalla dimensione e dallo

raffreddare 2.Si incuba con enzimi che permette di ricostruire l'intera

stato strutturale

digeriscono le cellule 3.I blocchi di agarosio sequenza. Il sequenziamento del

sono posti nei pozzetti di gel (per elettroforesi) DNA è applicato ai geni ma anche

a genomi completi, progetto

genoma umano (Dulbecco)