Riassunto esame aiuto compiti, prof. Pedone, libro consigliato I principi di biochimica, Lehninger, David,. Nelson, Cox

Biochimica (Principi) – P.V. Pedone

Le quattro principali famiglie di piccole molecole

Esistono quattro principali famiglie di piccole molecole:

• Amminoacidi, che legati insieme vanno a formare le proteine;
• Nucleotidi, che legati insieme vanno a formare il materiale genetico, ossia RNA e DNA;
• Zuccheri, che legati insieme vanno a formare i polisaccaridi e quindi i carboidrati;
• Acidi grassi, che sono la parte costituente principale delle membrane nucleari.

Le proteine e la loro struttura

Le proteine sono polimeri di amminoacidi. Hanno funzioni completamente diverse le une dalle altre. Ogni amminoacido è formato da:

• Carbonio (C)
• Gruppo Amminico (H₃N)
• Gruppo Carbossilico (COO^-)
• Gruppo sostituente (R)

Questa conformazione si ha a pH=1. La stereoisomeria di un amminoacido è importante poiché due stereoisomeri sono due amminoacidi completamente diversi. Gli L-amminoacidi hanno il gruppo amminico sulla sinistra, i D-amminoacidi sulla destra. Tutti gli amminoacidi che noi sintetizziamo e usiamo per sintetizzare le proteine sono di tipo L, e non R. Questi comunque non costituiscono la totalità degli amminoacidi esistenti, ma sono detti amminoacidi essenziali.

Gli amminoacidi e il loro ruolo

All’inizio si pensava che le proteine facessero addirittura parte del nostro corredo genetico. Gli amminoacidi più importanti sono 20, e si distinguono in quattro gruppi:

• Amminoacidi con catene laterali non polari;
• Amminoacidi con catene aromatiche;
• Amminoacidi con catene polari non cariche;
• Amminoacidi con catene polari cariche.

Modificazioni e legami degli amminoacidi

La serina e la treonina possono essere modificate tramite fosforilazione, ossia aggiunta di un gruppo fosfato. Due cisteine possono legarsi a creare un ponte disolfuro, un legame covalente molto forte. È l’unica a possedere una struttura ciclica ed è uno degli unici due amminoacidi con la presenza di zolfo nella propria struttura. Gli amminoacidi con catene laterali aromatiche e cariche positivamente a pH fisiologico tendono a caricarsi di un protone, hanno un pH molto simile al pK. Tirosina e triptofano assorbono la luce ultravioletta. Lo sappiamo tramite gli studi con lo spettrofotometro. Legge di Lambert-Beer: misura quanta luce viene assorbita.

Esistono anche amminoacidi non-standard, derivanti da modificazioni post-trasduzionali. La forma ionica dipolare di un amminoacido è quella più frequente, e si ha per valori di pH vicini a quello fisiologico, solitamente a pH=11. Gli stati di ionizzazione dell’amminoacido dipendono dal pH: un valore maggiore di pH porta ad una maggiore protonazione. Gli amminoacidi hanno curve di titolazione caratteristiche. Amminoacidi con un gruppo R non ionizzabile, avranno una curva di titolazione simile a quella della glicina, ossia con due valori di pK, mentre amminoacidi con un gruppo R ionizzabile avranno una curva di titolazione più complessa, a tre fasi, e con tre valori di pK. Il pH isoelettrico corrisponde al valore di pH a cui la carica netta di un amminoacido è uguale a zero, che di solito, negli amminoacidi senza gruppi acidi o basici, ossia con pK costante, è intorno a 6. Un amminoacido ha una carica netta positiva se il pH è inferiore al punto isoelettrico: in questo caso, se posto in un campo elettrico, esso migra verso l’elettrodo negativo (catodo); viceversa, ha una carica netta negativa se il pH è superiore al punto isoelettrico, in questo caso esso migra verso l’elettrodo positivo (anodo). Sotto al pH 2 gli amminoacidi sono tutti positivi.

Legami peptidici e struttura delle proteine

Due amminoacidi si legano tra loro per condensazione, tramite legame peptidico, un legame ibrido, ossia un legame a metà tra il singolo e il doppio, e per questo molto rigido, tra il carbonio e l’azoto. Durante la formazione di questo legame, il gruppo amminico si lega al gruppo carbossilico e viene persa una molecola d’acqua. Di solito gli amminoacidi si legano tra di loro nei ribosomi, ma in generale non sono mai unità libere. Una catena polipeptidica è direzionale, ossia si può individuare una parte ammino-terminale ed una carbossi-terminale. Anche i polipeptidi hanno un punto isoelettrico. Conoscendo il peso molecolare di una proteina, dividendolo per 110 (media degli amminoacidi presenti in una proteina) conosciamo approssimativamente il numero degli amminoacidi presenti in quella proteina.

Una proteina semplice è composta solo da amminoacidi, mentre una proteina coniugata è composta da una parte proteica e da una parte non amminoacidica: questa parte viene definita gruppo prostetico. Alcuni esempi di proteine coniugate sono le lipoproteine, le glicoproteine, le fosfoproteine, le emoproteine, le flavoproteine, o le metalloproteine.

Struttura delle proteine

La lunghezza media delle proteine è di 300 amminoacidi, ossia potremmo avere 20 combinazioni di amminoacidi per avere altrettante proteine, ma in realtà sono possibili solo un numero limitato di proteine, poiché devono possedere una configurazione tridimensionale stabile. Una proteina possiede vari livelli di struttura:

• Struttura primaria, la quale descrive quali amminoacidi compongono la catena ed i legami che intercorrono tra loro;
• Struttura secondaria, la quale descrive la disposizione nello spazio dei residui adiacenti, come per esempio le strutture ad α-elica, a β-foglietto o a β-ripiegamento;
• Struttura terziaria, la quale ci dà un'immagine tridimensionale della proteina, ossia descrive come si dispongono le eliche ed i foglietti gli uni rispetto agli altri;
• Struttura quaternaria, la quale descrive come interagiscono tra loro varie catene peptidiche.

Interazioni tra le proteine

Le interazioni tra le proteine sono:

• I ponti disolfuro, anche se non tutte le proteine li presentano;
• I legami non covalenti, come i legami ad idrogeno, le interazioni ioniche, le interazioni di Van Der Waals, e le interazioni idrofobiche (ossia associazioni di molecole non polari in ambiente acquoso).

Una struttura quaternaria è più stabile (ossia ha meno energia libera) quante più interazioni deboli sono presenti. Il ripiegamento di una proteina avviene seguendo semplici regole:

• I residui idrofobici vengono localizzati all’interno della proteina;
• Tende ad esserci il massimo numero di legami a idrogeno.

La maggior parte della variazione di energia libera che si ha durante il folding di una proteina è dovuta all’aumento di entropia della soluzione acquosa. Si ha aumento dell’entropia dell’acqua quando le catene laterali degli amminoacidi idrofobici tendono a raggrupparsi all’interno della proteina. Si ha aumento dell’entropia dell’acqua quando si generano legami idrogeno intramolecolari o interazioni ioniche tra gruppi carichi della molecola. Molecole non polari in un ambiente acquoso tendono a raggrupparsi. L’aggregazione delle molecole non polari in acqua porta ad un aumento dell’entropia del sistema dovuto alla riduzione della superficie esposta al solvente ed alla conseguente riduzione delle molecole d’acqua negli “strati ordinati”. Il numero di molecole d’acqua negli strati ordinati è proporzionale all’area superficiale del soluto idrofobico. Molecole non polari in una soluzione acquosa vengono tenute insieme non tanto perché hanno affinità tra loro ma per ridurre la superficie esposta all’acqua.

Legame peptidico e struttura rigida

Due amminoacidi si legano tra loro per condensazione, tramite legame peptidico, un legame ibrido, ossia un legame a metà tra il singolo e il doppio, e per questo molto rigido, tra il carbonio e l’azoto. Esso è una struttura rigida e planare. L’idrogeno del gruppo aminico sostituito è quasi sempre trans (opposto) rispetto all’ossigeno del gruppo carbonilico. La forma trans è fortemente favorita perché nella forma cis vi sono impedimenti sterici.

Rotazione delle proteine

La rotazione delle strutture delle proteine è permessa solo attorno ai legami:

• N-C_α, di un angolo Φ
• C_α-C’, di un angolo ψ

Questi due angoli possono teoricamente assumere valori tra -180° e +180°. Essi però non possono valere entrambi 0°, poiché si andrebbe oltre la distanza consentita dai raggi di Van Der Waals, ossia alcuni orbitali si sovrapporrebbero. Se conosco il valore di questi due angoli, conosco la struttura terziaria della proteina. Intorno al legame C’-N la struttura non può ruotare. I valori permessi di Φ e ψ sono riportati in un grafico in cui viene studiato l’angolo ψ in funzione di Φ: il grafico di Ramachandran.

Strutture secondarie delle proteine

Le strutture secondarie che possono assumere le proteine sono varie, le più comuni sono:

• α-elica: Nelle strutture ad α-elica, lo scheletro della proteina è avvolto intorno all’asse longitudinale e le catene laterali si posizionano verso l’esterno. Bisogna fare attenzione agli amminoacidi con catene polari, poiché in base alla loro posizione possono essere utili o meno alla solidità della struttura: le catene laterali polari degli amminoacidi distano tra loro 3 residui. Quando i residui sono prevalentemente idrofobici, la proteina si trova internamente alla membrana. Quando i residui sono misti, la proteina è parzialmente esposta al di fuori. Quando i residui sono prevalentemente polari, la proteina è completamente esposta verso il materiale extracellulare. La presenza di un residuo di prolina limita la formazione di un α-elica, perché non è possibile la rotazione attorno al legame N-C_α, e l’atomo di azoto non ha l’atomo di idrogeno sostituente, quindi non può formare legami a idrogeno con altri residui.
• β-libretto: Le strutture a β-libretto sono le più estese. Si formano legami a idrogeno tra C=O di un filamento e N-H di un filamento adiacente. Possono esserci β-libretti paralleli (molto rare) e β-libretti antiparalleli. I gruppi R di residui amminoacidici adiacenti sporgono al di fuori della struttura a zig-zag, alternativamente da una parte o dall’altra del piano. La fibroina della seta è costituita da strati di foglietti β antiparalleli ricchi di residui di Alanina e Glicina.
• Strutture a ripiegamento-β (turn): Le strutture a ripiegamento-β (turn) sono strutture di collegamento, ossia collegano altri tipi di conformazioni, come quelle ad elica o a libretto, lì dove vi è un brusco cambio di direzione nella struttura di una proteina. È un ripiegamento che consente una curva della struttura di circa 180°, formata da 4 residui.

Struttura terziaria e quaternaria

Nella struttura terziaria anche amminoacidi di strutture secondarie diverse possono trovarsi vicini. Questo livello di organizzazione non è rigido. In base alla classificazione della loro struttura terziaria, le proteine possono distinguersi in:

• Proteine globulari, le quali assumono forme sferiche, come l’emoglobina;
• Proteine fibrose, le quali hanno catene polipeptidiche disposte in lunghi fasci o foglietti. Le loro strutture secondarie e terziarie tendono a coincidere. La resistenza delle proteine fibrose è aumentata da legami covalenti crociati tra le catene polipeptidiche presenti nella struttura a “corda” o tra catene adiacenti nel complesso sopramolecolare.

Alcuni esempi di proteine fibrose sono le proteine della seta, che hanno una struttura estesa, tutta composta da foglietti β antiparalleli, o le α-cheratine dei capelli, delle penne e delle unghie, formate da strutture ad α-elica, con ponti disolfuro trasversali. Le singole catene polipeptidiche che costituiscono l’α-cheratina hanno una struttura ad α-elica destrorsa. Due catene di α-cheratina con la stessa direzionalità (con gli amminoacidi amminoterminali alla stessa estremità) si avvolgono l’una sull’altra per formare un superavvolgimento anche detto avvolgimento avvolto (coiled coil). L’andamento elicoidale del superavvolgimento è sinistrorso, opposto a quello delle due eliche α. Le superfici dove le due eliche si toccano nella struttura avvolta presentano residui idrofobici. Nelle α-cheratine i legami crociati che stabilizzano la struttura quaternaria sono ponti disolfuro.

Le proteine fibrose possono essere anche formate da più avvolte su sé stesse, con ponti disolfuro laterali. In questo caso si parla di strutture dure (grazie ai legami covalenti crociati) ed insolubili. Un esempio è il collageno, avente una struttura a tripla elica, tenuta insieme da legami a idrogeno. Il collageno è la proteina più rappresentata nei mammiferi, ed è presente nel tessuto connettivo come i tendini, la cartilagine, la matrice organica delle ossa e la cornea dell’occhio. La molecola del collageno è costituita da 3 lunghe catene polipeptidiche (~1000 amminoacidi). Ciascuna catena del collageno si organizza in una struttura elicoidale diversa dall’α-elica. L’elica del collageno è sinistrorsa, ha 3 residui per giro, i legami idrogeno intracatena sono assenti, e l’elica è stabilizzata da repulsioni steriche tra gli anelli dei residui di prolina. Le tre eliche si avvolgono l’una sull’altra con andamento destrorso.

Le vitamine e il loro ruolo

Le vitamine sono molecole organiche di cui abbiamo bisogno in piccole quantità, e che non possiamo sintetizzare, per cui le assumiamo attraverso la dieta. Per esempio, la mancanza di vitamina C (acido ascorbico) nell’alimentazione, può portare allo scorbuto, una malattia che provoca macchie sulla pelle, gengive spugnose e sanguinamento delle mucose, e che se non curata, può portare alla morte. Esso è un efficace agente riducente, mantiene la prolilidrossilasi nella forma attiva. Il collageno sintetizzato in assenza di acido ascorbico è insufficientemente idrossilato e ha una minore stabilità. Al centro delle tre eliche del collageno si trovano tutti i residui di glicina di ognuna delle tre eliche. La struttura deve necessariamente essere così composta: se ad anche una sola glicina si sostituisce una cisteina, si incorre nella malattia.

Strutture supersecondarie e domini proteici

L’emoglobina è formata da più del 70% da α-eliche, in cui: la maggior parte dei gruppi idrofobici sono all’interno; tutti i gruppi polari sono sulla superficie, tranne le due istidine; i residui di prolina si trovano in regioni di cambio di direzione; il gruppo eme si trova in una tasca idrofobica della molecola. Le regole generali per le strutture terziarie delle proteine sono:

• I residui non polari si trovano all’interno;
• I residui polari carichi sono sulla superficie;
• I residui polari non carichi sono sulla superficie, ma anche all’interno, in cui sono sempre impegnati in legami a idrogeno.

Esistono anche accoppiamenti tra strutture secondarie in strutture supersecondarie, come l’elica-ansa-elica e la β-ansa-β. Le catene polipeptidiche contenenti più di 200 residui, si ripiegano in due o più domini, i quali sono una parte di proteina che va a formare una struttura terziaria indipendente e stabile: spesso costituiscono vere e proprie unità funzionali. Grazie all’evoluzione, una proteina può anche cambiare la propria funzione. Proteine con strutture o funzioni simili sono dette famiglie.

Struttura quaternaria delle proteine e denaturazione

La struttura quaternaria di una proteina descrive le interazioni tra più proteine o subunità. Le proprietà della proteina stessa dipendono proprio dalle interazioni con altre molecole: queste interazioni sono molto specifiche e sono dovute per lo più ad interazioni deboli non covalenti. I siti di legame vengono chiamati ligandi. La regione di una proteina che si associa con il ligando è detta sito di legame. Le proteine possono cambiare forma legandosi ad altre molecole. Esse sono eccellenti interruttori molecolari, ossia sono in grado di essere convertite reversibilmente in due o più stati stabili, in risposta a cambiamenti quali pH, luce, temperatura, ecc.

La denaturazione è un meccanismo che induce un cambio improvviso di forma e funzione della proteina. Questo può avvenire con:

• Calore;
• pH estremi;
• Urea, idrocloruro di guanidina;
• Detergenti.

L'esperimento di Anfinsen consisteva nella denaturazione e rinaturazione della ribonucleasi A. La proteina veniva denaturata in urea con un agente riducente, il β-mercaptoetanolo: in queste condizioni si rompono i quattro ponti disolfuro degli otto residui di cisteina e si scindono le interazioni idrofobiche. A seguito della denaturazione, l'enzima aveva perso il suo potere catalitico. Allontanando però l'urea e il riducente, la ribonucleasi A riacquista spontaneamente la sua struttura terziaria. Il processo è così accurato che i ponti disolfuro si riformano nella stessa posizione della proteina nativa, nonostante ci siano 105 modi possibili per ricombinarli. Se la proteina viene fatta riavvolgere in presenza di denaturante si ottengono invece distribuzioni diverse dei ponti disolfuro.

Modelli di folding delle proteine

Esistono dei modelli di regole del corretto folding delle proteine:

• Le strutture secondarie locali si formano per prime, seguono poi interazioni più a lungo raggio (es.: due α-eliche si associano formando una struttura supersecondaria). Il processo prosegue in questo modo fino a che non sono completati i domini e l’intera catena polipeptidica si è avvolta correttamente.
• Le strutture si ripiegano in base alle interazioni idrofobiche: l’avvolgimento inizia dall’assunzione spontanea da parte della catena polipeptidica di uno stato compatto, mediato dalle interazioni idrofobiche.