Riassunto di Istologia

Istologia

Preparare campioni istologici

1) Fissazione: tecnica usata per prevenire la decomposizione dei tessuti, dovuta alla perdita delle loro proprietà chimiche e fisiche, alla variazione di temperatura e di pH e all'azione dei microrganismi. La fissazione, fatta generalmente con aldeidi reattive, come la formalina, ritarda, e a volte impedisce, questi processi, senza modificare eccessivamente la struttura proteica.

2) Disidratazione: il campione viene disidratato tramite l’immersione del campione in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo.

3) Eliminazione o diafanazione: al termine del processo di disidratazione si elimina l’etanolo passando allo xilolo, un composto apolare che rende trasparente la cellula.

4) Inclusione: processo tramite cui i tessuti biologici vengono inclusi in paraffina calda, che occupa tutto lo spazio precedentemente occupato dall’acqua e, raffreddandosi, funge da sostegno. Il campione immerso nella paraffina liquida viene messo in un congelatore, che abbassa la temperatura a 0° e la paraffina solidifica.

5) Taglio: i tessuti biologici devono essere tagliati poiché, a causa del suo spessore, il microscopio non sarebbe in grado di indagare la sua struttura cellulare. Il microtomo è il macchinario utilizzato per tagliare i campioni istologici in strisce di spessore pari ai 7μm.

6) Colorazione: i tessuti animali vengono colorati con sostanze idrosolubili, che possono essere divisi in due gruppi in base ai diversi componenti cellulari a cui si legano, a causa del pH:

• I coloranti basici, che si legano alle molecole con pH inferiore a 7 (acide), come il DNA.
• I coloranti acidi, che si legano alle molecole con pH superiore a 7 (basiche), come gran parte delle proteine citoplasmatiche. Un esempio è la colorazione con ematossilina/eosina, una delle più comuni in laboratorio: l'ematossilina, basica, colora il nucleo in blu, l'eosina, acida, colora il citoplasma in rosa.

Microscopio ottico

I microscopi ottici sono composti da lenti disposte in maniera tale da permettere un notevole ingrandimento ed una buona risoluzione dei costituenti dei tessuti osservati sfruttando la riflessione o l'assorbimento della luce per illuminare il campione osservato. Il microscopio ottico ha un potere di risoluzione di 0,2 μm, con un aumento del potere di risoluzione rispetto a quello dell'occhio umano di circa 3 ordini di grandezza (1000 x). Questo limite non è di natura tecnico-costruttiva, ma dipende essenzialmente dalla lunghezza d’onda della luce visibile da 0,4 a 0,7 micron risultano visibili all’occhio umano e vengono percepite come colori diversi (dal rosso con λ = 0,7 μm fino al violetto con λ = 0,4 μm). Il potere risolutivo o risolvente è rappresentato dalla minima distanza tra due punti distinti, al di sotto della quale essi vengono percepiti come un unico punto, può essere espresso con una formula dove : λ (lambda) è la lunghezza d'onda della luce incidente, n è l'indice di rifrazione del mezzo interposto tra obiettivo e vetrino ed α (alfa = angolo di apertura della lente) è il semiangolo del cono luminoso entrante. Il prodotto al denominatore viene detto apertura numerica, è un numero adimensionale ed è un modo per esprimere l'angolo di apertura della lente dell'obiettivo senza utilizzare il grado sessagesimale.

• Tubo verticale per fotografia
• Tubo binoculare
• Stativo
• Revolver porta obiettivi
• Tavolino porta oggetti
• Condensatore
• Manopole di messa a fuoco
• Sorgente di luce

Microscopio ottico a fluorescenza

Il microscopio a fluorescenza è utilizzato per studiare campioni organici o inorganici sfruttando i fenomeni della fluorescenza e della fosforescenza indotti nel campione. Il microscopio a fluorescenza è usato nelle indagini di immuno-istochimica. Un grande vantaggio del microscopio a fluorescenza è quello di garantire una elevata specificità di indagine, ma è una tecnica molto costosa.

Microscopio elettronico

Schema di un SEM-EDX: gli elettroni emessi da un cannone giungono al campione in esame dopo essere passati dapprima tra una serie di lenti elettromagnetiche e quindi tra le bobine di deflessione che generano la scansione. I rivelatori ricevono le varie emissioni energetiche generate dal campione.

Il microscopio elettronico sfrutta, come sorgente di radiazioni, un fascio di elettroni accelerati nel vuoto e non di fotoni. Dato che il potere di risoluzione di un microscopio è inversamente proporzionale alla lunghezza d'onda della radiazione che esso utilizza, usando un fascio di elettroni è possibile raggiungere una risoluzione parecchi ordini di grandezza superiore. Le lenti sono sostituite da campi magnetici che hanno un effetto convergente sugli elettroni. Dal momento che il materiale da esaminare è posto sotto vuoto, esso deve essere preventivamente disidratato e ciò impedisce l'uso del microscopio elettronico su preparati viventi. Inoltre le sezioni di tessuto devono essere sottilissime per consentire il passaggio degli elettroni il cui potere di penetrazione è molto basso. L'immagine fornita è invisibile all'occhio umano, ma può essere fotografata e raccolta su uno schermo fluorescente che emette luce visibile sotto l'urto degli elettroni provenienti dal preparato. Essa risulta in bianco e nero con varie tonalità di grigio in corrispondenza della maggiore o minore trasparenza agli elettroni delle strutture cellulari (ma sono possibili tecniche di colorazione in falsi colori).

Il microscopio elettronico può essere a trasmissione (TEM) o a scansione (SEM).

Microscopio elettronico a trasmissione

Gli elettroni attraversano il preparato e vengono deviati diversamente dagli atomi del corpo da esaminare, portando alla formazione di un’immagine differenziata. Poiché i preparati biologici sono spesso costituiti da atomi più o meno tutti dello stesso peso è necessario aggiungere particolari coloranti contenenti atomi pesanti in grado di deviare il fascio di elettroni.

Microscopio elettronico a scansione

Gli elettroni incidono sulla materia, determinando l'emissione di elettroni secondari che, raccolti, forniscono immagini dettagliate della superficie degli oggetti. Dalle zone in rilievo vengono emessi più elettroni secondari che dalle zone depresse. Ne deriva un’immagine tridimensionale della superficie del campione.

Microscopia a scansione di sonda

La microscopia a scansione di sonda (SPM, Scanning Probe Microscopy) forma le immagini di superfici usando una sonda fisica che esegue la scansione del campione. Un'immagine della superficie è ottenuta meccanicamente spostando la sonda in un raster di scansione (raster scan) del campione, riga per riga e registrando l'interazione sonda-superficie in funzione della posizione. La SPM è stata istituita nel 1981 con l'invenzione del microscopio a scansione a effetto tunnel, che si basa sul concetto di effetto tunnel (Quando una punta conduttrice è portata molto vicino alla superficie da esaminare, una differenza di tensione applicata tra i due può permettere agli elettroni di realizzare un tunnel attraverso il vuoto tra di loro. La "corrente di tunneling" che ne risulta è in funzione della posizione della punta, della tensione applicata e della densità locale degli stati del campione). Molti microscopi a scansione di sonda sono in grado raffigurare molte interazioni simultaneamente. La maniera di utilizzare queste interazioni per ottenere un'immagine è generalmente chiamata "modo". La risoluzione laterale è di 0.1 nm e la risoluzione in profondità è di 0.01 nm. Ciò è dovuto in gran parte alla capacità degli attuatori piezoelettrici di eseguire movimenti con una precisione e accuratezza a livello atomico o meglio in base al comando elettronico. I dati sono in genere ottenuti come una griglia bidimensionale di punti dati (data points), visualizzati in colori falsi come immagine del computer.

Citologia

Cellula eucariote animale

La cellula eucariote costituisce tutti gli altri organismi viventi, unicellulari e pluricellulari. Il DNA è racchiuso da una membrana, formando così un particolare organulo chiamato nucleo. La cellula eucariote animale è formata da una membrana plasmatica esterna che racchiude il citoplasma ed il nucleo. Il citoplasma è costituito da una frazione liquida, il citosol, e dagli organuli cellulari in essa sospesi.

Possiede organuli immersi nel citoplasma.

Membrana plasmatica

La membrana plasmatica, che avvolge ogni cellula, serve a:

• Mantenere l’integrità strutturale della cellula.
• Regolare le interazioni cellula-cellula.
• Riconoscere, mediante recettori, gli antigeni, le cellule estranee o alterate.
• Elaborare i segnali fisici o chimici extracellulari in eventi intracellulari.

La membrana plasmatica non costituisce solo una barriera passiva, ma è in grado di agire come filtro selettivo, di regolare il passaggio di sostanze che la attraversano permettendo di mantenere le condizioni in cui possono svolgersi le attività metaboliche. Essa ha anche funzione di trasporto e di locomozione.

Struttura della membrana plasmatica

È costituita da un doppio strato continuo di fosfolipidi, attraversata in parte o completamente da numerose proteine, presenta una piccola percentuale di glucidi, in forma di glicoproteine e glicolipidi, e di molecole di colesterolo che la stabilizzano. La membrana può essere congelata e scissa in due foglietti contenenti una delle catene, evidenziando le due superfici idrofobe, che possono essere chiamate faccia P, se vicina al protoplasma, e faccia E, se nello spazio extracellulare.

I fosfolipidi sono lipidi formati da una "testa" polare idrofila di glicerolo legato ad un gruppo fosfato e a due "code" non polari idrofobe di acidi grassi, di cui uno insaturo con doppi legami cis. Come conseguenza della presenza di acqua sia all’interno che all’esterno della cellula, i fosfolipidi rivolgono le teste polari verso le due superfici della membrana, mentre le code apolari sono rivolte verso la parte interna del doppio strato. In condizioni fisiologiche, sia le molecole lipidiche sia quelle proteiche in esse immerse sono in grado di muoversi liberamente (modello a mosaico fluido), consentendo alla membrana di manifestare proprietà autosigillanti attraverso le quali può autoripararsi, ossia richiudersi rapidamente ed automaticamente qualora in essa si produca un foro. La capacità autosigillarsi permette inoltre alle membrane di fondersi e scindersi, senza che si abbiano perdite di materiale cellulare, nel corso di processi fondamentali per la vita e l’attività delle cellule (divisione cellulare, esocitosi, endocitosi). La membrana rappresenta l’interfaccia della cellula con l’ambiente esterno, attraverso la quale avvengono e vengono regolati tutti gli scambi di materiali ed informazioni. Il doppio strato fosfolipidico permette infatti il libero passaggio solo dell'acqua, di gas come O e CO e di piccole molecole liposolubili, mentre risulta impermeabile per ioni e molecole idrosolubili.

Le proteine di membrana integrali sono incastrate nel doppio strato in modo tale che le loro superfici idrofiliche siano a contatto con l’ambiente acquoso, mentre le superfici idrofobiche siano a contatto con la parte interna idrofobica del doppio strato.

Le proteina transmembrana sono proteine integrali che attraversano completamente la membrana. La porzione delle proteine che si proiettano verso la parte citoplasmatica o esterna contiene amminoacidi idrofili, mentre la parte che sta nello spessore del doppio strato lipidico è costituita da residui idrofobici. Le proteine trans membrana spesso formano canali ionici o proteine di trasporto, che possono passare anche più volte nella membrana, in questo caso vengono chiamate proteine multipasso.

Le proteine di membrana periferiche sono associate alla superficie del doppio strato, di solito legate alle porzioni esposte di proteine integrali e possono essere facilmente rimosse senza alterare la struttura della membrana. Le proteine di membrana hanno varie funzioni: trasportano sostanza, agiscono da enzimi o recettori, partecipano al riconoscimento tra cellule e collegano strutturalmente le cellule tra di loro.

Le proteine di trasporto della membrana facilitano il passaggio di ioni e molecole attraverso le membrane biologiche, come le proteine carrier, che vanno incontro a variazioni conformazionali nel momento in cui legano e trasportano uno specifico soluto. I trasportatori ABC, ad esempio, sono proteine carrier che utilizzano l’energia derivante dall’ATP per trasportare soluti.

Le proteine canale sono proteine di trasporto che formano vie di transito attraverso le quali l’acqua ed alcuni ioni passano da una parte all’altra della membrana; le porine, sono delle proteine canale che formano pori relativamente ampi attraverso la membrana per il passaggio di acqua e certi soluti.

La diffusione è il movimento di una sostanza secondo il suo gradiente di concentrazione, ovvero da una zona a concentrazione maggiore ad una zona a concentrazione minore, come l’osmosi, la diffusione è un processo fisico che non richiede un dispendio diretto di energia metabolica da parte della cellula.

Nella diffusione semplice attraverso una membrana biologica, le molecole di soluto o gli ioni si muovono direttamente attraverso la membrana secondo il loro gradiente di concentrazione, mentre, la diffusione facilitata si avvale di specifiche proteine di trasporto per muovere i soluti attraverso una membrana, sempre secondo gradiente di concentrazione.

L’osmosi è un tipo di diffusione nel quale le molecole di acqua attraversano una membrana selettivamente permeabile passando da una regione in cui la concentrazione effettiva dell’acqua è maggiore a una dove è minore. La concentrazione delle sostanze disciolte (soluti) determina la pressione osmotica della soluzione. Le cellule regolano la loro pressione osmotica interna per evitare di raggrinzirsi o di scoppiare. Quando l’acqua entra nelle cellule per osmosi, riempie i vacuoli centrali, le cellule si rigonfiano esercitando una pressione di turgore contro le pareti rigide.

Nel trasporto attivo, la cellula utilizza energia metabolica per spostare ioni o molecole attraverso la membrana contro gradiente di concentrazione, ad esempio la pompa sodio-potassio utilizza l’ATP per pompare gli ioni sodio fuori dalla cellula e gli ioni potassio dentro la cellula. Nel trasporto attivo indiretto, due soluti sono trasportati contemporaneamente, una pompa ATP-dipendente, come la pompa sodio-potassio, mantiene il gradiente di concentrazione, mentre una proteina carrier contrasporta due soluti, trasportandone uno secondo il suo gradiente di concentrazione ed utilizzando l’energia rilasciata da questo processo per trasportare il secondo soluto contro il suo gradiente di concentrazione.

Altri meccanismi di trasporto della cellula sono l’esocitosi e l’endocitosi, processi per cui la cellula spende energia metabolica. Nell’esocitosi la cellula espelle i prodotti di scarto o secerne sostanza, come ormoni o muco, mediante la fusione di vescicole con la membrana plasmatica, provocando un incremento dell’area di superficie della membrana plasmatica. Nell’endocitosi, invece, materiali come particelle di cibo possono essere portati dentro la cellula; una porzione della membrana plasmatica avvolge il materiale, lo racchiude in una vescicola (o in un vacuolo), che poi viene rilasciata all’interno della cellula. In questo processo avviene una riduzione dell’area superficiale della membrana plasmatica. L’endocitosi è un processo che può avvenire per fagocitosi, pinocitosi o può essere mediata da recettori. La fagocitosi è un processo in cui la membrana plasmatica racchiude una grossa particella, ad esempio un batterio o un protista, formando attorno ad essa un vacuolo che la trasporta all’interno della cellula. Nella pinocitosi, le cellule assumono materiali disciolti formando piccole vescicole attorno alle goccioline di fluido intrappolate in pieghe della membrana plasmatica.

Nell’endocitosi mediata da recettori, i ligandi si legano a recettori specifici in fossette rivestite, dalla proteina clatrina, della membrana plasmatica che formano vescicole rivestite per endocitosi. Successivamente le vescicole si fondono con dei lisosomi ed il loro contenuto viene degradato e rilasciato nel citosol.

Le cellule che si trovano a stretto contatto con altre cellule possono sviluppare giunzioni intercellulari, esistono quattro tipi di giunzioni: ancoranti, aderenti, serrate e comunicanti. Le giunzioni ancoranti, che si trovano tra cellule che formano uno strato di tessuto, includono i desmosomi, punti di saldatura delle cellule animali, e le giunzioni aderenti, formate dalle caderine, cementano le cellule tra loro. Le giunzioni serrate sigillano le membrane di cellule animali adiacenti, evitando che le sostanze possano passare attraverso gli spazi intercellulari, mentre, le giunzioni comunicanti, costituite dalla proteina connessina, formano canali che permettono la comunicazione tra citoplasmi di cellule animali adiacenti.

Nelle cellule vegetali esistono i plasmodesmi, dei canali che connettono cellule adiacenti, perché aprendosi nella parete cellulare, permettono alle membrane plasmatiche e al citoplasma di non avere soluzione di continuità, quindi alcuni ioni e molecole sono liberi di passare da una cellula all’altra.

Glicocalice: rivestimento della membrana plasmatica, composto da catene polisaccaridi che legate covalentemente alle proteine trans membrana o ai fosfolipidi di membrana, con la funzione di evitare alla cellula contatti con agenti chimici e fisici aggressivi.

Reticolo endoplasmatico

Il reticolo endoplasmatico (RE) è un sistema intercomunicante di tubuli e vescicole che delimitano delle cavità chiamate cisterne. Il reticolo endoplasmatico rugoso o ruvido è...