Riassunto di Biochimica 1°parte, Docente Stocchi Vilberto

Università di scienze motorie – biochimica 1° parte

Gli enzimi

Gli enzimi sono quasi tutti proteine ad eccezione di piccoli gruppi di RNA catalitico. Alcuni enzimi possono operare da soli, altri hanno bisogno di componenti chimici addizionali chiamati cofattori (uno o più ioni inorganici) oppure coenzimi (molecole organiche). La parte proteica di un enzima è detta apoenzima (o apoproteina). Il cofattore o enzima, che si lega all'enzima, è detto gruppo prostatico. Un enzima cataliticamente attivo con tutti i suoi enzimi-cofattori prende il nome di oloenzima.

Classificazione degli enzimi

Gli enzimi sono classificati in base alle reazioni che catalizzano e sono divisi in sei classi:

• Ossidoriduttasi: trasferimento di elettroni.
• Transferasi: reazioni di trasferimento di gruppi funzionali (anche chinasi).
• Idrolasi: reazioni di idrolisi (trasferimento di gruppi funzionali all'acqua).
• Liasi: formazione di legami doppi mediante rimozione di gruppi.
• Isomerasi: trasferimento di gruppo all'interno di una molecola formando isomeri.
• Ligasi: forma legami mediante reazioni di condensazione accoppiate alla scissione di ATP.

Come lavorano gli enzimi

Un enzima accelera la velocità di una reazione chimica anche di un miliardo di volte, rendendo possibili reazioni a temperatura costante (37°C) e pressione costante. Quindi gli enzimi sono catalizzatori che accelerano la velocità di una reazione senza essere consumati nel corso della stessa. Le reazioni catalizzate avvengono dentro la tasca dell'enzima, cioè nel sito attivo. La molecola che si lega all'enzima e su cui l'enzima agisce è detta substrato. Si crea così il complesso Enzima - Substrato. Il substrato induce nell'enzima un leggero cambiamento conformazionale che adotta la forma del sito o quella propria.

Gli enzimi modificano le velocità delle reazioni e non gli equilibri. Se un equilibrio è favorevole non significa che la velocità di conversione Reagenti-Prodotti sia elevata, ma significa che l'energia libera dello stato base dei prodotti (P) è minore di quella del substrato (S) e quindi l'equilibrio favorisce P. L'equilibrio non viene modificato da un catalizzatore (enzima). Tra S e P (reagenti e prodotti) esiste una barriera energetica. Per fare avvenire la reazione, le molecole devono superare questa barriera e quindi devono raggiungere un livello energetico più alto. Questo punto è detto stato di transizione.

Energia di attivazione: differenza di energia dello stato di transizione e dello stato di base. Un'elevata energia di attivazione corrisponde a una bassa velocità della reazione. Gli enzimi quindi aumentano la velocità della reazione abbassando l'energia di attivazione. Il punto di equilibrio della reazione rimane inalterato.

Energia di legame: Energia libera rilasciata dopo ogni interazione che viene a formarsi. L'energia di legame è la fonte principale di energia libera usata dall'enzima per abbassare l'energia di attivazione della reazione. La specificità si riferisce alla capacità di un enzima di discriminare tra composti simili, ma allo stesso tempo chimicamente diversi. Se ho due atomi a distanza ottimale ho un'interazione, se sono troppo lontani non ho interazione, se troppo vicini ho repulsione.

La cinetica enzimatica

La cinetica di Michaelis-Menten descrive l'andamento della velocità di una reazione, catalizzata da enzimi, al variare della concentrazione del substrato. Il modello cinetico spiega come all'aumentare della concentrazione del substrato disponibile all'enzima (considerando il numero di enzimi costante), la velocità della reazione aumenti vertiginosamente fino al raggiungimento di un massimo, chiamato Vmax. Al raggiungimento della Vmax, la reazione ha raggiunto la velocità massima possibile semplicemente perché è presente tanto substrato da saturare tutto l'enzima presente in soluzione, ed un'ulteriore aggiunta di substrato non aumenterebbe la velocità della reazione, in quanto non verrebbe più attaccato da enzimi. Ciò avviene perché non sono più presenti enzimi liberi, ma solo forme enzimatiche legate al substrato.

V = Vmax*[S] / Km+[S]

Vmax → Velocità massima che la reazione è in grado di raggiungere, determinando una situazione nella quale tutti gli enzimi liberi si sono trasformati nel complesso ES e, di conseguenza, non vi sono più enzimi liberi in soluzione:

Vmax = K2*[E]t in questa situazione ES=Et

Km → è un insieme di costanti che rappresenta la concentrazione di substrato necessaria affinché la reazione abbia velocità pari a metà della velocità massima (Vmax).

Km = K-1 + K2 / K1

La costante di Michaelis-Menten (Km) è una grandezza caratteristica di ciascun enzima. Essa è un termine che indica quantitativamente l'affinità tra un enzima e il suo substrato. Più è basso il valore di Km e più bassa sarà la concentrazione di substrato che permette di raggiungere un valore di velocità di reazione pari alla metà della velocità massima, il che indica una alta affinità dell'enzima per il substrato. Più è alto il valore di Km, più substrato servirà alla reazione per raggiungere una velocità pari alla metà della Vmax, il che indica una bassa affinità dell'enzima per il substrato.

• Km bassa → Alta affinità enzima-substrato
• Km alta → Bassa affinità enzima-substrato

Kcat → è il numero di turnover, ovvero il numero di molecole di substrato che vengono trasformate in prodotto nell'unità di tempo da una singola molecola enzimatica, in una condizione di completa saturazione enzimatica.

Kcat = Vmax/ET

ET = concentrazione totale enzimatica = E + ES

Le velocità delle reazioni enzimatiche vengono misurate in condizioni di stato stazionario. Costante specificità → Kcat/Km → numero di reazioni che un sito attivo catalizza per secondo. La costante di specificità misura la specificità dell'enzima per il suo substrato. Più è alto questo rapporto, "migliore" è l'enzima.

Inibitori

Gli enzimi possono essere inibiti attraverso molecole inibitrici, che interferiscono con la catalisi, rallentando o bloccando le reazioni enzimatiche. Esistono due tipi di inibizioni:

• Reversibile, che può essere:
  • Competitiva: la molecola inibitrice compete con il substrato per legarsi al sito attivo dell'enzima. Quando la molecola inibitrice occupa il sito attivo, impedisce al substrato di legarsi, non permettendo l'attività catalitica dell'enzima. Strutturalmente le molecole sono spesso simili al substrato, ma legandosi all'enzima non consentono l'attività catalitica. Poiché l'inibitore si lega reversibilmente all'enzima, la competizione substrato-inibitore può essere superata dal substrato aumentando la concentrazione di quest'ultimo;
  • Incompetitiva: la molecola inibitrice si lega a un sito distinto da quello del substrato e solo al complesso ES. Si osservano solo per gli enzimi con due o più substrati;
  • Non competitiva: si lega ad un sito diverso dal sito attivo, ma può legarsi sia a E che a ES. Si osserva solo per gli enzimi con due o più substrati.
• Irreversibile: si lega covalentemente all'enzima eliminando i gruppi funzionali essenziali per l'attività dell'enzima e modificando in modo irreversibile la forma del sito attivo e la conformazione della molecola enzimatica annullando l'attività enzimatica.

Punto di vista energetico

2° Principio termodinamica: qualsiasi processo naturale aumenta il disordine. Reazioni esoergoniche: liberano energia, sono spontanee, seguono leggi termodinamiche (meno energia → meno ordine), prodotti aventi livello energetico più basso dei reagenti, l'energia liberata è necessaria per produrre lavoro, espulsa come calore o dispersa ambiente. Reazioni endoergoniche: reazioni che necessitano energia per passare da un livello energetico basso ad uno più alto, contrastano 2° principio termodinamica, diminuiscono il disordine producendo ordine.

Per permettere la realizzazione di quanto detto, le nostre cellule accoppiano ad una reazione endoergonica (ΔG) una esoergonica che liberi un quantitativo di energia maggiore di quella che la reazione richiede in maniera tale che la somma della variazione di energia libera (ΔG) di entrambe le reazioni sia negativa (-ΔG), facendo divenire l'intero processo esoergonico. Le fonti di energia libera usate dalle nostre cellule derivano prevalentemente dalla rottura di gruppi fosfato di molecole di ATP e GTP. Le reazioni chimiche tendono ad avvenire spontaneamente fino a raggiungere uno stato di equilibrio, in cui i reagenti si trasformano in prodotti con la stessa velocità con cui i prodotti si trasformano in reagenti. Arrivati a questa condizione, ΔG=0 in quanto l'energia liberata dai reagenti per trasformarsi in prodotti viene utilizzata immediatamente dai prodotti per trasformarsi in reagenti, di conseguenza non si ha energia per produrre lavoro. Variazione di energia libera (ΔG) = indica quanto il sistema è lontano dal punto di equilibrio.

Nella cellula, la demolizione dell'ATP avviene in maniera spontanea: tutti gli organismi viventi mantengono una concentrazione di ATP ben lontana dalla concentrazione all'equilibrio, garantendo il prelievo d'energia dalla demolizione di tale molecola. Se si raggiungesse l'equilibrio, si avrebbe l'arresto dei processi di demolizione di ATP (tutte le reazioni chimiche procedono verso il raggiungimento dell'equilibrio = stabilità). I sistemi viventi non sono mai in equilibrio con l'ambiente che li circonda e i continui scambi spiegano come gli organismi possono creare ordine al loro interno senza andare contro il 2° principio della termodinamica (le reazioni avvengono con l'obiettivo di raggiungere un equilibrio che non verrà mai raggiunto).

Produzione di energia a partire dall'ATP

L'ATP, adenosintrifosfato, molecola costituita da una base azotata, l'adenina, legata al ribosio e a tre molecole di fosfato, viene considerata un coenzima, una sostanza non proteica che si unisce all'enzima per permettergli di svolgere l'attività di catalizzatore. L'energia immagazzinata nell'ATP deriva dalla degradazione di macromolecole (carboidrati, proteine e lipidi), degradazione che può avvenire in presenza o assenza di ossigeno.

Idrolisi: degradazione di macromolecole in presenza di ossigeno, con la creazione (a partire dalla molecola di ATP) di una molecola di ADP (adenosinadifosfato) e di un gruppo fosfato.

ATP + H₂O → ADP + HPO₄^2- + energia libera

Questa reazione è catalizzata dall'enzima ATPasi, il quale accelera la reazione, andando ad abbassare l'energia di attivazione. Fosforilazione: degradazione di macromolecole in assenza di ossigeno, nella quale l'ADP, addizionata ad un gruppo fosfato e ad energia libera (reazione endoergonica), porta alla formazione di una nuova molecola di ATP e una di H₂O.

ADP + HPO₄^2- + energia libera → ATP + H₂O

L'ATP è al centro di un ciclo di accoppiamento energetico in cui, prima l'ADP cattura energia (liberata dalle reazioni esoergoniche) per trasformarsi in ATP e successivamente, attraverso idrolisi, viene nuovamente scissa in ADP (reazione endoergonica).

Glucosio (C₆H₁₂O₆)

È un combustibile chimico dal quale viene ottenuta energia immagazzinata sotto forma di ATP. Il glucosio, una volta che si trova all'interno della cellula, è metabolizzato (subisce una sequenza di reazioni biochimiche chiamata glicolisi) per produrre energia. Nel fegato e nei muscoli, il glucosio è immagazzinato sotto forma di glicogeno con lo scopo di produrre energia.

Glicolisi

La glicolisi è la prima tappa della respirazione cellulare. Consiste nella scissione delle molecole di glucosio ed è articolata in 10 reazioni (le prime cinque non ossidative), precedute da una fase preparatoria. Ciascuna reazione è catalizzata da un diverso enzima. Il prodotto di ogni reazione rappresenta il substrato (molecola sulla quale agisce un enzima) per l'enzima della reazione successiva. È un processo citoplasmatico poiché tutti gli enzimi che ne prendono parte sono sparsi nel citoplasma.

Fase preparatoria

La fase preparatoria è una fase non ossidativa, nella quale il glucosio viene scisso in due molecole aldeidiche, identiche, a 3 atomi di carbonio, così da ricavare, nella seconda fase, 2 ATP dall'ossidazione delle due aldeidi. La glicolisi, vera e propria, possiamo suddividerla in due gruppi di reazioni da cinque fasi l'uno.

Reazione 1 (irreversibile)

Durante la reazione 1, la molecola di glucosio viene fosforilata attraverso l'enzima esochinasi, portando alla formazione di glucosio-6-fosfato. Il gruppo -OH del glucosio, in posizione 6, va a legarsi ad un gruppo fosfato dell'ATP costituendo glucosio-6-fosfato.

Glucosio + ATP → Esochinasi → Glucosio-6-Fosfato + ADP + P_i

Questa reazione è irreversibile in quanto endoergonica, cioè per formare la nuova molecola (glucosio-6-fosfato) serve energia e viene utilizzata quella derivante dalla rottura di un gruppo fosfato dell'ATP che si trasformerà in ADP. La rottura di questo legame libera un quantitativo di energia elevato. Il glucosio, una volta trasformato in glucosio-6-fosfato, non è più in grado di uscire dal citoplasma della cellula poiché fosforilato. Tutte le molecole fosforilate non possono attraversare la membrana.

Reazione 2 (reversibile)

Durante la reazione 2, il glucosio-6-fosfato, attraverso l'enzima fosfoglucoisomerasi, viene trasformato in fruttosio-6-fosfato. Il glucosio-6-fosfato (aldeide) diventa fruttosio-6-fosfato (chetone). Tale reazione è importante poiché i cambiamenti di struttura permettono trasformazioni che con la struttura precedente non erano possibili.

Glucosio-6-Fosfato → Fosfoglucoisomerasi → Fruttosio-6-Fosfato

Reazione 3 (irreversibile)

Durante la reazione 3, il fruttosio-6-fosfato, attraverso l'enzima fosfofruttochinasi, in presenza di ATP, addiziona un secondo gruppo fosfato (in posizione C1) all'anello di fruttosio-6-fosfato, costituendo fruttosio-1,6-bisfosfato.

Fruttosio-6-Fosfato + ATP → Fosfofruttochinasi → Fruttosio-1,6-Bisfosfato + ADP + H

Nelle prime tre reazioni la struttura del glucosio è stata modificata utilizzando ATP in quanto l'obiettivo è quello di produrre un quantitativo di energia maggiore di quella consumata.

Reazione 4 (reversibile)

Durante la reazione 4 avviene l'inizio della degradazione della molecola. Il fruttosio-1,6-bisfosfato, tramite l'enzima aldolasi, viene scisso in due molecole diverse tra loro: gliceraldeide-3-fosfato e diidrossiacetonfosfato. Si passa dunque, da una molecola a 6 atomi di carbonio a due molecole con 3 atomi di carbonio ciascuna.

Fruttosio-1,6-Bisfosfato → Aldolasi → Gliceraldeide-3-Fosfato + Diidrossiacetonfosfato

Reazione 5 (reversibile)

Durante la reazione 5, dal momento che seguire due vie metaboliche differenti sarebbe energeticamente dispendioso, il diidrossiacetonfosfato viene trasformato in gliceraldeide-3-fosfato dall'enzima trioso fosfato isomerasi. L'enzima è in grado di prelevare un H da un atomo di carbonio, spostandolo su un altro vicino. Così facendo il trioso passa dalla forma chetonica a quella aldeidica.

Diidrossiacetonfosfato → Trioso fosfato isomerasi → Gliceraldeide-3-Fosfato

Alla fine di questo ciclo di cinque reazioni, sono state spese 2 ATP, si sono formate 2 gliceraldeide-3-fosfato e non si è ricavato alcun tipo di energia. Le reazioni del prossimo ciclo permetteranno alla cellula di ricavare energia dalla degradazione della gliceraldeide-3-fosfato.

Fase ossidativa

Le seguenti reazioni liberano energia e producono ATP. Si assiste dunque ad una serie di ossidazioni che, partendo dalle due molecole di gliceraldeide-3-fosfato portano alla produzione di due molecole di piruvato. Da questo gruppo di ossidazioni si produrrà energia immagazzinata sotto forma di ATP e NADH. La sesta reazione è possibile in seguito alla presenza del coenzima NAD che, associato all'enzima, ha la capacità di ridursi e ossidarsi (ridursi: accettare elettroni; ossidarsi: cedere elettroni) in maniera reversibile.

Nella sua forma ossidata, lo troviamo sotto forma di NAD⁺; nella sua forma ridotta, lo troviamo sotto forma di NADH. Il NAD è in grado di legarsi ad una molecola ossidandola: l'ossidazione di quest'ultima provoca, a sua volta, la riduzione del coenzima che si trasformerà in NADH (la molecola ha ceduto 2H). Altra proprietà del NAD è di trasportare gli elettroni durante tutto il ciclo della respirazione fino alla catena di trasporto degli elettroni (ultima fase della respirazione cellulare).

Reazione 6 (reversibile)

Durante la reazione 6, il gruppo aldeidico della gliceraldeide-3-fosfato va a legarsi con l'enzima gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi, attraverso un legame covalente. In tale reazione si evidenziano due processi, uno di ossidazione e uno di fosforilazione.

Ossidazione: il gliceraldeide-3-fosfato viene ossidato ad acilfosfato (composto ad alta energia), reazione mediata dal coenzima NAD⁺ che si riduce in NADH. Fosforilazione: viene aggiunto un gruppo fosfato (il quale è presente nell'ambiente di reazione) al C1 (gruppo carbossilico), portando alla rottura del substrato e comportando la formazione della nuova molecola 1,3-bisfosfoglicerato. Questo procedimento avviene per entrambe le molecole di gliceraldeide-3-fosfato, andando quindi a produrre due molecole di NADH.

Gliceraldeide-3-Fosfato + NAD⁺ → 1,3-bisfosfoglicerato + NADH