Replicazione del DNA e meccanismi di riparazione di errori

Replicazione del DNA

Prima di entrare nel merito del processo di replicazione del DNA, è bene esaminare a priori la struttura del DNA e le finalità per le quali avviene tale processo di duplicazione genomica.

In Interfase G1, normalmente, la cellula dispone di un corredo cromosomico monocromatidico, perché ridotto del processo di biogenesi. In Interfase S, una volta superato il G1/S checkpoint, la cellula è pronta ad avviare l'attività replicativa del DNA finalizzata per lo più alla corretta redistribuzione del materiale genetico alle cellule figlie, che dovranno disporre, nel caso della mitosi, di un genoma quantitativamente e qualitativamente identico a quello della cellula di partenza. È in interfase S che i cromosomi da essere monocromatidici diventano dicromatidici. La struttura del DNA è stata resa nota nell'Aprile del 1953, più precisamente il 25 Aprile del 1953, quando James Watson e Francis Crick hanno scoperto la sua doppia elica.

Crick pubblicarono su Nature un articolo che riportava tutte le peculiarità della macromolecola.

1. Il DNA è un grande polimero a doppio filamento, nel quale l'impalcatura madre è rappresentata da due filamenti polinucleotidici ai quali è associato un momento rotazionale destrogiro.

2. Ogni filamento è un polimero a livello del quale il monomero è rappresentato dalla struttura nucleotidica; a livello dei singoli nucleotidi, senza eccezioni, sono individuabili tre fondamentali componenti: un furanosio, cioè un pentoso ciclico a cinque atomi di carbonio, un fosfato inorganico ed una base azotata.

3. Il pentoso è una molecola glucidica ciclica, un desossiribosio, che a livello del secondo atomo di carbonio lega a sé due atomi di idrogeno, a differenza della controporte ribonucleica nella quale lo zucchero, il ribosio, lega a sé un atomo di idrogeno ed una funzione ossidrilica -OH. Il gruppo fosfato ha un ruolo centrale.

nella formazione del legame internucleotidico; esso, in associazione aldesossiribosio, costituisce l'intelaiatura fondamentale del DNA. In ultima analisi le basi azotate, purinee pirimidine, fra le quali intercorre un rapporto di complementarietà. Le purine, che comprendono adenina e guanina, sono dei composti a doppio anello, nei quali uno è pentatomico e l'altro invece esatomico, le pirimidine, che comprendono timina, guanina ed uracile (nell'RNA), sono invece composti a singolo anello, esatomico.

4. Considerando le varie interazioni di carattere chimico, in prima istanza è bene ricordare la natura del legame internucleotidico; esso viene definito fosfodiesterico. La formazione del legame fosfodiesterico prevede che la funzione ossidrilica dell'ortofosfato del nucleotide in aggiunta interagisca, tramite reazione di condensazione, con la funzione idrossilica in posizione 3 del pentoso. La formazione di tale legame determina la perdita di una

molecola d'acqua. Ogni nucleotide in aggiunta non dispone di un solo fosfato inorganico, bensì di tre: dATP, dGTP, dCTP e dTTP. I deossinucleosidi trifosfato sono fondamentali poiché la scissione dei due legami fosfoanidridici che intercorrono tra il fosfato alfa e beta, concede l'energia necessaria alla formazione del legame. Questo implica che la polimerizzazione di un filamento polinucleotidico rappresenti un processo endoergonico. Le basi azotate si legano al furanosio in corrispondenza del carbonio 1 dello stesso, tramite un legame N-glicosidico. Le basi azotate, nel loro insieme, interagiscono secondo le regole della complementarietà di Cargaff, istituendo delle interazioni deboli ad idrogeno.

La cristallografia della Franklin, eseguita negli anni '40, ha messo in luce un'altra importante caratteristica. Le basi azotate sono delle molecole planari che, a livello del core idrofobo del DNA, vanno impilandosi l'una sull'altra con un

DNA funge da stampo per la sintesi di un nuovo filamento complementare. A conclusione della replicazione si hanno due molecole di DNA, ognuna delle quali contiene un filamento originale e uno di nuova sintesi. - Modello dispersivo: secondo il modello dispersivo, durante la replicazione del DNA, i filamenti originali si frammentano e si mescolano con i filamenti di nuova sintesi, creando una mescolanza di filamenti originali e nuovi. Questi modelli sono stati oggetto di studio e sperimentazione per molti anni, fino a quando l'esperimento di Meselson-Stahl nel 1958 ha confermato definitivamente il modello semiconservativo come il meccanismo principale di replicazione del DNA.

Il DNA funge da stampo per un nuovo scheletro polinucleotidico. Le due molecole risultanti possiedono un filamento appartenente alla molecola di DNA d'origine ed un filamento neo-sintetizzato.

Modello dispersivo: secondo il modello dispersivo, nel corso della replicazione, ogni filamento del DNA viene replicato ma a tratti, facendo sì che le molecole finali abbiano dei filamenti nei quali sono presenti tratti del DNA parentale e tratti di DNA neo-sintetizzato.

DI DARIO SANTULLI

Per la dimostrazione del modello semiconservativo di replicazione del DNA, estremamente utile fu l'esperimento di Meselson e Stahl. I due ricercatori posero dei batteri Escherichia coli in una coltura contenente l'isotopo pesante dell'azoto, cioè l'N. Quindi i due si assicurarono che i batteri Escherichia coli interagissero a lungo tempo con l'isotopo, con la finalità di ottenere delle molecole di DNA nelle quali l'azoto pesante fosse stato incorporato per intero.

Cioè l'obbiettivo era ottenere una molecola di DNA nella quale ambedue i filamenti possedessero l'isotopo dell'azoto. Successivamente i due sfruttarono la tecnica di centrifugazione in gradiente di densità tramite l'impiego del cloruro di cesio: una volta prelevati i campioni di DNA di interesse, essi vengono posti in una provetta contenente cloruro di cesio a densità crescente verso il fondo. Le molecole migrano in soluzione verso il fondo, fermandosi là dove la soluzione ha una densità analoga a quella della molecola medesima. Inizialmente si osservò che i campioni si arrestavano in basso. Entrambi i filamenti di DNA hanno incorporato azoto pesante. In seguito, i due posero i batteri in una coltura contenente l'isotopo leggero dell'azoto, l'N , in maniera tale che le molecole di DNA potessero incorporarlo. Si osservò in seguito che i campioni di DNA, prelevati ad intervalli di tempo regolari esottoposti a centrifugazione in gradiente di densità, andavano ad organizzarsi in una banda leggera sempre più marcata, con il progredire delle generazioni di DNA replicato. Replicazione del DNA - passaggi e caratteristiche La replicazione del DNA è un processo estremamente regolato e preciso, tanto è vero che il tasso di errore relativo ad un appaiamento sbagliato fra le basi azotate è pari a circa una ogni miliardo di basi. La complementarietà delle basi azotate è un meccanismo sì preciso, ma non così tanto: un appaiamento errato ogni 100kbp. Questo dimostra che esistono altri complessi molecolari che mediano la replicazione:

1. Enzimi di denaturazione del DNA.
2. Proteine leganti il singolo filamento o SSBs (single-strand binding proteins).
3. DNA polimerasi: la prima DNA polimerasi ad essere stata scoperta è stata la DNA polimerasi-1, un'importante componente enzimatica presente a livello procariotico. Tuttavia,

Con il progredire dellaricerca, è stato dimostrato non solo che i batteri esprimono più tipologie di DNA polimerasi, come la DNA polimerasi-3 (utile nell'elongazione del filamento lento e veloce), ma è stato inoltre rilevato che anche gli eucarioti, compreso naturalmente l'organismo umano, esprimono enzimi di simile natura. Le DNA polimerasi designano una grande famiglia di complessi enzimatici multi subunità, che a seconda delle loro caratteristiche rispondono a funzioni differenti; le caratteristiche che le accomunano sono due:

1. Tutte le polimerasi riconoscono una parziale doppia elica di DNA, cioè una molecola che, in corrispondenza della sua estremità 3' lega, in maniera complementare, un oligonucleotide di innesco;
2. Le DNA polimerasi possono polimerizzare solo nella direzione 5' a 3', dove 5 e 3 sono gli estremi del filamento di nuova sintesi.

4. Nucleotidi ad alta energia: deossinucleosidi-trifosfato.

5. Oligopeptide

La replicazione del DNA, tanto nei procarioti quanto negli eucarioti, avviene in corrispondenza di sequenze di origine della duplicazione, cioè regioni specifiche in prossimità delle quali intervengono enzimi e proteine che promuovono la denaturazione del DNA.

Replicazione del DNA procariotico

Il DNA procariotico ha una struttura estremamente meno complessa, se paragonata al genoma eucariotico. Infatti esso si organizza in un'unica struttura cromosomica circolare, a livello della quale è individuabile una sola sequenza di origine della replicazione. A livello della sequenza ORI si legano dei fattori proteici di promozione della replicazione che, con l'aiuto delle elicasi, promuovono la denaturazione del materiale genetico. Man mano che la replicazione procede, naturalmente in senso inverso, diventa sempre più evidente una struttura ellissoidale, nota come bolla di replicazione.

sempre più ampia grazie alle elicasi. Nell'unicabolla di replicazione procariotica, le strutture ad arco della bolla si riferiscono ai due filamenti stampo di DNA in prossimità dei quali si legano proteine che impediscono la ri-associazione dei due filamenti. Replicazione del DNA eucariotico Il genoma eucariotico è sicuramente più complesso rispetto a quello procariotico, sia perché non si parla di un unico cromosoma, ma di ben 46 cromosomi, sia perché tali cromosomi non hanno una struttura circolare ma lineare. A livello di ogni cromosoma è individuabile un numero multiplo di sequenze di origine della duplicazione, infatti si stima che complessivamente, considerando l'intero asset cromosomico, siano presenti circa 30.000 origini della duplicazione, distanziate vicendevolmente da interzone della lunghezza compresa tra 50 e 100bp. Ogni origine della duplicazione definisce una regione che prende il nome di replicone. Pertanto, in ununico cromosoma, ci saranno più sequenze di origine della duplicazione, più bolle di duplicazione e più repliconi, attivati in maniera asincrona nel corso dell'int