Replicazione del DNA in procarioti ed eucarioti

Il meccanismo di replicazione del DNA

Nel meccanismo di replicazione ci sono 3 DNA polimerasi coinvolte: DNA polimerasi α-primasi, è una DNApol che fa anche da primasi, quindi forma il primer e una volta sintetizzato lo allunga di circa 20-30 dNTP. Successivamente questa viene sostituita dalle DNA polimerasi che portano avanti la sintesi dei due filamenti. La DNA polimerasi δ è specializzata per lavorare solo sul filamento lento, mentre la DNA polimerasi ε è specializzata per lavorare sul filamento veloce. Quindi non si ha un oloenzima ma due isoforme della DNApol. La DNA pol. α deve essere sostituita perché questa non ha attività esonucleasica 3'-5', quindi non può correggere nucleotidi mal appaiati e potrebbe portare a troppi errori. In più la DNA pol. δ e la DNA pol. ε sono molto più processive della DNA pol. α, quindi molto più efficienti nel processo di sintesi. Le proteine del complesso CMG sono nuove e non si

Trovano nei procarioti. Questo complesso è collegato alla regolazione del processo di replicazione e tiene conto del ciclo cellulare. Nei procarioti non si ha questo complesso in quanto manca la regolazione del ciclo cellulare, in quanto la replicazione è collegata con la divisione cellulare.

Negli eucarioti il processo di replicazione è più lento di quello procariotico, viene compensato però dalla formazione di più origini di replicazione. Anche i frammenti di Okazaki negli eucarioti sono più corti dei frammenti procariotici.

La DNA elicasi eucariotica scorre sul filamento veloce, quindi ha polarità inversa rispetto all'elicasi procariotica che scorre sul filamento lento.

Terminazione della replicazione nei procarioti: il DNA procariotico è circolare ed ha un solo punto di origine di replicazione: questa poi avviene in direzioni opposte. Dobbiamo avere un punto di termine che si trova nel lato opposto all'origine di replicazione.

quindi a 180° dall'origine di replicazione. Le sequenze di termine che si trovano qui sono le sequenze Ter e abbiamo una sequenza Ter per la forcella replicativa che si muove in senso orario e una sequenza Ter per la forcella replicativa che si muove in senso antiorario. Queste sequenze Ter sono riconosciute da proteine specifiche chiamate Tus, formando il complesso Tus-Ter. Esistono quindi due complessi Tus-Ter, essendo due le forcelle di replicazione. Il complesso che si trova nel lato del senso orario funge da blocco per la forcella replicativa che si muove in direzione antioraria e viceversa il complesso sul lato antiorario blocca la forcella replicativa che si muove in direzione oraria. Terminazione della replicazione negli eucarioti: il telomero I cromosomi eucariotici sono molecole lineari e quando si ha l'ultimo processamento dei frammenti di Okazaki si osserva un primer che non può essere sostituito. Quindi con cicli successivi di replicazione si ha perdita di

Il materiale genetico subisce un processo di erosione che coinvolge i telomeri. Questo problema riguarda le estremità telomeriche, dove non ci sono sequenze codificanti ma sequenze altamente ripetute. Nei vertebrati, la ripetizione telomerica è una sequenza ricca in C-G e forma un'estremità sporgente al 3'. Per risolvere il problema di erosione, alcune cellule utilizzano la telomerasi, un'enzima che allunga il telomero e compensa l'accorciamento replicativo. La telomerasi è composta da una componente proteica chiamata TERT (Telomerase Reverse Transcriptase), che funziona come trascrittasi inversa. La telomerasi ha anche associata una molecola di RNA chiamata TERC (Telomerase RNA Component). Una proteina associata a un ribonucleotide è chiamata ribozima. Durante l'allungamento del telomero, la telomerasi non riempie il buco causato dal processamento dei frammenti di Okazaki, ma allunga l'estremità sporgente.

La componente a RNA si appaia alle ripetizioni telomeriche in corrispondenza del filamento sporgente. Dopo che è avvenuto l'appaiamento la parte proteica inizia ad aggiungere deossi-ribonucleotidi e come stampo usa l'RNA incluso nella telomerasi, che lavora quindi da trascrittasi inversa.

La proteina si sposta ogni volta, allungando il telomero finché non si ferma. A questo punto si forma un buco che viene colmato dalla DNA pol. α-primasi.

Questo processo che salvaguarda i telomeri non avviene in tutte le cellule, infatti la telomerasi esiste in forma attiva solo nelle cellule germinali, embrionali e staminali. Le cellule somatiche hanno la telomerasi inattiva, quindi tutte le nostre cellule hanno l'erosione telomerica finché non vanno incontro a senescenza replicativa, cioè morte cellulare. Le cellule tumorali acquisiscono la capacità di non morire perché riaccendono la telomerasi, per questo possono proliferare in modo

indefinito.
Il telomero non è DNA nudo ma è associato a complessi proteici. La telomerasi si blocca perché aumenta la concentrazione di questi complessi proteici man mano che avanza sul telomero.
Il telomero non si trova libero ma questo va ad insinuarsi con l'estremità sporgente in un'ansa che si forma nel DNA chiamata D-loop. Quindi si forma un'ansa con tre filamenti, in quanto l'estremità sporgente potrebbe essere vista come un danno del DNA e quindi in questo modo viene mascherata.
A livello del telomero inoltre abbiamo sequenze con molte guanosine, quindi tra queste si formeranno degli appaiamenti di Hoogsten andando a formare il quartetto G.
Questi due livelli strutturali servono per stabilizzare tutta la struttura del telomero.
Controllo della replicazione nei procarioti
I meccanismi di controllo della replicazione sono diversi tra procarioti ed eucarioti, in quanto negli eucarioti si parla di regolazione della replicazione nel

Il ciclo cellulare, specialmente nella fase S. Nei procarioti la replicazione del DNA è basata sullo stato nutrizionale e di crescita della cellula stessa. Il processo di regolazione avviene all'inizio del meccanismo, in modo da evitare dispendi energetici inutili. Questo vuol dire controllare l'attivazione delle origini di replicazione, in quanto una volta che si inizia la replicazione, la cellula è destinata ad andare incontro a divisione cellulare. L'origine di replicazione si attiva una sola volta e si attiverà nuovamente con una seconda divisone cellulare. Se sono in un buono stato nutrizionale, i batteri possono azionare una seconda volta l'origine di replicazione e quindi effettuare una continua crescita. L'attivazione di OriC avviene grazie alla presenza degli 11 siti di controllo, dove ci sono sequenze chiamate GATC. Questa sequenza viene metilata sui residui di adenina attraverso gli enzimi metilasi o metiltransferasi, nello specifico le

metilasi che operano la metilazione sulle adenine si chiamano Dammetilasi. Quindi quando si accende l'origine di replicazione e va incontro a duplicazione ci si trova in uno stato di emimetilazione, cioè il filamento parentale è metilato mentre il filamento di nuova sintesi risulterà non metilato finché non verrà metilato dalle Dam metilasi. Questo stato di emimetilazione perdura per un certo tempo, perché a livello dell'origine di replicazione la densità di questi siti è abbastanza alta, in quanto la Dammetilasi deve metilare 11 siti. In questo lasso di tempo di emimetilazione interviene la proteina SeqA, che lega al DNA emimetilato e sequestra l'origine di replicazione di nuova sintesi. Quindi fa in modo che l'origine di replicazione di nuova sintesi non venga completamente metilata finché la cellula non completa il ciclo cellulare.

Controllo della replicazione negli eucarioti: il nucleosoma

eucarioti il discorso è più complesso, qui dopo la replicazione bisogna riassemblare anche i nucleosomi. I nucleosomi vanno nuovamente sintetizzati perché gli istoni che avevamo in precedenza non bastano performarli nuovamente. Quindi quando passa il replisoma si ha un disassemblaggio dei nucleosomi preesistenti, quindi separa l'eterotetramero H3-H4 dall'eterodimero H2A-H2B. Sul filamento di nuova sintesi si riassemblano i nucleosomi, però prendendo casualmente un po' di proteine istoniche di vecchia sintesi e mischiandole con proteine istoniche di nuova sintesi. Gli istoni vengono sintetizzati in grossa quantità e velocemente durante la fase S, in quanto i geni che codificano per le proteine istoniche sono ripetuti all'interno del genoma. Le proteine istoniche sono durevoli, quindi permangono nella fase del ciclo cellulare, invece l'mRNA viene degradato quasi immediatamente. L'assemblaggio dei nucleosomi viene assistito da

proteine chiamate Chaperon, cioè proteine che aiutano il folding di strutture proteiche. Queste proteine sono la NAP-1, specializzata nel caricare l'eterodimero H2A-H2B e la CAF-1, specializzata nel caricare l'eterotetramero H3-H4.

Controllo della replicazione negli eucarioti: complesso CDK-ciclina

Anche negli eucarioti bisogna fare in modo che i cromosomi vengano duplicati una sola volta. Il controllo del corretto passaggio da una fase all'altra del ciclo cellulare avviene attraverso proteine chinasiche chiamate CDK (chinasi ciclina dipendente). Le CDK riescono a lavorare quando sono complessate con altre proteine, cioè le cicline.

La concentrazione delle cicline si alza e si abbassa a seconda del momento del ciclo cellulare. A seconda della concentrazione del complesso CDK-ciclina si riesce a regolare il passaggio da una fase all'altra del ciclo cellulare. Quindi queste chinasi controllano ogni punto del ciclo cellulare.

Queste chinasi vengono regolate

Attraverso fosforilazioni e defosforilazioni a carico di aa presenti nella proteina. Quando la Tyr in posizione 15 è fosforilata si ha un effetto inibitorio della chinasi, se invece è defosforilata la proteina si attiva. Questa cosa avviene anche sulla Thr in posizione 160.

Controllo della replicazione negli eucarioti: il ciclo cellulare

Negli eucarioti si va a selezionare e preparare quelle che saranno le origini di replicazione, questa preparazione avviene quando si esce dalla fase M e si passa alla fase G1. In questo momento si forma un complesso chiamato complesso pre-replicativo. Questo complesso non è altro che prevedere l'aggancio sulle origini di replicazione da parte della proteina iniziatrice ORC. Una volta che la proteina iniziatrice lega all'origine di replicazione intervengono le proteine posizionatrici delle elicasi. Verranno caricate due DNA elicasi, in quanto si formano due forcelle replicative. Nella fase G1 il processo termina qui, quindi

ilcomplesso pre-replicativo è formato da: proteine iniziatrici, proteine posizionatrici delle elicasi e DNA elicasistessa. Quindi in questa fase ci stiamo preparando all'attivazione delle origini di