Processi industriali chimici e biochimici

Processi industriali

Esame e struttura

Trotta e Barolo in un unico scritto, 4 domande aperte (30/30, 3 di Barolo e una di Trotta) più un problema (esercizio con la calcolatrice, 3 punti). La data effettiva è quella dell'“esame scritto”, il voto viene poi verbalizzato all'“appello verbalizzante”.

Introduzione

Si fa una correlazione tra i processi biotecnologici e quelli chimici per comprendere le differenze. I processi biochimici sono delle vie parallele all'industria petrolchimica di produzione di alcuni materiali. Per alcuni processi ci sono ancora dei punti da migliorare, per alcuni si può fare un paragone a livello di costi e di Life Cycle Assessment (LCA) (come la produzione e più tutta la vita di un prodotto influenza una serie di parametri). In alcuni casi i processi chimici sono talmente ottimizzati che hanno un impatto minore rispetto a quello biotecnologico.

Antibiotici, vitamine e ormoni sono i processi biotecnologici più importanti. Queste molecole possiedono una certa quantità di centri stereogenici (danno chiralità) quindi è molto più facile tramite una biosintesi. Si producono anche sciroppi zuccherini, destrosio, etanolo, amminoacidi, acido citrico.

I motivi per preferire processi biotecnologici a processi chimici sono l'utilizzo di materie prime rinnovabili, biocompatibili, biodegradabili. Si utilizzano dei processi enzimatici e dei processi a livello della cellula completa. Quelli che lavorano con gli enzimi purificati sono poco utilizzati in quanto è difficile che non abbia bisogno di cofattori che devono rigenerarsi, instabilità dell'enzima e costi di purificazione. Se si lavora con le cellule questi necessitano di ossigeno oppure lavorano in anaerobiosi. I processi aerobici sono tipici per gli antibiotici, vitamine e farmaci. La produzione di acido lattico, butanolo, acetone... sono di tipo anaerobico. Si usa anche la classificazione in base al tipo di attività del sistema enzimatico.

Classificazione dei processi biotecnologici

• In funzione del sistema enzimatico:
  • Processi microbiologici: utilizzano enzimi prodotti in situ da cellule vive, o che vengono mantenute in vita durante il processo di trasformazione del substrato aggiungendo al substrato elementi nutritivi.
  • Processi enzimatici: utilizzano enzimi preparati a parte e purificati.
• In funzione dell'energia del processo:
  • Anabolici: consumano energia.
  • Catabolici: liberano energia.
• In funzione dell'ambiente gassoso:
  • Anaerobici: in assenza di aria; fermentazioni per la produzione di etanolo, acetone, butanolo, acido lattico.
  • Aerobici: in presenza di aria; respirazioni per la produzione di acido acetico, acido citrico, antibiotici, vitamine.
• In funzione del tipo di attività del sistema enzimatico:
  • Crescita: sviluppo delle dimensioni di un solo microrganismo o di una colonia di microrganismi per riproduzione.
  • Assimilazione: processo anabolico di trasformazione dei componenti del substrato in costituenti del microrganismo. A questo tipo di attività si associa anche la crescita.
  • Dissimilazione: processo catabolico per produrre energia necessaria ai processi vitali. I microrganismi utilizzano sia il substrato che materiali di riserva presenti nelle loro cellule.
  • Biosintesi: processo anabolico di produzione di composti chimici all'interno della cellula in quantità maggiore di quella necessaria per le normali attività vitali.

Materie prime

La prima grossa differenza rispetto ai processi chimici è che nei processi biotecnologici non parto da delle materie prime sempre uguali e stoccate. Nel processo biotecnologico, soprattutto se utilizzo le cellule, devo avere dei nutrienti per la cellula: si deve avere una certa quantità di carbonio, di azoto e altri nutrienti che però variano in base a dove li prendo.

Esempio

Un esempio è il melasso che deriva dalla produzione dello zucchero: contiene saccarosio che però non può più cristallizzare, contiene anche altri nutrienti come amminoacidi, ceneri, sali minerali. Essendo uno scarto dell'industria alimentare per definizione è sempre diverso in base a dove viene prodotto e in base al periodo dell'anno. Tutti gli scarti hanno delle caratteristiche poco uniformi, ma a me serve utilizzare senza andare a purificarla. In questo modo io ho materie prime a scarto quasi nullo. Devo anche calcolare quanto incide il trasporto delle materie. Sono molto appetibili gli scarti prodotti a livello cittadino ma devo tenere conto di quanto devo modificarli prima di poterli accettare.

La cellula di per sé si nutre di carboidrati, ma ha problemi con i polimeri dei carboidrati. Quindi per la produzione devo dare alla cellula dei saccaridi solubili in acqua in modo che la cellula li possa utilizzare molto facilmente. Il fatto di lavorare in fase acquosa è una caratteristica dei processi biotecnologici ma può essere un limite. Molte volte i materiali di partenza e i prodotti che voglio ottenere non sono solubili o lo sono poco. Lavoro in impianti molto estesi rispetto alla quantità di prodotto che voglio produrre. Un impianto grosso da molti costi a livello di manutenzione e costo iniziale.

Le condizioni che vengono utilizzate sono gentili rispetto a quelle della chimica di base. Il range di temperatura in cui la maggior parte degli enzimi lavora è tra i 20 e i 40°C. Le pressioni sono basse e anche il pH è sempre intorno alla neutralità. Le materie prime dovendo essere trattate tramite dei microrganismi devono essere pretrattate per evitare delle contaminazioni da altri microrganismi. È necessaria una sterilizzazione, per poi inserire il microrganismo d'interesse.

Trattamento dei microrganismi

I tempi delle reazioni sono condizionati dal fatto che prima di iniziare la reazione nell'impianto devo preparare il microrganismo per l'inoculo. Ho bisogno di una quantità minima. Questi tempi sono quindi più lunghi rispetto a quelli dei processi chimici.

Preparazione inoculi

1. Fase in laboratorio: trattamento delle colture madri mediante coltivazione in capsule di petri o provette per ottenere la coltura principale o starter.
2. Fase in laboratorio: trasferimento in recipiente di maggiore capacità (0,5-2 litri) ove continuano a riprodursi su substrato sterilizzato.
3. Fase in reparto di produzione: trasferimento in recipiente più grande (2-20 litri) per ottenere quantità dimensionata al bioreattore. Ogni stadio di crescita richiede 10-20 ore (substrati liquidi), 50-100 ore (substrati solidi come gelatina, agar, amido).

Schemi d'impianto

La parte di cui ci occupano è il pezzo della fermentazione: cioè cosa succede quando facciamo la reazione vera e propria. In realtà si ha una parte prima della reazione e poi una grandissima parte di downstream che porta al prodotto finito. In realtà nelle aziende biotecnologiche dove avviene la reazione vera e propria è una parte ma non può essere la più costosa in quanto le purificazioni e le varie modificazioni. Quindi l'azienda dovendo produrre un utile è necessario che la produzione sia sostenibile anche dal punto di vista economico.

Reparti principali

• Preparazione reagenti (substrato e coltura)
• Fermentazione
• Separazione: sono molto importanti le fasi di recupero, separazione e purificazione del prodotto in quanto lavoro con quantità molto piccole. Si ha una bassa concentrazione di prodotto nel brodo di coltura quindi il costo elevato è rappresentato dal trattamento del brodo per l'isolamento del prodotto.

Vantaggi

Le prospettive d'impiego aumentano quando si alza il prezzo del petrolio e si ha un grande spazio di miglioramento dei processi. Lo spazio di ricerca è nella produzione di chemicals con parte di chimica e parte di biotecnologia, nelle manipolazioni genetiche di enzimi e microrganismi aventi specifiche selettività, maggior attività e resistenza a veleni, a temperature elevate, a variazioni di pH e nel miglioramento dei processi di separazione.

Avendo condizioni blande non è necessaria una grande quantità di energia e quindi molte possono lavorare solo con energie rinnovabili. Togliendo la parte degli antibiotici, l'acqua in uscita da questi impianti è facile da purificare, non richiede grandi costi. Gli effluenti sono più facili da trattare. Posso utilizzare i microrganismi per bonificare dei terreni. Si lavora quindi in condizioni nelle quali il microrganismo può usare quello che ci interessa senza morire.

Svantaggi

La non costanza delle caratteristiche delle materie prime che si riflette sull'andamento del processo e sulla qualità del prodotto reazioni in fase eterogenea e limitate al mezzo acquoso. I microorganismi sono attivi principalmente in ambiente acquoso e le materie prime non solubili in acqua.

Le materie prime e/o prodotti di reazione tossici per il microorganismo lo inattivano: si risolve operando in soluzioni diluite, ma ciò comporta elevati volumi degli impianti e elevati costi di investimento e di separazione, ad esempio nel caso si debba ricorrere all'evaporazione dell'acqua per recuperare il prodotto. Io devo lavorare alla condizione limite.

Dubbi sulla sicurezza dei prodotti della biotecnologia: le norme di sicurezza si traducono in significativi aumenti del costo finale del prodotto.

Processi enzimatici

I processi enzimatici si differenziano da quelli microbiologici in primo luogo per la natura delle materie prime utilizzate, che sono di norma sostanze chimiche ben definite nel primo caso. La produzione di fruttosio dagli sciroppi di glucosio tramite isomerizzazione. Questo processo avviene grazie a un enzima immobilizzato. La stessa cosa avviene per la preparazione dell'L-aspartico e dell'L-fenilalanina.

Gli enzimi sono catalizzatori con attività in genere superiore ai catalizzatori chimici. Un inconveniente tecnico per l'utilizzo di processi enzimatici biotecnologici a livello industriale è il problema che i catalizzatori richiedono dei cofattori: questo è il problema che blocca il passaggio da reazioni microbiologiche (con il microrganismo) a quelle enzimatiche. Altri inconvenienti sono che devono essere preparati ad elevati gradi di purezza e sono molto sensibili a veleni e relativamente poco stabili nel tempo.

Una trasformazione realizzata con un catalizzatore biologico converte un substrato in un prodotto in un numero limitato di stadi enzimatici. Per avere un'alta efficienza è necessario andare ad ottimizzare il biocatalizzatore, il mezzo di reazione e il bioreattore.

Opportunità per l’uso industriale di catalizzatori biologici

• Enzimi idrolitici tradizionali: sono i più utilizzati, spesso non necessitano di cofattori. (es.: idrolisi proteine ed amido).
• Enzimi di isomerizzazione: molto utilizzati in quanto un catalizzatore di isomerizzazione di natura chimica è molto difficile da sintetizzare e raramente dà eccessi enantiomerici del 100%. (es.: conversione del glucosio a fruttosio).
• Sintesi di composti chirali.
• Reazioni idrolitiche inverse: modificando l'enzima oppure modificando le condizioni in cui opera si può far avvenire la reazione inversa. Questo è possibile se la reazione inversa passa dallo stesso stato della reazione inversa. Quindi in questo modo si è potuto utilizzare degli enzimi idrolitici per far formare dei legami C-C, C-N, C-O…
• Reazioni sintetiche complesse (es.: ossidrilazioni aromatiche, chimica dei gruppi di protezione, degradazione di sostanze tossiche e/o pericolose).
• Reazioni con stereo-selettività: il biocatalizzatore è molto più selettivo rispetto a quello chimico, questa selettività da un grandissimo vantaggio, ma è anche un limite. Il sistema deve rimanere attivo e stabile nelle condizioni del bioreattore. E soprattutto devono essere riutilizzabili per un lungo periodo.

Il catalizzatore deve essere in grado di essere attivo in mezzi non convenzionali: grazie a questo io potrei ridurre drasticamente le dimensioni in quanto aggiungo un solvente che solubilizza il reagente molto più che l'acqua. Ma c'è il rischio della distruzione del catalizzatore. Ci sono delle reazioni che possono essere fatte in reagenti organici.

Esempio: Daunomicina

Daunomicina è stata utilizzata fino all'inizio degli anni 2000 per il trattamento dei tumori solidi. Questo tipo di farmaco viene scoperto negli anni '60 da due aziende in contemporanea e si ha il deposito di due brevetti. I brevetti erano accettati entrambi in quanto utilizzavano 2 ceppi diversi di streptomices.

Questo farmaco fa parte delle antracicline che hanno un'attività antimicrobica (inibizione della crescita di batteri gram-positivi, funghi, virus e cellule animali) e un'attività antitumorale (trattamento di leucemie acute e tumori solidi). Quello che entrambe le case farmaceutiche scoprono è che il microrganismo produce la daunomicina che poi con una sintesi può essere modificata a doxorubicina (passo da un metile a un CH₂OH) e a erirubicina (ha anche lui il CH₂OH) tra i due varia la posizione di un OH sullo zucchero (equatoriale nell’epirubicina e assiale nella doxorubicin).

C'è stato un periodo nel quale le case farmaceutiche andavano a ricercare i principi attivi negli antichi rimedi. Se la struttura che vogliamo sintetizzare è di interesse dobbiamo chiederci come produrla: fermentazione (sfruttare il microrganismo anche per la produzione) oppure sintesi totale. La sintesi totale è stata effettuata e studiata, consta di 15 passaggi più i 7 per aggiungere l’azazucchero. E per quanto sia migliorato al massimo per resa ogni passaggio la resa finale diventa piccolissima. Con una sintesi di questo tipo abbiamo talmente tanti stadi da sintetizzare e separare i costi sono altissimi.

L'organismo produttore che resa ha? Il ceppo originario produce 60-70 microgrammi/ml (per 1 kg di daunomicina servono 17.000 l di acqua). Facendo delle mutagenesi e migliorando le condizioni di reazione si è arrivato a una produzione di oltre 1000 μg/ml. Il microrganismo usa dei building block relativamente semplici per poi arrivare a formare lo scheletro della molecola. L'aklavinone è lo scheletro della daunomicina ed è il più difficile da produrre. Successivamente serve l'inserimento di un OH al C11, decarbossilare al C10, ossidare al C13 e metilare al C4.

Tutte queste sono delle reazioni estremamente selettive, ma anche nel microrganismo di hanno le forme errate. Il prodotto finale del ceppo f è la baumicina a cui devo ancora togliere un pezzo per ottenere la duanomicina.

Schema del fermentatore

Si ha un'agitazione meccanica, camice riscaldanti che mantengono la temperatura corretta. In basso si ha un sistema per inserire l'ossigeno. Poi si hanno tutta una serie di sistemi di controllo e di aggiunta al sistema: servono per immettere i reagenti e mantenere il sistema sterile. Si ha una parte di uscita in alto: i gas introdotti che formano una sovrapressione ma prima di essere liberati nell'ambiente deve essere passato per dei filtri. I reattori possono essere interrati oppure no. Sono in linea e non si ha un operatore che ci lavora direttamente. Si ha l'accesso alla testata del reattore ma non ci lavoro solitamente, anche per una questione di sicurezza. Ci sono 3 tipi: batch, fed batch e continuo. In campo farmaceutico si usano i primi due mentre in campo chimico si utilizza l'ultimo in modo. In un impianto continuo sono molto importati le contaminazione, nel batch se ho una contaminazione butto via il lotto mentre in quello continuo devo bloccare e non so quando è avvenuta e quindi fino a quando buttare via.

Gli impianti batch e fed batch sono degli impianti discontinui. In ambiente biotecnologico parlo di impianti discontinui alimentati: a mano a mano che va avanti la reazione faccio delle aggiunte ma non ho uscite. A un certo punto arrivo alla saturazione del reattore. Questo è importante a livello biotecnologico in quanto segue le richieste nutrizionali dei microrganismi. I fed batch possono essere con spilling e senza spilling.

Tutti i servizi necessari sono quelli di riscaldamento, sterilizzazione delle cose in entrata e abbattimento di quello in uscita. Quando parlo di migliaia di litri le condizioni di sterilità sono difficili da ottenere: trovare condizioni adatte al sistema. Per le materie prime posso fare una sterilizzazione con il calore oppure mediante filtrazione. Anche l'aria viene sterilizzata per filtrazione. Tecnica più utilizzata per le soluzioni zuccherine è un veloce shock termico, successivamente si ha una filtrazione. La filtrazione dell'aria viene fatta attraverso cartucce che devono mantenere una certa portata. In un batch di 10.000l devo inserire 20 m³/min. L'ossigeno viene inserito in bolle e deve scambiare con l'acqua. L'ossigeno non essendo polare si scioglie poco in acqua e quindi devo avere alte portate per far arrivare la quantità giusta ai microrganismi. Io comincio con una fiala congelata con il microrganismo che devo far crescere per avere una quantità adeguata alla fermentazione di interesse.

Io non posso avere già tutti i batteri che mi servono perché avere enormi costi di mantenimento. Però ognuno di questi passaggi richiede un certo tempo. Un vantaggio è che io metto il microrganismo nelle condizioni migliori per la sua riproduzione (non i interessa il prodotto, ma il numero di cellule). Una volta raggiunta la quantità necessaria io cambio le condizioni e non mi interessa più che sia in condizioni da riprodursi ma solo che produca il prodotto d'interesse.