Parte di Genetica, Appunti

1. INTRODUZIONE ALLA GENETICA E ALLA INGEGNERIA GENETICA

BRANCHE DELLA GENETICA

GENETICA MOLECOLARE GENETICA MENDELIANA GENETICA DI POPOLAZIONI

Studia la natura chimica dei Studia i principi fondamentali È focalizzata sull’analisi

geni e i meccanismi con cui l’ della genetica, i modi in cui genetica dei gruppi formati da

informazione genica viene vengono trasmessi, ereditati i membri di una singola specie

espressa e trasmessa caratteri da una generazione ad (popolazione) e sul modo in cui

Comprende: processi cellulari un’altra. la popolazione cambia nel

di trascrizione e traduzione del Comprende: relazione tra tempo e nello spazio.

RNA, replicazione, riparazione e cromosomi ed ereditarietà e Importante per lo studio

ricombinazione del DNA. posizione dei geni sui dell’evoluzione.

cromosomi e la loro mappatura.

QUELLO CHE ACCOMUNA QUESTE BRANCHE E’ IL

DNA

Il DNA è impacchettato in modo seriale in strutture diverse fino a raggiungere il cromosoma e tutti gli

organismi vivi che conosciamo utilizzano gli acidi nucleici.

GENOMA: intero set di informazioni genetiche

DOGMA DELLA GENETICA: è rappresentato da questo schema.

Il gene attraverso la trascrizione produce RNA.

Attraverso la traduzione si ha la produzione delle proteine.

La trascrizione inversa vale per alcuni virus e sono in grado si passare dal DNA all’RNA dentro la cellula

ospite e poi dal DNA all’RNA alle proteine.

Il DNA si trova nel nucleo e viene trascritto come un RNA primario e ogni tappa (tappe gialle) subiscono

un controllo da parte della cellula.

La trascrizione produce RNA che poi viene esportato dal nucleo al citoplasma, l’RNA può essere

degradato (controllo dovuto dal fatto che questo RNA può essere attivato o degradato). Una volta che la

proteina si forma non è detto che è nella sua forma attiva (es. gli istoni aprono la funzione della proteina

in modo che sia completa). Durante la formazione del DNA si formano delle forcine replicative. 1

COME SI E’ SVILUPPATA LA GENETICA?

Cominciò tutto nell’800 con Mendel che scoprì le leggi della genetica e sollo verso la fine del ‘900

furono accettate le sue leggi.

Nel 1953 l’uomo cominciò a vedere come è fatto fisicamente il DNA

Nel 1966 fu determinato il codice genetico

Nel 1972 si sviluppa la tecnologia per far sviluppare il DNA ricombinato

Nel 1977 si cominciarono ad avere i metodi di sequenziamento del DNA che ci permettono di

sequenziare il DNA

Nel 1982 si ha la GenBank

Nel 1984 fu inventata la PCR

Nel 1986 si cominciò a sequenziare il DNA (è un momento importante perché la genetica ha cominciato a

crescere nell’ambito della comprensione degli organismi modello, es. Drosophila, che vengono

utilizzati).

Nel 2003 venne sequenziato tutto il cromosoma, con l’avvento della genetica questa genesi ha fatto sì

che si è potuta immaginare quale sia l’evoluzione di un gruppo di organismi.

Intorno al 2008 c’è stata un’evoluzione dal punto di vista dei sequenziamenti cioè la tecnologia del

Nation Generation Sequency ha fatto sì che il prezzo per sequenziare il DNA è diminuito tantissimo.

INGEGNERIA GENETICA

Negli inizi degli anni ’70 per la prima volta

si è riuscita ad effettuare la Tecnologia del

DNA ricombinante.

Possiamo prendere un gene da una cellula

eucariotica, isolarlo, poi prendere un

plasmide da una cellula batterica, a questo

punto attraverso gli enzimi di restrizione si

possono ottenere delle sequenze che fanno

sì che questo DNA può essere messo 2

dentro questo plasmide (attraverso la ligasi si può ricreare un plasmide circolare e rimetterlo dentro a

un batterio. Questo batterio porterà un gene esogeno, magari di una cellula umana, e sarà in grado di

esprimere questa proteina che prima non poteva fare.

PRODOTTI FARMACEUTICI SVILUPPATI GRAZIE ALL’INGEGNERIA GENETICA

Es. insulina (regola la quantità di glucosio nel sangue)

ALCUNI CARATTERI GENETICAMENTE MODIFICATI NELLE PIANTE COLTIVATE

ANIMALI TRANSGENICI O KNOCK OUT

Grazie all’uso di questi animali possiamo ricapitolare alcune delle malattie umane.

Terapia Genica: diventa reale solo all’inizio degli anni ’90 e venne fatta su una bambina con malattia

genetica grave (SCID) immunodeficienza ereditaria. 3

TIPI DI TERAPIE GENICHE

TERAPIA GENICA DELLE TERAPIA GENICA DELLE CELLULE SOMATICHE

CELLULE GERMINALI

E’ più teorica che pratica (problemi Questa si propone di modificare solamente le cellule somatiche non

etici) agisce su spermatozoi/ovociti su quelle germinali.

ed elimina il problema su tutta la

progenie - EX VIVO: più utilizzata

- IN VIVO

MODO IN CUI IL DNA VIENE TRASFERITO ALLE CELLULE DI INTERESSE

TRASFEZIONE A DNA NUDO: molto usata in laboratorio ma prevede che un DNA entra

Ø direttamente nel nucleo.

Calcio fosfato: il DNA a contatto con una soluzione di calcio fosfato forma dei precipitati che per

endocitosi entrano nelle cellule

Liposomi: i lipidi che permettono la formazione di vescicole liposomiali, il DNA entra all’interno

della cellula mediante la fusione vescicola-membrana.

TRASFEZIONE MEDIANTE STRATEGIE DI TIPO FISICO

Ø Microiniezione: iniezione di DNA in soluzione tramite una micropipetta di vetro sottile posta su

un micromanipolatore. Metodo lento in quanto si inietta una sola cellula alla volta. Metodo per

cellule sufficientemente “grandi” La tecnica è attualmente impiegata per inserire DNA esogeno

negli embrioni di animali (es. preparazione di topi transgenici) e dunque ha un uso

esclusivamente sperimentale.

Elettroporazione: consiste nel sottoporre una cellula ad un campo elettrico in modo tale da

creare pori idrofili nella membrana cellulare. Alcune cellule sono particolarmente sensibili allo

shock elettrico e si possono danneggiare irreversibilmente; quindi gli effetti collaterali

difficilmente valutabili.

Tuttavia i sistemi più efficienti sono quelli BIOLOGICI 4

STRATEGIE BIOLOGICHE PER IL TRASFERIMENTO DEL DNA

La strategia biologica sfrutta le caratteristiche dei virus, cioè la loro capacità di penetrare nelle cellule e

di inserirsi nel DNA dell'ospite.

Ma non tutti i virus a DNA si sono dimostrati adatti. Anzi spesso il materiale genetico da essi trasportato

non si integra nei cromosomi delle cellule infettate.

La maggior parte dei virus ad RNA non è adatto al trasferimento dei geni. L'RNA, infatti, non si integra

nel DNA delle cellule umane e viene rapidamente degradato.

Un'eccezione è fornita dai RETROVIRUS, che adottano una strategia replicativa in cui il loro genoma ad

RNA viene retrotrascritto in DNA ed integrato nel genoma della cellula infettata.

RETROVIRUS

Sono stati i primi virus ad essere studiati nella terapia

genica, di cui il capostipite è il virus della leucemia

murina che nell'uomo non è associato ad alcuna malattia.

Un retrovirus presenta due filamenti di RNA complessati

con varie proteine, un capside ed un involucro lipidico,

derivato dalla cellula ospite infettata. Esso si lega a

specifici recettori situati sulla membrana cellulare, il che

innesca un meccanismo che porta alla fusione

dell'involucro lipidico virale con quello della cellula. In

questo modo il virus viene rilasciato nel citoplasma e

successivamente l'RNA viene liberato dall'involucro

capsidico e può così fungere da stampo per una DNA

polimerasi RNA dipendente (la trascrittasi inversa) che

sintetizza, così, un filamento di DNA che, ad opera d'una

integrasi virale, viene integrato nel genoma dell'ospite.

LENTIVIRUS

I lentivirus sono tra virus più pericolosi per ivertebrati. I virus di

questo genere includono il virus dell'immunodeficienza umana

(HIV). I lentivirus appartengono alla famiglia dei retrovirus ma a

differenza dei precedenti, possono infettare anche cellule non

replicanti, il che li rende dei buoni candidati per modificare

l'espressione delle cellule a differenziazione terminale, come quelle

del cuore o del sistema nervoso centrale e facilita anche i processi

di trasfezione ex vivo in quanto le cellule messe in cultura non

abbisognano di stimoli che le inducano a dividersi

ADENOVIRUS

Gli adenovirus sono virus a DNA a doppio filamento racchiusi da nucleocapside a simmetria icosaedrica

(senza involucro lipidico). Nell'uomo sono associati soprattutto ad infezioni del apparato respiratorio. Il

ciclo vitale di un adenovirus comprende un legame a specifici recettori cellulari che permettono

l'ingresso del virus tramite endocitosi. L’endosoma viene poi a fondersi con un lisosoma ed il cambio di

pH che ne consegue probabilmente favorisce un cambio conformazionale del capside cui segue una

demolizione della vescicola e la liberazione del DNA virale che viene trasportato nel nucleo. 5

Gli adenovirus sono stati a lungo un popolare vettore virale per la terapia genica a causa della loro

capacità di influenzare sia le cellule replicanti che non replicanti, accogliere grandi transgeni e

codificare proteine senza integrarsi nel genoma della cellula ospite

Ricapitolando… (27.16 30.11.17)

PROBLEMI DELLA TERAPIA GENICA

• La sicurezza della procedura. Questo è un problema particolarmente evidente per i vettori virali.

Alcuni di questi derivano infatti da virus pericolosi, come l’HIV. E’ quindi necessario che prima

dell’utilizzo questi vettori siano privati della virulenza originaria del virus e mantengano invece

inalterata la capacità di infettare le cellule bersaglio.

• L’efficienza di trasferimento. Negli studi sulla terapia genica, la maggior parte degli sforzi si concentra

oggi sulla ricerca di vettori in grado di trasferire il DNA in modo efficiente e di inserirlo stabilmente

nelle cellule.

• La selettività del bersaglio. In questi ultimi anni sono stati messi a punto una varietà di vettori, alcuni

dei quali in grado di fare esprimere il gene estraneo in uno specifico tipo cellulare (come i globuli

bianchi, le cellule del muscolo, delle vie respiratorie ecc…).

• La durata dell’espressione del gene trasferito. La terapia genica risulta praticamente inutile se

l’espressione del gene "estraneo" non viene mantenuta per un tempo sufficiente. Le ricerche mirano a

sviluppare sistemi che permettono un espressione duratura, in modo da sottoporre il paziente ad un

unico trattamento, o al limite a trattamenti ripetuti a distanza di qualche anno.

• La reazione immunitaria. Come ogni altra sostanza estranea, il prodotto del gene nuovo, il gene stesso

e soprattutto il vettore possono scatenare una risposta immunitaria da parte dell’organismo ospite.

Questa può portare all’eliminazione delle cellule modificate geneticamente, o all’inattivazione della

proteina prodotta dal nuovo gene, annullando quindi tutti gli effetti della terapia. Nello sviluppo delle

nuove strategie di terapia genica si cerca di evitare per quanto possibile che il vettore o il gene

estraneo producano una reazione immunitaria.

La terapia genica è una scienza giovane, il primo tentativo fu effettuato negli Stati Uniti da Michael Blaese

nel 1990 su una bambina affetta da SCID, una grave immunodeficienza ereditaria. 6

2. I CROMOSOMI

La mitosi e la meiosi cominciano entrambe con la replicazione del DNA, la meiosi ha due divisioni

successive e la mitosi ne ha una sola si hanno due cellule identiche alla madre invece nella meiosi si

hanno 4 cellule che portano metà del corredo della

cellula madre.

La meiosi comporta 2 divisioni nucleari successive:

(che è la più complessa)

- Meiosi I (profase I , metafase I, anafase I, telofase I) DIVISIONE RIDUZIONALE

- Meiosi II (profase II, metafase II, anafase II, telofase II) DIVISIONE EQUAZIONALE

Il DNA non si duplica tra le due divisioni e si formano 4 nuclei aploidi.

PROFASE I

La replicazione del DNA precede l’inizio della meiosi I (in profase gli omologhi si appaiano e formano le

sinapsi). Le coppie di cromosomi sono chiamate bivalenti, e la formazione dei chiasmi causati dalla

ricombinazione genetica diventa evidente. La condensazione dei cromosomi rende tutto ciò visibile al

microscopio ottico. I bivalenti hanno due cromosomi e quattro cromatidi, con ciascun cromosoma che

deriva da un genitore.

I cromosomi omologhi precedentemente dispersi nel nucleo

• Si identificano uno con l’altro

• Entrano in intimo contatto per formare i bivalenti

Si formano rotture nella doppia elica del DNA: DSB double strand breaks che vengono riparate con il

risultato finale delle ricombinazione omologa.

La profase I è suddivisa in 5 sottofasi in base:

• al cambiamento della morfologia dei cromosomi

• alla progressione dell’appaiamento e della sinapsi

LEPTOTENE (lepto: sottile) comparsa dei cromosomi sotto forma di lunghi filamenti singoli sottili

ZIGOTENE (zygotos: unito assieme) Appaiamento dei cromosomi omologhi con associazione molto

stretta dei crom.omologhi (SINAPSI).

Ogni coppia omologa di cromosomi in sinapsi è costituita da 4 cromatidi chiamati

BIVALENTI o TRETRADE.

PACHITENE (pachys: spesso) I cromosomi si accorciano e si addensano e si sviluppa il complesso

sinaptonemico (SC) con crossing over (scambio di materiale genetico tra cromosomi

omologhi) .

Sdoppiamento dei cromosomi in cromatidi, con formazione delle tetradi; i cromatidi

DIPLOTENE omologhi si scambiano porzioni di DNA (crossing over) incrociandosi in punti detti

chiasmi

Spostamento dei chiasmi verso le estremità cromosomiche.

DIACINESI Disgregazione membrana nucleare e formazione del fuso mitotico. 7

ZIGOTENE

• Dopo le duplicazione e la spiralizzazione, i due cromosomi di ciascuna coppia di omologhi si

dispongono paralleli

• Si appaiano nel senso della lunghezza.

• Questo processo di appaiamento termina con la formazione del complesso sinaptonemico.

• La sinapsi è caratteristica della Meiosi I (non avviene nella Meiosi II né nella Mitosi.

• La sinapsi inizia nel zigotene

crossing over (molto importante): scambio del materiale genetico che arrivava dalla madre e quello che

arrivava dal padre 8

PACHITENE

• Inizia dopo che si è formato il complesso sinaptonemico (sinapsi)

• Questo stadio dura parecchi giorni

• Il complesso mantiene i cromosomi nell’appaiamento corretto (il gene #1 sull’omologo #1 è appaiato con

il gene #1 sull’omologo #2)

• Il DNA del complesso inizia a despiralizzarsi.

CROSSING OVER

• Scambio di materiale genetico tra cromosomi omologhi.

• Nel complesso sinaptonemico sono presenti complessi di proteine chiamati noduli ricombinanti che

sono delle “macchine taglia e cuci”.

• per coppia di omologhi avvengono in media due-tre scambi (nella specie umana)

• Quando il processo del crossing over è terminato il complesso sinaptonemico inizia a smembrarsi.

• Dopo che il complesso sinaptonemico si è dissolto, gli omologhi sono ancora tenuti insieme nei punti

dove è avvenuto il crossing over

• Questo punto di unione è chiamato a chiasma (a forma di X).

Le proteine coesine e condensine formano il complesso sinaptonemico.

Il cinetocore tira i cromosomi ai due lati nelle due cellule figlie e i microtubuli permettono di essere

tirati ai poli opposti.

METAFASE I

• I chiasmi tengono insieme gli omologhi

• Solo un lato del centromero guarda verso l’esterno 9

ANAFASE I

• Profase I + Metafase I occupano il 90% della della Meiosi I (la profase può durare anche una vita)

• I microtubuli iniziano ad accorciarsi. Si rompono i chiasmi.

• I microtubuli accorciandosi tirano verso i poli i centromeri che trascinano con loro i cromosomi.

Entrambi i cromatidi fratelli sono trascinati allo stesso polo poiché il centromero li tiene insieme.

TELOFASE I

• Gli omologhi si radunano ai poli opposti.

• La membrana nucleare si forma attorno ai due gruppi di cromosomi.

• Ricorda: ciascun cromosoma in entrambi i nuclei si era replicato prima che la cellula entrasse in

Meiosi I.

• Quindi ciascun cromosoma è ancora costituito dai 2 cromatidi fratelli

• MA: i cromtatidi fratelli non sono esattamente identici poiché è avventuo il crossing over.

• La citochinesi può o non avvenire prima dell’entrata nella Meiosi II.

Tra la meiosi I e II, non c’è duplicazione del DNA! (diversamente dalla mitosi)

1. Profase II – si rompe la membrana nucleare e si forma il fuso

2. Metafase II – i microtubuli si attaccano da entrambi i lati del centromero

3. Anafase II – i microtubuli si accorciano, rompono il centromero e muovono i cromatidi fratelli ai poli

opposti.

4. Telofase II – si riformano le membrane nucleari intorno ai quattro gruppi di cromosomi fratelli.

PROFASE II

La profase I è molto lenta e si completa in giorni, mesi o, addirittura anni; la profase II, invece, inizia

subito dopo la telofase I, cioe’ subito dopo la fine della prima divisione meiotica, senza l’interposizione

di una fase di riposo o interfase.

PROMETAFASE E METAFASE II

Come per la mitosi: si forma il fuso, la piastra equatoriale, si collegano le fibre del fuso al centromero di

ogni cromosoma che resta connesso cosi’ a entrambi i poli.

ANAFASE II

I centromeri si dividono come per la mitosi e si separano i due cromatidi di ogni cromosoma, migrando

ai poli della cellula. Ricordiamo che i cromosomi sono qui solo 23.

TELOFASE II

Le cellule si separano. Ogni cellula contiene 23 cromosomi, è, cioe’, aploide. Da una cellula progenitrice

diploide, lo spermatogone, si ottengono 4 spermatozoi, aploidi. Per i gameti femminili, invece, da un

oogone diploide si ottiene solo un oocita aploide (e due o tre globuli polari). 10

Il crossing over produce il fenomeno della ricombinazione genetica.

I FATTORI CHE CONTRIBUISCONO ALLA VARIABILITA’

• Il crossing over alla Profase I

• La dis