Genetica molecolare - prima parte

Genetica molecolare e genomica 2020

Introduzione

Perché è importante la genetica?

• Ciascuno di noi appartiene a una famiglia.
• Ha un ruolo importante nell’ambito biomedico (premio Nobel).
• Per lo studio delle malattie genetiche (es. Corea di Huntington).
• Molto di come noi siamo fatti è determinato nel nostro patrimonio genetico.
• Per lo studio delle differenze tra individui e tra specie (il genoma umano dallo scimpanzé differisce il 4%: 1,2% per variazione di sequenze a singolo nucleotide, e 2,7% per CNV = copy number variants. Altra curiosità è che i gemelli hanno lo stesso genoma ma diverse impronte digitali in quanto a livello embrionale ci sono state diverse influenze sul genoma).
• Vi sono molti articoli su internet.
• Per lo studio del virus SARS-CoV-2 (la sua presenza è oggi determinata tramite test sierologico o tampone che consiste nel prelevare cellule dalla cavità orale e nasale, e mostrare la presenza del genoma RNA del virus attraverso una metodica definita RTP-CR, ovvero l’amplificazione degli acidi nucleici. Il virus conta 30.000 nucleotidi, mentre il genoma umano ne conta 3.000.000.000).

Il laboratorio di genetica molecolare risulta a prima vista molto disordinato ma solo per il semplice motivo che i ricercatori hanno bisogno di molta strumentazione. Tale strumentazione è molto complessa e costosa, in particolare sono presenti molte miniature per il fatto di avere più strumentazione a disposizione. All’interno di un laboratorio possono esserci anche computer. La ricerca scientifica costa molto e in Italia si investe solo una parte minima, insufficiente.

La genetica molecolare ci permette di studiare la materia vivente e di modificarla.

Organismi geneticamente modificati (OGM)

Un esempio è la mela naturale e la mela modificata. Nella mela OGM non viene prodotto l’enzima responsabile della reazione di ossidazione. Nel caso del savr tomato=1994: alterazione della sequenza degli alimenti (flavr sul pomodoro). Qui è stato modificato geneticamente il pomodoro rendendolo “più consistente” anche da maturo, risolvendo così il problema legato alla raccolta anticipata di questi ortaggi per poterli trasportare senza rovinare il raccolto. Questo però ha generato diffidenza e dopo due anni dalla scoperta il prodotto è stato ritirato dal mercato (paura nella popolazione perché il prodotto era stato manipolato e perché costava molto di più). Questo studio però ha aperto la strada ad altre ulteriori modificazioni agli alimenti, che oggi dominano il mercato:

• Soia (OGM per renderla maggiormente resistente agli erbicidi).
• L’azienda farmaceutica Novartis ha modificato il mais, così che da solo producesse un ‘insetticida naturale, ovvero una tossina prodotta da un gene presente in un batterio (Bacillus thurigensis). In tal modo non si utilizzavano più insetticidi chimici.
• Altro studio/modifica: per affrontare e ridurre il deficit di vitamina A nella popolazione mondiale, alcuni ricercatori hanno modificato il riso, creando la varietà chiamata Riso d’oro, facendogli produrre la vitamina A. Vi fu successivamente nell’era Crispr il nuovo Golden Rise.
• Patata dolce presente soprattutto in Africa, è un elemento ricco di carboidrati ma non di proteine. Con la modifica hanno sviluppato una specie in cui era incrementata la percentuale di proteine.

Le coltivazioni di soia, cotone e mais degli Stati Uniti sono per l’80% OGM (sigla BT= resistente agli insetti, vermi). I paesi in cui c’è maggiore concentrazione di OGM sono Stati Uniti, Sud America, Canada, Cina e India. Le coltivazioni autorizzate dall’Unione Europea sono 14, in particolare sono cotone, mais, rape, soia, e barbabietola. In Italia è fortemente limitato. La maggior parte degli OGM autorizzati nell’UE sono destinati ai mangimi per gli animali d’allevamento. Il sistema di etichettatura alimentare dell’UE impone alle aziende di indicare se gli alimenti o i mangimi che producono contengono OGM (quando la presenza è al di sopra dello 0,9%).

L’ingestione degli organismi OGM può avere effetti a lungo termine sulla vita umana?

• Da sempre l’umanità mangia geni, dal momento che essi sono contenuti nella maggior parte degli alimenti, senza che ciò comporti alcun rischio: una pianta contiene alcune decine di migliaia di geni per cellula.
• Quando mangiamo una mela, mangiamo centinaia di milioni di copie dei suoi geni.
• I geni presenti nelle piante modificate mediante metodi spontanei o tradizionali non sono diversi dai geni modificati biologicamente.
• I geni in quanto tali non sono tossici, ciò che è importante è il prodotto che scaturisce dal codice genetico.

Gli OGM dovrebbero far fronte a una richiesta sempre maggiore di cibo, considerando che oggi la popolazione mondiale è di 7,70 miliardi (novembre 2019). Possono essere utilizzati per modificare geneticamente specie alimentari che stanno andando incontro all’estinzione a causa di virus, parassiti e insetti (es. pomodoro di San Marzano). È anche vero però che l’utilizzo di OGM può minacciare la biodiversità del nostro pianeta. Infatti se si incomincia ad utilizzare un numero limitato di varietà, in seguito a cambiamenti ambientali importanti, si potrebbe andare incontro alla scomparsa della specie intera.

Genetica molecolare per lo studio delle malattie umane e genetiche

Il tipo di tecnologia in immagine ovvero la “multi-color fluorescence in situ hybridization” ci permette di colorare ciascuna delle 23 coppie di cromosomi per evidenziare anomalie cromosomiche. Diagnosi molecolare: identificazione di mutazioni, ri-arrangiamenti cromosomici. Tale tecnologia ha identificato 5000 malattie per alterazioni di un singolo gene. L’identificazione di geni malattia è avvantaggiata dal fatto che oggi ci sono sistemi avanzati di sequenziamento del genoma (effettuabili in tempi brevi e a costi contenuti).

Per verificare se un paziente è affetto da una determinata mutazione si fa il confronto con dei pazienti controllo: Cromatogramma: ad ogni picco corrisponde un diverso tipo di nucleotide. Grazie all’identificazione delle differenze tra sequenze nucleotidiche si evidenziano, nella maggior parte dei casi, i geni malattia.

La genetica permette di studiare patologie come:

Acondroplasia: il gene coinvolto nell’acondroplasia (nanismo—malattia autosomica dominante) si trova sul cromosoma 4 e contiene l’informazione per produrre una proteina chiamata “recettore fattore di crescita dei fibroplasti di tipo 3” (FGFR3). Qui vi è una mutazione di una base: dovrebbe esserci una G ma c’è una A o una C. La proteina codificata da questo gene possiede in questo punto un amminoacido diverso rispetto alla popolazione wild type (R al posto di G). Esiste un caso al mondo di due gemelle omozigoti con una gemella malata di nanismo e una no. Qui la singola cellula uovo fecondata ha cominciato a dividersi e poi ha portato alla formazione di due embrioni separati. La mutazione somatica si è verificata dopo la divisione in uno dei due embrioni. Sono quindi discordanti per un fenotipo dovuto ad una patologia. (L’esempio da cui è tratta tale patologia fa riferimento alla storia di Sienna e Sierra Bernal provenienti da Huston, Texas).

Gli animali vengono usati per lo studio delle malattie e studiare terapie farmacologiche e immunogeniche

Un topo in cui è stato alterato il gene BRCA1 rappresenta un modello per lo studio dello sviluppo di un tumore al seno. FGFR3 gene per acondroplasia: topo più piccolo. Mutazione aniridia (molto rara): malattia mendeliana monogenica (dovuta alla mutazione di un singolo gene), colpisce l’occhio e a volte è coinvolto il nervo ottico e la retina. Qui la visione è ridotta e spesso si va incontro a cecità. Qui vi è in particolare una mutazione del gene PAX 6 (mutazione dominante).

Per analizzare tale patologie non sono stati fatti esperimenti su animali, ma è stato riscontrato casualmente un fenotipo small eye in un topolino (che ha stessa mutazione del gene PAX 6). Oltre che in un topolino si trovò in un moscerino il corrispondente del PAX 6, che si chiama eyeless. Fu fatto a proposito un esperimento (Drosophila melanogaster), in cui presa la sequenza del Drosophila, si è fatto in modo che la proteina si esprimesse in distretti diversi rispetto all’occhio. Il gene eyeless è stato espresso in zone in cui tipicamente non è presente. La conclusione è che è sufficiente attivare questo gene in un diretto diverso a scelta per far sì che si manifesti. Il gene è stato quindi definito master gene.

Gli organismi transgenici

Gli organismi transgenici sono organismi nei quali sono stati inseriti, per mezzo di tecniche di biologia molecolare, geni provenienti da un altro organismo di specie diversa. Il materiale genetico così modificato è definito DNA ricombinante. La medusa Aequore victoria è in grado di esprimere una proteina per la fluorescenza chiamata green fluorescent protein (GFP). Gli scienziati hanno preso la sequenza di questo gene e l’hanno inserita in diversi organismi:

• Lo stesso gene è stato inserito in un coniglio da Louis-Marie Houdebine, su commissione di Edoardo Kac— installazione del gene con la creazione di un coniglio “alba” modificato per la proteina GFP.
• È vissuto solo due anni.
• Nel 2003 una compagnia californiana ha modificato geneticamente gli zebra Fish e ha creato degli organismi transgenici per diverse proteine fluorescenti (chiamati successivamente GLOFISH). Non venduti in Europa, Canada e Australia per preoccupazioni di tipo ecologico e etico-sociale.
• Un'università nel Regno Unito ha ipotizzato la creazione di un albero di Natale modificato per la fluorescenza per evitare l’utilizzo di lucine e quindi diminuire l’impatto ecologico.
• Un ricercatore filippino ha invece creato un albero di Natale che emette fluorescenza verde crescendo dei batteri in laboratorio poi vaporizzati su un albero.

Nel 2008 il premio Nobel per la chimica fu assegnato a Osamo Shimomura, Martin Chalfie e Roger Y. Tsien per la scoperta e le applicazioni della proteina GFP. La fluorescenza che di per sé potrebbe sembrare inutile, invece ci permette di vedere immediatamente se un inserimento transgenico è andato a buon fine. Infatti è possibile utilizzare la GFP come una sorta di lampadina molecolare che ci permette di seguire all’interno della cellula di un organismo la posizione di una proteina di nostro interesse. Se prendiamo una sequenza che identifica un gene di nostro interesse e la attacchiamo alla sequenza che codifica per la proteina GFP e lo inseriamo in un organismo, quello che creiamo è una proteina ibrida, ovvero una proteina costituita dal gene d’interesse e dalla proteina GFP. Se si esprime la fluorescenza si esprime anche la proteina ad esso legata, vuol dire che il trasferimento genico è andato a buon fine. Serve per mettere appunto strategie di trasferimento genico. Non a caso ricercatori riuscirono ad esprimere la proteina GFP in tutto l’organismo di un topo, ma riuscirono anche a far sì che questa proteina si esprimesse solo nelle cellule degli occhi (anche se presente in tutto il corpo).

Clonazione

Nel 1996 è stata effettuata la clonazione (tecnologia che permette di generare molti individui geneticamente identici) della pecora Dolly: Si estrae il DNA da una cellula somatica della pecora da replicare e si inserisce in una cellula uovo privata di nucleo prelevata da una pecora donatrice. Avremo cellula uovo contenente DNA della cellula somatica da replicare. A questo punto si realizza l’embrione e lo si impianta in una pecora che porterà avanti la gravidanza (la pecora non sarà uguale alla madre ma alla donatrice di DNA). Il primo esperimento di clonazione fu effettuato nel 1981 su zebra Fish. Nel 2013 in Giappone hanno realizzato 581 copie di un topolino, geneticamente identici. 80 paesi hanno proibito la clonazione. Problema fondamentale è rappresentato dalle madri surrogate (vengono presi cellule uovo e spermatozoi di due donatori e creato un embrione impiantato in una seconda donna che funge da incubatrice per 9 mesi… problema etico-religioso).

Altri casi di studi genetici

Heterochromia iridum—occhi di due colori: durante lo sviluppo embrionale, dopo che lo spermatozoo ha fecondato la cellula uovo e si è formato lo zigote, nelle varie divisioni cellulari può avvenire una mutazione somatica in una cellula a livello del gene che determina il colore degli occhi e non essere presente nelle altre cellule. Tipico dei cani e dei gatti, meno comune nell’uomo.

Gatto calico: gatto di colore tigrato arancione e grigio. Questa variante genetica è presente sul cromosoma X dei gatti. I maschi, avendo un solo cromosoma X, possono avere solo la variante per la colorazione scura o la colorazione arancione, mentre la femmina avendo due cromosomi X, potrebbe avere su un cromosoma X la variante per la colorazione scura e sull’altro cromosoma X la variante per la colorazione arancione. In seguito uno dei due cromosomi X a caso viene inattivato: le femmine di mammifero sono dei mosaici perché statisticamente avranno metà delle cellule con un cromosoma X inattivato e l’altra metà delle cellule ha l’altro cromosoma X inattivato. Se hanno un cromosoma X il colore arancione e un altro cromosoma X con il colore grigio quindi si esprimeranno entrambe le colorazioni.

Caso Copy Cat (clonazione gatto)

Prendendo il DNA di una cellula somatica di una gatta calico e inserendolo in una cellula uovo di un'altra gatta calico si è cercato di creare un clone della prima gatta. La gattina però è nata bianca e grigia: evidentemente durante il processo di clonazione non c’è stata inattivazione casuale del cromosoma X. Anche a livello del carattere sono diversi: una giocosa, l’altra pigra. Copy cat poi si è riprodotta e ha dato alla luce 3 gattini bianchi e grigi. A causa di tale clonazioni inizio anche un business: Nel 2004 fu venduto il primo gatto clonato a 50.000$. Tale società oggi è chiusa ma è attivo un servizio di conservazione del DNA dei gatti per eventuali clonazioni. Nel 2014 60.000$ per la clonazione di un cane. Si è provato anche a creare gatti che non presentassero la proteina da cui deriva l’allergia (Fel d 1) nella saliva. Parecchi consumatori hanno comunque avuto reazioni allergiche (forse troppo semplificata la problematica dell’antigene, l’allergia potrebbe essere determinata da più fattori).

Nel 2009 alcuni ricercatori hanno modificato per la prima volta il genoma dei primati inserendo la proteina fluorescente. Questo esperimento è la prova che è possibile inserire una qualunque nuova sequenza genica d’interesse, utilizzando approcci simili. Nel 2011 sono stati anche generati dei gatti transgenici per la proteina verde fluorescente: anche in questo caso gli esperimenti di trasferimento genico sono stati condotti al fine di trovare successivamente terapia per una malattia. Esiste una patologia felina, una sorta di immunodeficienza, simile all’AIDS umano, per la quale i ricercatori hanno deciso di utilizzare la terapia di trasferimento genico con la finalità un giorno di poter trovare una terapia andando a veicolare un gene terapeutico e inizialmente visibile utilizzando la GFP.

Terapia genica

Tutto questo apre alla terapia genica: una forma di terapia importante per he tramite l’inserimento di sequenze geniche di interesse è possibile andare in alcuni casi a curare o a migliorare il quadro clinico dovuto a patologie (=si prelevano delle cellule dal paziente, si modificano in laboratorio tramite l’inserimento del gene terapeutico, le cellule modificate vengono fatte crescere e poi selezionate, e infine esse vengono reinserite nel paziente stesso). Quando parliamo di terapia genica non è solo l’inserimento nel genoma del paziente di un gene terapeutico; esiste anche un particolare tipo di approccio, chiamato genome editing che permette di modificare/correggere a piacimento le sequenze del genoma di un organismo, anche quello umano. Con questa tecnologia è possibile per esempio andare a correggere un singolo nucleotide, come quello che genera acondroplasia. Prima di passare all’uomo ci sono però una serie di indicazioni relative alla sicurezza che devono essere prese in considerazione, in quanto nell’uomo ci sono stati degli esempi in cui esperimenti hanno portato alla morte di alcuni pazienti per effetti indesiderati.

Progetto Genoma Umano

Progetto Genoma Umano: 10 anni di studio, con costo di 3 miliardi di dollari. C’è anche la possibilità di analizzare il DNA di individui e specie estinte, sequenziarle e compararle con quelle degli organismi attuali (uomo).

Personal genomics

Personal genomics: branca della genomica dove i genotipi individuali vengono genotipizzati e analizzati usando strumenti bioinformatici. È possibile anche sequenziare il proprio genoma per scopo terapeutico, come detto, oppure per semplice curiosità. Esistono anche company che si propongono di cercare l’anima gemella basandosi sul genoma di due individui (compatibilità).

Synthetic-biology

Si parla poi della synthetic-biology: DNA sintetizzato chimicamente in laboratorio (nuovo batterio sintetico): questo comporta la possibilità di modificare sequenze a piacimento.

Genetica batterica

È importante lo studio dei batteri e lo studio del loro genoma perché hanno molto a che fare con l’uomo. Ad esempio è importante in ambito clinico e sperimentale la conoscenza della trasmissione di malattie, cure, etc.