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Nucleosidi

Appunti di Chimica e biochimica generale sui nucleosidi basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni del prof. Guarnieri dell’università degli Studi di Bologna, Interfacoltà, Corso di laurea in biotecnologie. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Chimica e biochimica generale docente Prof. C. Guarnieri

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ESTRATTO DOCUMENTO

L'impilamento delle basi produrre una leggera torsione dell'elica a causa di una distribuzione non esattamente

simmetrica dei legami glicosidici che crea due scanalature, una maggiore (12 A) e uno secondaria (6A).

Strutture elicoidali doppie A, B, Z

Forma A - Favorita dalla disidratazione

Forma B - DNA standard doppia elica a destra in condizioni fisiologiche

Forma Z – elica a sinistra quando si alternano sistematicamente purine e basi pirimidiniche. Scarsa rilevanza

fisiologica

Struttura terziaria del DNA: Supercoils

Ogni cellula contiene circa due metri di DNA. Il DNA è "Impacchettato" di avvolgimento intorno ad un nucleo di

proteine note come ISTONI.

Gli istoni sono ricchi di residui di lisina e arginina e in quantità minori di proteine acide non istoniche.

L'assemblaggio DNA-istoni è chiamato nucleosoma.

Il DNA nucleare è organizzato in cromosomi ciascuno dei quali è costituito da una singola molecola di DNA con un

guscio di proteine.

Il genoma umano è organizzato in 23 cromosomi presenti in due copie: 22 rispettivamente di origine materna e

paterna e 1 cromosoma sessuale (X, Y).

Le cellule umane (somatiche) hanno 23 coppie di cromosomi (22 paia di autosomi e un paio di cromosomi sessuali,

eterocromosomi) per un totale di 46 cromosomi per cellula.

CROMATINA: DNA complessato con proteine basiche (istoni) e acide.

Il microscopio elettronico di un estesa cromatina mostra l’organizzazione "perle-on-a-string". Le "perle" sono

complessi DNA-istoni chiamati nucleosomi, e la "stringa" è DNA a doppia elica.

Gli istoni formano un ottamero di nucleosomi composto da due coppie ciascuno di H2A, H2B, H3 e H4; intorno al

nucleo di questo è avvolto due volte un filamento di DNA. Il complesso DNA e istoni è definito nucleosoma. Ogni

nucleosoma contiene 147 paia di basi. Il Linker contiene circa 54 paia di basi.

DNA forma degli impacchi mancini attorno all’ottamero istonico.

Struttura nucleosomi

(a) Quattro paia di monomeri di proteine istoniche cioè H2A, H2B, H3, H4 costituiscono il nucleo dell’istone (ottamero).

(b) Ogni nucleosoma è composto da un nucleo (ottamero), istone H1 e linker DNA.

Il DNA linker consiste di 54 coppie di basi. L’Istone H1 si lega al nucleo e al linker DNA.

Struttura 30 nm : CROMATINA di fibre

Il modello di cromatina in fibra viene mostrato come un solenoide o come un’ elica, formata da singoli nucleosomi. I

nucleosomi si associano attraverso i contatti tra le molecole di istoni H1 adiacenti.

I nucleosomi sono disposti ad elica sinistrorsa con 6 nucleosomi per giro, formando così una fitta fibra di 30 nm di

diametro.

L'esposizione dei geni in un sistema così addensato si verifica dopo un processo di decondensazione della cromatina

(cromatina attiva).

ESPRESSIONE E TRASFERIMENTO Dell’ INFORMAZIONE GENETICA

Il dogma centrale:

Replicazione del DNA trascrizione del DNA traduzione dell'mRNA  proteina

Replicazione : processo mediante il quale il DNA viene copiato con molta fedeltà.

Trascrizione: processo mediante il quale il codice genetico del DNA viene letto e trasferito all’RNA. messaggero

(mRNA). Questo è una fase intermedia nell’espressione proteica.

Traduzione: Il processo per cui il codice genetico viene convertito a una proteina, il prodotto finale dell'espressione

genica.

Il meccanismo di replicazione del DNA

Arthur Kornberg et al

INIZIO

• Le proteine si legano al DNA e aprono la doppia elica

• Preparano il DNA per l’appaiamento delle basi complementari

ALLUNGAMENTO

• Le proteine collegano le corrette sequenze di nucleotidi in un nuovo filamento continuo di DNA

TERMINAZIONE

• Le proteine rilasciano il complesso di replicazione

REPLICAZIONEProcesso di duplicazione del genoma prima della divisione cellulare

Significato biologico

• Un’estrema accuratezza della replicazione del DNA è necessaria al fine di preservare l'integrità del genoma nelle

generazioni successive

• Negli eucarioti, la replica si verifica solo durante la fase S del ciclo cellulare.

• Il tasso di replica negli eucarioti è più lento e ciò si traduce in una maggiore fedeltà / accuratezza della replicazione.

La replicazione copia le informazioni genetiche.

• Un singolo filamento di DNA serve come modello per un nuovo filone.

• Le regole di replicazione diretta dell’ appaiamento delle basi.

• Il DNA è replicato in fase S (sintesi) del ciclo cellulare.

• Ogni cellula del corpo diventa un set completo di DNA identici.

Regole di base della replicazione

A.Semi-conservativa

B.Inizia all’origine

C.Può essere uni o bidirezionale

D.Semi-discontinua

E.Sintesi sempre in direzione 5-3 ’

F.Primer dell’RNA richiesti

Tra i 3 modelli possibili (conservativa,semiconservativa o dispersiva), la replicazione è semiconservativa.

Partiamo dall'origine…

Le proteine che iniziano identificano sequenze di basi specifiche sul DNA chiamate siti di origine.

Procarioti - unico sito di origine( Ad esempio E.coli – Oric)

Eucarioti - più siti di origine (replicatore).

La replicazione del DNA inizia in molti punti nei cromosomi eucaristici. Ci sono molte origini di replicazione nei

cromosomi eucariotici. Le DNA polimerasi possono trovare e correggere gli errori.

Le proteine svolgono il processo di replicazione.

• il DNA serve solo come modello.

• Gli enzimi e le altre proteine fanno il vero lavoro di replica.

Gli enzimi decomprimeono la doppia elica.

I nucleotidi liberi-galleggianti formano legami idrogeno con il filamento stampo.

Lo svolgimento del DNA da parte elicasi espone le basi del DNA (forche di replicazione) in modo che la replica possa

avvenire. L’elicasi idrolizza l’ATP, al fine di rompere i legami idrogeno tra i filamenti di DNA.

Le Topoisomerasi eliminano il superavvolgimento torsionale dei filamenti

Topoisomerase DNA si lega in prossimità della forcella e uno dei filamenti di DNA per ridurre la torsione dei filamenti

causata dall'apertura della doppia elica. Successivamente al rilassamento del DNA, il filamento tagliato viene sigillato.

L'enzima DNA Polimerasi III lega covalentemente il dNTP-trifosfato con un legame fosfodiestere al 3'-terminale di una

catena polinucleotidica in crescita.

La sintesi avviene sempre nella 'direzione 5'-3 .

-Riconoscimento del nucleotide

-L’enzima catalizzata la polimerizzazione (DNA polimerasi III)

-Le basi complementari sono accoppiate

-Il substrato utilizzato è dNTP

Che cosa succede se si verifica una mancata corrispondenza di base?

DNA polimerasi ha un’attività esonucleasica in direzione 3 '5' al fine di correggere gli errori.

Il DNA polimerasi III per impegnare nucleotidi necessita di un primer iniziale che è fatto da RNA. Nella replica sono

attivi dei primasi (RNA polimerasi), che sintetizzano un breve segmento di RNA (3-10 ribonucleotidi). Questo primer

RNA viene poi rimosso dal DNA polimerasi I (a) in una fase successiva di replica.

L’assemblaggio della DNA polimerasi III

L'anello di scorrimento è costituito da due subunità beta che fissano il DNA polimerasi III del filamento stampo.

L'attività del DNA polimerasi III è dovuta al complesso dimero (nucleo). Questa attività è molto aumentata (da 60 a più

di 10000 nucleotidi legati) dalle proteine accessorie che sono disposte in un anello (b) intorno al punto di inizio della

replicazione.

Le proteine elicasi, primasi e SSB (Single Strand Binding) , insieme con la DNA polimerasi III dimerica, formano un

complesso sopramolecolare che opera simultaneamente sui due fili (leader e trefoli ritardo). L’ elicasi si muove in

avanti e il complesso supramolecolare rincorre dietro.

La formazione del frammento di Okazaki del DNA

DNA polimerasi I (a) con l'attività nucleasica rimuove il primer RNA e l'attività della DNA polimerasi I riempie con NTP

le lacune.

Proteine del nucleo nella forcella di replicazione

Topoisomerasi - Impedisce torsioni causate da rotture del DNA

Elicasi – separa i 2 filamenti

Primasi (RNA polimerasi) - sintesi dell’RNA primer

Rilegatura filo singole proteine (SSB) – previene il reannealing di singoli filamenti

DNA polimerasi III - sintesi del nuovo filamento

DNA polimerasi I - colma il divario tra i frammenti di Okazaki; possiede anche un'attività esonucleasica che rimuove

l’RNA primer

DNA ligasi – sigilla le tacche attraverso un collegamento fosfodiestereo

Il raddoppio del genoma umano completo che consiste di 3,2 miliardi di coppie di basi è possibile in meno di 8 ore.

Cromosomi e problemi di replicazione

Le sequenze del DNA cromosomico (telomeri) contengono migliaia di esanucleotidi TxGy (5'-3 ') e CyAx (3'-5').

L'enzima telomerasi (DNA polimerasi) che contiene un oligonucleotide RNA con la sequenza 3'-AAUCCCAAU-5 ' si

attacai alla fine del filamento stampo 5'-TTG-3'

I telomeri sono ...

Sequenze ripetitive di DNA alle estremità di tutti i cromosomi umani.

Contengono migliaia di ripetizioni della sequenza di sei nucleotidi, TxGy (5'-3 ') e CyAx (3'-5').

Negli esseri umani ci sono 46 cromosomi, e quindi 92 sequenze telomeriche (uno ad ogni estremità).

L’enzima telomerasi

La telomerasi umana trascrittasi inversa (hTERT) è la subunità catalitica della telomerasi ed è coinvolta nello step

della limitazione del tasso nella attivazione della telomerasi.

hTERC: sub unità di RNA telomerasi

Alle estremità 5’ dei cromosomi lineari degli eucarioti esistono da 4.000 a 15.000 copie di una sequenza

oligonucleotidica TxGy nel filamento 5’-3’ e CyAx nella catena complementare 3’-5’ definitI TELOMERI. Di norma x e y

sono compresi fra 1 e 4.

La T-LOOP alla FINE dei CROMOSOMI

T-loop: sono caratterizzate da un filamento 3 'che si piega e invade il telomero a doppio filamento. La T-loop protegge

le estremità dei cromosomi dalla nucleasi e dai loro riarrangiamenti.

Replicazione del DNA eucariotica

Nella maggior parte delle cellule somatiche eucariotiche, l'attività della telomerasi si ARRESTA poco dopo che la

cellula si differenzia.

Dopo questo, i cromosomi si accorciano gradualmente con ogni divisione.

Il numero di GGGGTT diminuisce nelle cellule somatiche da divisioni limitanti (fibroblasti 50-60 divisioni). Questo è un

meccanismo di salvaguardia contro la proliferazione cellulare incontrollata.

La perdita di attività della telomerasi è un fattore importante nel processo di invecchiamento delle cellule.

Negli esseri umani, la telomerasi è attiva nei tessuti fetali, cellule germinali, nelle cellule in vitro, la stragrande

maggioranza delle cellule tumorali e nelle cellule staminali.

Le cellule tumorali non invecchiano perché producono la telomerasi, che mantiene intatto il telomero.

Le CARATTERISTICHE di hTERT ne fanno un obiettivo terapeutico IDEALE per i tumori umani

Promuovere l’healthspan nei topi con una terapia genica della telomerasi:

La consegna della telomerasi (TERT) utilizzando rAAV (virus adeno-associati ricombinanti) sopprime l'invecchiamento

associato all’ erosione dei telomeri e si estendono i telomeri corti in una varietà di tessuti di topo. Di conseguenza, gli

animali mostrano una migliore healthspan e una durata estesa.

Funzioni non canoniche e gli obiettivi della telomerasi:

La telomerasi mantiene la lunghezza e l'integrità dei telomeri formando un complesso di proteine (TERT) e RNA

(TERC) componenti. Inoltre, la telomerasi può avere un ruolo regolatore dell'espressione genica e della risposta

cellulare allo stress ossidativo e a stimoli apoptotici pro, contribuendo insieme alla crescita e alla differenziazione della

cellula.

La riparazione del DNA è un insieme di processi con cui una cellula identifica e corregge danni alle molecole di DNA.

La demminazione di nucleotidi del DNA

3% di citosina viene metilato naturalmente e quando viene accidentalmente deamminato forma T.

Depurinazione e deaminazione: le reazioni chimiche spontanee più frequenti a creare gravi danni al DNA.

Come le modifiche chimiche di un nucleotide producono mutazioni

-Deaminazione di citosina.

-Depurinazione con la perdita di una coppia di nucleotidi: l'eliminazione

Sintesi dell’ RNA

L’RNA contiene ribosio anziché 2-desossiribosio e uracile piuttosto di timina. RNA di solito esiste come un unico filo.

Ci sono tre principali tipi di RNA:

RNA messaggero (mRNA)

RNA ribosomiale (rRNA)

trasferire RNA (tRNA)

Semplice e complesso DNA - RNA polimerasi dipendenti

RNA polimerasi virale (1 subunità)

RNA polimerasi procariotiche (4 subunità differenti)

RNA polimerasi eucariotiche e archeal (almeno 12 subunità)

Concetti generali sintesi di RNA

• Tre fasi: inizio, allungamento e terminazione.

• Il procariote RNA-pol può legarsi al DNA stampo direttamente nel processo di trascrizione.

• L’ eucariotiche RNA-pol richiede co-fattori per legarsi al DNA stampo nel processo di trascrizione.

Trascrizione eucaristiche

DNA  RNA

RNA POLIMERASI II  mRNA

Trascrizione di eucarioti

Iniziazione

L’iniziazione richiede un promotore e regioni di regolazione a monte.

Gli elementi cis-agenti sono le sequenze specifiche di DNA stampo che regolano la trascrizione di uno o più geni.

Il controllo della trascrizione di RNA polimerasi II richiede il montaggio di complessi costituiti da fattori di trascrizione

che interagiscono con il promotore, che si trovano nel TATA box, che si trova a circa 30 paia di basi a monte della

trascrizione.

Promotori nei procarioti e negli eucarioti

Le basi del filamento codificante che rappresenta il punto d’inizio della trascrizione è numerata +1. questo nucleotide

corrisponde al primo nucleotide incorporato nell’RNA.

I successivi nucleotidi all’interno della regione trascritta sono numerati con + ; Le sequenze non trascritte situate a

sinistra dal punto di inizio sono numerate con segno negativo.

Meccanismo di reazione di RNA polimerasi

1. DNA dipendente dall’ RNA polimerasi

2. RNA polimerasi polimerizza in 5 '3' (rNTP solo aggiunto all'estremità 3 ')

3. OH 3’ della catena reagisce con il -PO4 dell’arrivato rNTP , liberando pirofosfato (PPI)

4. Il ribonucleotide aggiunto segue re regole dell’appaiamento Watson-Crick, determinate dal modello del filamento

5. Le RNA polimerasi non hanno bisogno di un primer, ma hanno bisogno di DNA ds

6. Alle RNA polimerasi manca un’attività esonucleasica, quindi non è possibile leggere ed è molto più soggetto agli

errori della DNA polimerasi.

RNA TRASCRIZIONE

Iniziazione

L’RNA polimerasi si lega ad una regione di DNA nota come promotore, che segna l'inizio di un gene

I Promotori sono specifici geni

L’RNA polimerasi non ha bisogno di un primer

I fattori di trascrizione (TF) si riuniscono presso il promotore formando una inizio di trascrizione. Le proteine attivatrici

aiutano a stabilizzare il complesso

L’ espressione del gene può essere regolata (acceso / spento o su / giù) controllando la quantità di ciascun fattore di

trascrizione.

L’ RNA polimerasi srotola il DNA e rompe i legami idrogeno tra le basi dei due filamenti, separandoli uno dall'altro

L’appaiamento delle basi avviene tra i nucleotidi di RNA in arrivo e i nucleotidi del DNA del gene (modello).

L'RNA polimerasi lavora solo su un filamento di DNA che si legge nella direzione 3 '5' 'in modo che la trascrizione

cresca nei 5' 3 '.

Inizio,allungamento e terminazione della trascrizione dell’RNA

Dopo che l'RNA polimerasi è stata ancorata sul promotore, avviene la formazione del complesso aperto del promotore

dove l’RNA polimerasi avvia la sintesi di RNA.

L'iniziazione della trascrizione genica negli eucarioti avviene in fasi specifiche. Innanzitutto, una RNA polimerasi con i

fattori di trascrizione generali si lega alla regione del promotore del gene per formare un complesso chiuso chiamato il

complesso PREINITIATION. Senza la necessità di un primer, l’RNA polimerasi può avviare la sintesi di una nuova

catena di RNA utilizzando il filamento di DNA template per guidare la selezione del ribonucleotide e la

polimerizzazione chimica. Tuttavia, molte delle sintesi avviate vengono interrotte prima che le trascrizioni raggiungano

una lunghezza significativa (~ 10-12 nucleotidi). Una volta che questa soglia è raggiunta, l’ RNA polimerasi sfugge ai

promotori e la trascrizione procede alla fase di allungamento. Molti cicli di iniziazione abortiva possono verificarsi

prima che la trascrizione cresca di lunghezza sufficiente a promuovere la fuga della polimerasi dal promotore. Nel

corso dei cicli di iniziazioni abortive, l’RNA polimerasi rimane legato al promotore.

ALLUNGAMENTO:

Dopo la fuga del promotore e lo spargimento della maggior parte dei fattori di trascrizione per l'iniziazione, la

polimerasi acquisisce nuovi fattori per la prossima fase della trascrizione: l'allungamento. Il DNA a doppio filamento

che entra dalla parte anteriore dell'enzima viene decompresso di avvalersi del filamento stampo per la sintesi di RNA.

Fattori di allungamento

Tra le proteine reclutate per la polimerasi vi sono i fattori di allungamento, così chiamati perché stimolano

l’allungamento della trascrizione.

p-TEFb

ELL

SII (TFIIS)

Elongin (SIII)

Terminazione:

La sequenza di terminazione è AATAAA seguita da ripetizioni GT.

• La terminazione è strettamente correlata alla modificazione post-trascrizionale.

Iniziazione multipla della trascrizione (eucarioti)

Mentre una polimerasi è impegnata nella sintesi di RNA, un’altra polimerasi aderisce al promotore tornato libero,

dando inizio a un nuovo ciclo di trascrizione.

Maturazione dell’mRNA negli eucarioti

Modifica della fine del 5 'di un mRNA (5'CAP)

L'estremità 5 'dell'RNA nascente è sigillata da un legame con 7'-metil guanosintrifosfato. Si forma un cap 5 'che

protegge l'RNA da una rapida degradazione e rappresenta un segnale di riconoscimento per i ribosomi.

Maturazione eucaristica del Dna –Poliadenilazione sul 3 'del trascritto primario

L'RNA polimerasi trascrive negli eucarioti oltre la fine del gene funzionale, fermandosi in corrispondenza di sequenze

che sono tipicamente un segnale di poliadenilazione 5'-AAUAAA-3 ' che si trova nella regione 3' del trascritto primario.

Questo segnale indica a una CPSF endonucleasi di tagliare il trascritto. Successivamente, un poli (A) polimerasi si

aggiunge all’ mRNA che aggiunge nucleotidi adenilici per formare un segmento di 100-200 residui di poli-A.

Splicing alternativo (eucarioti

)

Gli esoni (regione espresso) sono "Codifica" regioni

Gli introni (regioni intragenica) vengono rimossi e diverse combinazioni di esoni formano diversi mRNA con

conseguenti più proteine da uno stesso gene.

Gli esseri umani hanno 30.000 geni, ma sono in grado di produrre 100.000 proteine.

Introni -splicing (spliceosoma maggiori e minori)

I snRNPs sono molecole di RNA di 100-200 nucleotidi e 8 proteine che si legano selettivamente alle sequenze

presenti al confine introne-esone. SnRNP o "Snurps" sono coinvolti nello splicing dell’mRNA eliminando gli introni dal

hnRNA.

RNA auto-splicing interviene per rari introni che formano un ribozima

3'OH di un nucleoside guanina libero attacca il fosfato al sito di splicing 5 '

3'OH dell'esone del 5 'diventa un nucleofilo e il secondo risultato di transesterificazione risulta nell’unione dei due

esoni

Regolazione dell'espressione genica IN cellula eucaristica

STRUTTURA DEL Promotori eucariotici

I Fattori di trascrizione generali (TFII) che favoriscono il reclutamento della RNA polimerasi II

(Velocità di trascrizione bassa).

La TATA box binding protein (TBP) e TFIID

TBP si lega al DNA nel solco minore e piega il DNA. TBP è una singola catena polipeptidica che è piegata in due

domini molto simili . TBP si siede sul DNA come una sella a cavallo. E 'responsabile del riconoscimento e vincolante

della sequenza TATA box

TFIID è un complesso di molte subunità. Esso comprende la proteina che si legano specificamente alla proteina TATA

binding oltre a diversi fattori TBP-associati o TAFs.

Assemblea di complesso di inizio eucaristica

Collegamento del TBP proteine (TATA-binding protein) per la TATA box con altre proteine fattori TAF.

Collegamento delle proteine TFIIA e TFIIB.

Collegamento di RNA polimerasi con la proteina TFIIF.

Collegamento delle proteine TFIIH e TFIIE.

TFIIH è una chinasi che fosforila RNA polimerasi (controllo del rilascio dell'enzima) e possiede un'attività elicasica che

apre il DNA permettendo l'inizio della trascrizione e attivare la polimerasi per iniziare la sintesi di RNA.

Complesso pre-avvio (PIC)

RNA polimerasi II  controllo dell’allungamento ruolo positivo della trascrizione del fattore di allungamento, P-TEFb

P-TEFb è una chinasi ciclina dipendente che può fosforilare la sensibilità inducendo il fattore DRB (DSIF) e il fattore di

allungamento negativo (NELF) così come il dominio carbossi terminale della subunità grande Pol II. Ciò causa il

passaggio ad un allungamento produttiv che porta alla sintesi di mRNA.

A questo punto la Pol ei fattori di allungamento si dissociano. Il CTD è defosforilato da fattori di terminazione e la Pol è

pronta per iniziare una nuova trascrizione.

Regolamento specifici fattori di trascrizione (TFS)

-Espressione di tessuti specifici

-Legame reversibile con un attivatore (o inibitore) (ormoni)


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miki.m96

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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in biotecnologie (Facoltà di Agraria, di Chimica Industriale, di Farmacia, di Medicina e Chirurgia, di Medicina Veterinaria e di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali)
SSD:
Università: Bologna - Unibo
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher miki.m96 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Chimica e biochimica generale e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Bologna - Unibo o del prof Guarnieri Carlo.

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