Nucleosidi

Nucleosidi, nucleotidi e acidi nucleici

Storia e scoperta

Friedrich Miescher nel 1869:

• Isolò quello che lui chiamava nucleina dai nuclei delle cellule di pus.
• La nucleina ha dimostrato di avere proprietà acide, quindi venne chiamata acido nucleico.

Tipi di acidi nucleici

Esistono due tipi di acido nucleico:

• L'acido desossiribonucleico (DNA)
• Acido ribonucleico (RNA)

Distribuzione degli acidi nucleici

• Il DNA si trova nel nucleo con piccole quantità nei mitocondri e cloroplasti.
• L'RNA si trova in tutte le cellule.

Funzioni di DNA e RNA

Acido desossiribonucleico (DNA): vettore di informazione genetica.

Acido ribonucleico (RNA): intermediario nell'espressione delle informazioni genetiche e altri ruoli diversi.

Il dogma centrale (F. Crick)

DNA ➞ RNA ➞ Proteina (genoma ➞ trascrittoma ➞ proteoma)

Unità monomeriche e struttura dei nucleotidi

Le unità monomeriche degli acidi nucleici sono i nucleotidi.

I nucleotidi sono costituiti da tre subunità strutturali:

• Lo zucchero: ribosio nell'RNA, 2-desossiribosio nel DNA
• Base eterociclica
• Fosfato

Basi eterocicliche

Ci sono cinque basi comuni per gli acidi nucleici:

• Pirimidine: citosina, timina (DNA), uracile (RNA)
• Purine: adenina, guanina

Nucleotidi

NUCLEOTIDI = NUCLEOSIDE + FOSFATO

Struttura primaria degli acidi nucleici

Un polinucleotide di circa 50 o meno nucleotidi è chiamato oligonucleotide.

Modi di rappresentazione della struttura primaria:

• 5 '- sinistra a destra - 3'
• pACGTA(OH)-ACGT

Struttura secondaria degli acidi nucleici

1944: Avery, MacLeod e McCarty - forte evidenza che il DNA è materiale genetico.

1950: Chargaff - un'attenta analisi del DNA da una vasta gamma di organismi. Il contenuto di A, T, C & G varia a seconda dell'organismo, tuttavia: A = T e C = G (Regola di Chargaff). Dati Raggi X cristallografici di Maurice Wilkins e Rosalind Franklin.

1953: Watson e Crick - struttura del DNA (1962 premio Nobel con M. Wilkins).

Watson e Crick proposero una struttura a doppia elica del DNA in cui una base purina o una pirimidina in una catena è legata all’idrogeno col suo complemento nell'altro.

Wilkins e Franklin (1952)

Crystalografia a raggi X: Poiché il premio Nobel può essere concesso solo ai vivi, la collega di Wilkins, Rosalind Franklin, (1920-1958), morta di cancro all'età di 37 anni, non potè essere onorata.

Accoppiamento delle basi

• Analogamente, gli importi di G, C e A, T nel DNA sono uguali a causa dei legami idrogeno complementari.
• Due filamenti antiparalleli di DNA sono accoppiati da legami idrogeno tra basi puriniche e pirimidiniche.

Struttura a elica del DNA

Le basi puriniche e pirimidiniche sono all'interno, gli zuccheri e i fosfati all'esterno. Il DNA a doppio filamento è avvolto per formare una doppia elica destrogira.

L'impilamento delle basi produce una leggera torsione dell'elica a causa di una distribuzione non esattamente simmetrica dei legami glicosidici che crea due scanalature, una maggiore (12 A) e una secondaria (6 A).

Strutture elicoidali doppie A, B, Z

• Forma A - Favorita dalla disidratazione.
• Forma B - DNA standard doppia elica a destra in condizioni fisiologiche.
• Forma Z – Elica a sinistra quando si alternano sistematicamente purine e basi pirimidiniche. Scarsa rilevanza fisiologica.

Struttura terziaria del DNA: Supercoils

Ogni cellula contiene circa due metri di DNA. Il DNA è "impacchettato" di avvolgimento intorno ad un nucleo di proteine note come istoni.

Gli istoni sono ricchi di residui di lisina e arginina e in quantità minori di proteine acide non istoniche.

L'assemblaggio DNA-istoni è chiamato nucleosoma.

Il DNA nucleare è organizzato in cromosomi ciascuno dei quali è costituito da una singola molecola di DNA con un guscio di proteine.

Il genoma umano è organizzato in 23 cromosomi presenti in due copie: 22 rispettivamente di origine materna e paterna e 1 cromosoma sessuale (X, Y).

Le cellule umane (somatiche) hanno 23 coppie di cromosomi (22 paia di autosomi e un paio di cromosomi sessuali, eterocromosomi) per un totale di 46 cromosomi per cellula.

Cromatina

DNA complessato con proteine basiche (istoni) e acide.

Il microscopio elettronico di un'estesa cromatina mostra l’organizzazione "perle-on-a-string". Le "perle" sono complessi DNA-istoni chiamati nucleosomi, e la "stringa" è DNA a doppia elica.

Gli istoni formano un ottamero di nucleosomi composto da due coppie ciascuno di H2A, H2B, H3 e H4; intorno al nucleo di questo è avvolto due volte un filamento di DNA. Il complesso DNA e istoni è definito nucleosoma. Ogni nucleosoma contiene 147 paia di basi. Il Linker contiene circa 54 paia di basi.

DNA forma degli impacchi mancini attorno all’ottamero istonico.

Struttura nucleosomi

• (a) Quattro paia di monomeri di proteine istoniche cioè H2A, H2B, H3, H4 costituiscono il nucleo dell’istone (ottamero).
• (b) Ogni nucleosoma è composto da un nucleo (ottamero), istone H1 e linker DNA. Il DNA linker consiste di 54 coppie di basi. L’istone H1 si lega al nucleo e al linker DNA.

Struttura 30 nm: Cromatina di fibre

Il modello di cromatina in fibra viene mostrato come un solenoide o come un’elica, formata da singoli nucleosomi. I nucleosomi si associano attraverso i contatti tra le molecole di istoni H1 adiacenti.

I nucleosomi sono disposti ad elica sinistrorsa con 6 nucleosomi per giro, formando così una fitta fibra di 30 nm di diametro.

L'esposizione dei geni in un sistema così addensato si verifica dopo un processo di decondensazione della cromatina (cromatina attiva).

Espressione e trasferimento dell'informazione genetica

Il dogma centrale:

• Replicazione del DNA ➞ trascrizione del DNA ➞ traduzione dell'mRNA ➞ proteina

Replicazione: processo mediante il quale il DNA viene copiato con molta fedeltà.

Trascrizione: processo mediante il quale il codice genetico del DNA viene letto e trasferito all’RNA messaggero (mRNA). Questo è una fase intermedia nell’espressione proteica.

Traduzione: Il processo per cui il codice genetico viene convertito a una proteina, il prodotto finale dell'espressione genica.

Il meccanismo di replicazione del DNA

Arthur Kornberg et al

Inizio

• Le proteine si legano al DNA e aprono la doppia elica.
• Preparano il DNA per l’appaiamento delle basi complementari.

Allungamento

• Le proteine collegano le corrette sequenze di nucleotidi in un nuovo filamento continuo di DNA.

Terminazione

• Le proteine rilasciano il complesso di replicazione.

Replicazione

Processo di duplicazione del genoma prima della divisione cellulare.

Significato biologico

• Un’estrema accuratezza della replicazione del DNA è necessaria al fine di preservare l'integrità del genoma nelle generazioni successive.
• Negli eucarioti, la replica si verifica solo durante la fase S del ciclo cellulare.
• Il tasso di replica negli eucarioti è più lento e ciò si traduce in una maggiore fedeltà / accuratezza della replicazione.

La replicazione copia le informazioni genetiche:

• Un singolo filamento di DNA serve come modello per un nuovo filone.
• Le regole di replicazione diretta dell’appaiamento delle basi.
• Il DNA è replicato in fase S (sintesi) del ciclo cellulare.
• Ogni cellula del corpo diventa un set completo di DNA identici.

Regole di base della replicazione

• A. Semi-conservativa
• B. Inizia all’origine
• C. Può essere uni o bidirezionale
• D. Semi-discontinua
• E. Sintesi sempre in direzione 5'-3'
• F. Primer dell’RNA richiesti

Tra i 3 modelli possibili (conservativa, semiconservativa o dispersiva), la replicazione è semiconservativa.

Partiamo dall'origine...

Le proteine che iniziano identificano sequenze di basi specifiche sul DNA chiamate siti di origine.

Procarioti - unico sito di origine (Ad esempio E.coli – Oric)

Eucarioti - più siti di origine (replicatore).

La replicazione del DNA inizia in molti punti nei cromosomi eucaristici. Ci sono molte origini di replicazione nei cromosomi eucariotici. Le DNA polimerasi possono trovare e correggere gli errori.

Le proteine svolgono il processo di replicazione

• Il DNA serve solo come modello.
• Gli enzimi e le altre proteine fanno il vero lavoro di replica.

Gli enzimi decomprimono la doppia elica.

I nucleotidi liberi-galleggianti formano legami idrogeno con il filamento stampo.

Lo svolgimento del DNA da parte elicasi espone le basi del DNA (forche di replicazione) in modo che la replica possa avvenire. L’elicasi idrolizza l’ATP, al fine di rompere i legami idrogeno tra i filamenti di DNA.

Le Topoisomerasi eliminano il superavvolgimento torsionale dei filamenti

Topoisomerase DNA si lega in prossimità della forcella e uno dei filamenti di DNA per ridurre la torsione dei filamenti causata dall'apertura della doppia elica. Successivamente al rilassamento del DNA, il filamento tagliato viene sigillato.

Il ruolo dell'enzima DNA Polimerasi III

L'enzima DNA Polimerasi III lega covalentemente il dNTP-trifosfato con un legame fosfodiestere al 3'-terminale di una catena polinucleotidica in crescita.

La sintesi avviene sempre nella direzione 5'-3':

• Riconoscimento del nucleotide
• L’enzima catalizza la polimerizzazione (DNA polimerasi III)
• Le basi complementari sono accoppiate
• Il substrato utilizzato è dNTP

Correzione di errori durante la replicazione

Che cosa succede se si verifica una mancata corrispondenza di base?

DNA polimerasi ha un’attività esonucleasica in direzione 3' ➞ 5' al fine di correggere gli errori.

Il DNA polimerasi III per impegnare nucleotidi necessita di un primer iniziale che è fatto da RNA. Nella replica sono attivi dei primasi (RNA polimerasi), che sintetizzano un breve segmento di RNA (3-10 ribonucleotidi). Questo primer RNA viene poi rimosso dal DNA polimerasi I (a) in una fase successiva di replica.

L’assemblaggio della DNA polimerasi III

L'anello di scorrimento è costituito da due subunità beta che fissano il DNA polimerasi III del filamento stampo.

L'attività del DNA polimerasi III è dovuta al complesso dimero (nucleo). Questa attività è molto aumentata (da 60 a più di 10000 nucleotidi legati) dalle proteine accessorie che sono disposte in un anello intorno al punto di inizio della replicazione.

Le proteine elicasi, primasi e SSB (Single Strand Binding), insieme con la DNA polimerasi III dimerica, formano un complesso sopramolecolare che opera simultaneamente sui due fili (leader e trefoli ritardo). L’elicasi si muove in avanti e il complesso supramolecolare rincorre dietro.

La formazione del frammento di Okazaki del DNA

DNA polimerasi I (a) con l'attività nucleasica rimuove il primer RNA e l'attività della DNA polimerasi I riempie con NTP le lacune.

Proteine del nucleo nella forcella di replicazione

• Topoisomerasi - Impedisce torsioni causate da rotture del DNA
• Elicasi – separa i 2 filamenti
• Primasi (RNA polimerasi) - sintesi dell’RNA primer
• Rilegatura filo singole proteine (SSB) – previene il reannealing di singoli filamenti
• DNA polimerasi III - sintesi del nuovo filamento
• DNA polimerasi I - colma il divario tra i frammenti di Okazaki; possiede anche un'attività esonucleasica che rimuove l’RNA primer
• DNA ligasi – sigilla le tacche