Microscopie avanzate

Microscopie avanzate

5/10/2016

Le cellule, a meno che non contengano esse stesse dei pigmenti, sono trasparenti, e molte delle sostanze che riteniamo noi abbiano un colore di per sé, ad esempio il DNA, se prendiamo un boccettino di DNA, un campione, vediamo che è bianco, al limite giallastro. È importante quindi considerare i coloranti che venivano essenzialmente dallo sviluppo dei coloranti, dall’industria tessile, ma erano nei colori limitati: alcuni di origine resinale, altri di origine animale; color rosso, nero, zafferano (ottenuto per sovrasaturazione di marrone o viola), indaco, al massimo verde…

Lo sviluppo dei coloranti

Questo fino a quando nell’800 c’è stato un inglese chimico, che voleva in effetti lavorare su sostanze che potessero avere un’azione funghicida (all’epoca considerata antibatterica) e allora è partito con la distillazione di residui che costavano poco, ad esempio derivati del catrame o residui dal catrame, e ha cominciato a distillarli per vedere se riusciva ad ottenere qualche sostanza particolare, ma ha visto che come funghicida questa sostanza è stata un disastro però, in compenso, è riuscita ad isolare per esempio questa sostanza che lui ha chiamato “Mauveine” (da mauve, malva) e questo ha avuto importanza per un suo amico che aveva una fabbrica di tessuti, e quando l'ha vista è stato amore a prima vista, perché poteva ottenere dei pezzi colorati, allora ha poi deciso di provare a venderli e le signore dell’epoca sono letteralmente impazzite perché questo colore non esisteva, non c'era prima, non si trovava, era la novità, novità a tal punto che in Inghilterra c’è stato un intero decennio, il “Decade proprio perché tutte le signore che potevano permetterselo vestivano di Mauve”, questo colore a Londra.

Questo chimico poi ha continuato nelle distillazioni e ha ottenuto un po' tutta la serie di coloranti, che erano sì stati stabilizzati per l'uso sulla stoffa, ma potevano essere utilizzati per tutta una serie di altre cose, per esempio all'epoca sono stati prodotti di questi coloranti a basso prezzo che pittori più squattrinati potevano comprarsi, e tra questi per esempio c'era anche Van Gogh: in uno dei suoi quadri Van Gogh aveva lasciato la strada come incompiuta, ma successivamente è stato ritrovato un libretto in cui si diceva che la strada doveva essere di colore rosa, ma il rosa sul quadro non c'era più, e questo perché era stato utilizzato uno dei colori di nuova sintesi che non resisteva alla luce, questo colore era l'eosina, che noi oggi usiamo naturalmente per colorare delle sezioni, ma non è stabile, a luce prolungata se ne va e praticamente non lascia tracce, allora a quel punto quando hanno scoperto che quella strada era effettivamente rosa hanno esaminato tracce di eosina con il bromo (perché è un componente brominato) e hanno visto che effettivamente il colorante era quello, l’eosina, e se n'era andato.

Microscopia e limite di risoluzione

A cellule molto grosse noi arriviamo anche con l'occhio nudo, mentre dopodiché noi abbiamo bisogno di un supporto: questo supporto può essere microscopio elettronico, che ci permette di arrivare fino a piccole parti della cellula, ma se noi dobbiamo guardare virus o atomi allora ci vuole un altro tipo di strumento che è il microscopio ottico, che comunque ha un limite.

Quello che ci interessa dunque è il limite di risoluzione, che ci permette di vedere due punti distinti per capirci qualche cosa utilizzando un mezzo che abbiamo a disposizione: questo non vuol dire che noi siamo costretti ad utilizzare tutte le volte il massimo possibile utilizzare al microscopio ottico per dire “sì, allora si utilizza il microscopio ottico che è più semplice, dopodiché se si avranno altre necessità si provvederà ad utilizzare altri strumenti” (ad esempio immagini di un endotelio, che è spesso, con microscopio confocale, danno lo stesso risultato che con microscopio a fluorescenza, quindi bisogna fare quel che serve).

Da tenere a mente: 1A° = 0,1 vm non 10 vm!

Ad esempio: polispermia, uovo di anfibio, l’uovo è visibile ad occhio nudo, ma non lo sono gli spermatozoi, allora a questo punto la visione sarebbe parziale, passando a un microscopio a scansione (anche alla minima potenza) vediamo che la situazione è più complicata e c’è un processo biologico in atto.

In base a quello che vediamo possiamo avere delle informazioni riguardo alla struttura e alla funzione di quel che vediamo, ma è importante che quel che vediamo noi è preparato per la microscopia elettronica (o altro), che il preparato è il più vicino possibile alla realtà, e qui cominciano le grane perché in alcuni casi il preparato è facile e non c'è bisogno di fare niente (come per esempio una goccia di sangue su un vetrino, strisciata, otteniamo un preparato che ha un monostrato di cellule in cui non si viene a creare quasi nessun artefatto, e vediamo i tipi di cellule diverse tra di loro morfologicamente) ma se dobbiamo analizzare altre cose cominciamo ad avere dei problemi perché quello che noi vediamo essenzialmente è un tessuto (o cellule) che deve essere messo in condizione di essere analizzato e di essere visto, e allora in pratica dobbiamo farlo attraversare dalla luce, il che vuol dire che la nostra struttura deve essere sezionata, deve essere talmente sottile, da poter essere attraversata dalla luce, e se io l'ho colorata allora deve potermi dare un'immagine, un'immagine non solo di morfologia (il nostro è un mondo 3D ma noi dobbiamo ragionare in 2D, inoltre ragionando sul contrasto noi vediamo la luce riflessa, perché la luce incide e poi ritorna, con determinate lunghezze d'onda più o meno assorbite) noi vediamo un contrasto di colore, in condizioni normali distinguiamo il mondo essenzialmente per i colori (mentre al buio distinguiamo per il contrasto luce/buio), allora noi sull'immagine 2D dobbiamo dare colore altrimenti la luce attraversa un preparato che non ci aiuta molto… però comunque noi prima dobbiamo sezionare il campione, perché dobbiamo utilizzare i microscopi.

I primi microscopi

Ci sono stati tanti tipi di microscopio: il primo microscopio parte dall'evidenza che una biglia nella zona centrale ingrandisce, allora se posta al centro di una placca di metallo e attraverso un ago per infilare il nostro oggetto, e se dall'altra parte c'era la luce, poteva avere qualcosa di un po' ingrandito, poteva però osservare solo quello che trovava già di per sé sottile, ad esempio buccia di cipolla o ali di farfalla, cose che sono talmente sottili da poter essere attraversate dalla luce, e che hanno un pigmento, altrimenti non si capisce niente…

Poi successivamente c'è stato qualcuno che ha pensato anche a sezionare, il ragionamento di come ottenere una sezione è partito da Leonardo Da Vinci, che a un certo punto ha avuto interesse per l'occhio e ha iniziato a studiare l'occhio di bue, occhio che però con l'umor vitreo era qualcosa che non si poteva sezionare, allora cosa ha fatto, ne ha fatto una inclusione con i mezzi dell'epoca, ossia con l'albume, e facendolo indurire in questo modo poteva sezionarlo dopo.

Ma si potevano sezionare molte cose, ad esempio Robert Hooke ha sezionato il sughero, che era abbastanza duro da poter essere sezionato (perché il punto fondamentale è che si può sezionare un oggetto il più vicino alla realtà, e sottile, se duro). Proprio Hooke ha definito le zone del sughero come “piccole celle” vicine le une alle altre, e quindi ha dato il nome alle cellule, nel sughero: è arrivato poi a definirne anche la struttura esterna.

Il taglio è pressione esercitata in modo concentrato in unico punto, e quindi enormemente aumentata: è importante che non comporti alterazioni, artefatti nel preparato, che quindi è bene sia duro, ma elastico (così che con il taglio sia il meno danneggiato possibile).

Tutti i microscopi avevano in comune una cosa: la sorgente di illuminazione era la luce esterna, o la candela, e tutto questo comporta che o si lavora di giorno, o se si lavora di sera i colori non sono quelli veri (perché la luce della candela per esempio non ha la stessa tonalità di blu della luce del giorno) e quindi ci sono tutta una serie di errori dovuti alla fonte di illuminazione.

Inoltre si sono sviluppati due oculari, e non solo uno, perché gli occhi sono due e si riesce a vedere meglio con entrambi, ovviamente.

Lenti, condensatori e obiettivi

Una delle cose che sono evolute enormemente e stanno ancora evolvendo enormemente è la tecnica delle lenti: qualsiasi tipo di lente è in fondo un pezzo di cristallo che è modulato in modo da ingrandire, la tecnica ha dovuto evolvere per riuscire a dare un campo rotondo sul vetrino uniforme, una qualità di immagine che è la stessa al centro e anche alla periferia, senza aberrazioni (ad esempio un reticolato di linee parallele che alla periferia diventano “cuscinetto” e si allargano, aberrazioni sferiche che alterano la vista del preparato, astigmatismi, o realtà falsa), il preparato è visto in piano, l’immagine è buona in qualsiasi piano.

La luce deve essere quanto più coerente possibile e stabile (quella del sole lo è, quella della candela un po' meno): quello che si può fare è che sul vetrino, sul portacampione, la luce arrivi tutta coerente, e che il fascio abbia la stessa intensità alla periferia e al centro, e viene fatto da una serie di lenti che si chiamano condensatori, che prendono il fascio di luce più grande e lo condensano in uno più piccolo e coerente (l’unico fascio di luce coerente in natura sempre è il laser, tutte le altre luci vanno corrette, e per questo esistono altre lenti, dei diaframmi, e una zona del vetrino che è illuminata in modo coerente e sufficientemente forte).

Dopodiché c’è la formazione di una cosa fondamentale, ossia la luce che entra tocca la sezione e quindi quando esce dal vetrino porta con sé l'immagine, che a questo punto però è ingrandita di 0 volte, ma i microscopi servono ad ingrandire, ma ingrandiscono l’immagine che viene dal passaggio della luce attraverso il campione, la luce appena uscita è immagine ed è grossa quanto l’immagine uscita dal vetrino, perché è l’obiettivo che ingrandisce: è l’obiettivo la vera propria lente di ingrandimento, fatta da una serie di lenti in realtà che portano fino a un limite di ingrandimento, normalmente in un microscopio ottico un classico “Revolver” in sequenza va 2, 4, 10, 40, fino a 100x che è il massimo che si utilizza, e non può lavorare con una distanza di aria ma deve essere immerso in olio che definisce il minimo di diffrazione possibile, dopodiché l’immagine arriva all’oculare e viene ingrandita perché anche l’oculare è una lente, quindi l’ingrandimento finale è dato dall’ingrandimento dell’obiettivo moltiplicato per quello dell’oculare che vale praticamente 10x (ne esistono anche da 20x ma praticamente non li usa nessuno), e come risultato si ottiene il massimo ingrandimento in quanto immagine di 1000, ovvero 100x10=1000 volte immagine ingrandita del vetrino del preparato, che può poi eventualmente ulteriormente essere ingrandita ma digitalmente.

Ma qui iniziano i problemi perché un’immagine ingrandita continuerà a aumentare di risoluzione fino a quando non avrà aggiunto la sua risoluzione, ogni immagine ha un limite di risoluzione, non si può aggiungere risoluzione è quello che è che.

La risoluzione è la distanza minima a cui si possono ottenere due punti separati, visibili chiaramente.

Risoluzione e contrasto sono in qualche modo intercorrelati, hanno un certo valore assieme, mentre risoluzione e ingrandimento no, sono due cose diverse.

Dal campione 3D alla sezione 2D

Il “gioco” delle lenti permette che ci sia sul vetrino del preparato un fascio di luce assolutamente coerente, e a questo punto bisogna avere un preparato che sia visibile sul preparato solido: il passaggio da 3D a 2D porta un sacco di problemi, e non ultimo dei quali quello dell'interpretazione dell'immagine, perché è facilissimo ogni volta che abbiamo un'immagine bidimensionale sbagliarsi e non interpretarla correttamente, il nostro cervello fa dei giochi strani (ad esempio dati tre punti è facile che nostro cervello dica che sono in fila, oppure che non sono in fila, il nostro cervello cerca di ragionare in questo senso) e lo stesso vale per le immagini in 3D, su qualche tessuto solido si può lavorare in questo senso (ad esempio sull'osso, che è compatto e solido, possiamo limarlo fino a diventare traslucido e a questo punto ottenere un'immagine che però riusciamo a vedere con 20x 40x e non oltre, perché i dettagli sono comunque annegati in una laminetta di osso che nel migliore dei casi è 30 micron di spessore, non riesco a farlo più sottile perché si tratta proprio di una limatura, e allora devo ricorrere altre metodiche) in pratica devo incominciare a preoccuparmi di vedere la mia realtà il più vicino possibile a quello che è, devo giocare con una serie di tecniche di preparazione che mi permettono di avere un preparato decente e ripetibile, e in pratica se devo fare una sezione dobbiamo ottenere da un tessuto che tendenzialmente è molle, qualcosa che sia duro, ma elastico, e per fare questo dobbiamo da subito “toglierci di mezzo i problemi che abbiamo”.

Ad esempio, abbiamo un campione biologico come è una biopsia epatica, cioè un pezzettino di fegato, il primo problema che si presenta dal momento del prelievo è il deterioramento, noi prendiamo un gruppo di cellule e le isoliamo dal loro ambiente e viene a mancare l'ossigeno, ma soprattutto nell'arco di secondi viene a mancare l'acqua, le cellule vanno incontro a disidratazione perché le cellule vengono spostate da un ambiente umido-bagnato all'aria, quando le cellule si trattano tendono ad asciugarsi e si seccano e allora la biopsia si danneggia e si vanno a sommare altri danni all'ipossia e la carenza di acqua già presenti che vendono irreparabile la situazione.

Quindi successivamente dopo il prelievo si interviene con una soluzione fissativa come la formalina.

Fissazione e inclusione del campione

Esiste una fissazione di tipo fisico (agisce sull'acqua) e una fissazione di tipo chimico (può essere sull'acqua ma in genere agisce su altri componenti, si tratta praticamente di agenti che noi diamo al tessuto e possono agire in tanti modi diversi, dipende sempre anche dal tipo di microscopia che stiamo facendo perché ad esempio quello che può andar bene per la microscopia ottica può andare bene anche per la microscopia elettronica ma può anche andare malissimo, ad esempio la formalina può andare bene per certe cose ma la fissazione alcolica che agisce tramite alcol è devastante per certi casi perché disidrata violentemente così come fanno anche per esempio acido acetico e acido cloridrico o miscele di aldeidi, tra cui la formalina in primis, che agiscono essenzialmente sul gruppo NH2 delle proteine, poi legano anche in parte anche acidi nucleici altre sostanze ma essenzialmente il target è proteico).

Formalina è una soluzione che viene venduta liquida in genere ma in realtà è la soluzione di formaldeide con un po' di metanolo per stabilizzarla, mentre la formaldeide esiste ma non è liquida, è in forma solida, e si chiama paraformaldeide, quindi per diventare liquida in soluzione deve essere scaldata, non contiene metanolo, ma non si può tenere per giorni (preparato può essere utilizzato con acqua per un periodo di tempo limitato).

Quindi una volta stabilizzato il preparato non basta fissarlo, perché il fine è quello di indurire il tessuto in modo che si possa sezionare, e per essere sezionabile bisogna fondamentalmente che l'acqua venga sostituita da qualcosa che ne faccia una sorta di “scheletro stabile”, qualunque sia questa sostanza, in genere paraffina, resine, vanno benissimo, sono quasi tutte non miscibili con l'acqua e ci permettono quindi di disidratare progressivamente il nostro campione, questo fa sì che l'intera struttura sia talmente stabile che noi passiamo sezionare praticamente senza problemi utilizzando degli strumenti che si chiamano microtomi, ce ne sono a mano e elettrici, tanti tipi a seconda del tipo di sezione che vogliamo fare noi, e sono oggetti in cui attraverso una lama spessissima di metallo possono tagliare sezioni fino a fino al massimo a 3-5 micron, di solito 10 micron.

Questo vuol dire che noi abbiamo una sezione di 5 micron spessa, presa del tutto a caso nella biopsia di fegato da cui siamo partiti, ma un nucleo di un epatocita è tranquillamente 10 micron di diametro, quindi vuol dire che se tutto va bene non ne abbiamo preso fino alla metà, noi vediamo non soltanto una parte del tessuto ma soltanto una parte della cellula e non necessariamente nella zona equatoriale della cellula, ma per esempio in una calotta del nucleo, perché noi siamo andati a caso e abbiamo ridotto brutalmente il nostro tessuto in un qualcosa di molto sottile di cui noi abbiamo solo una parte, quindi ovviamente conviene avere più sezioni, però quello che abbiamo è così sottile che noi possiamo colorarlo, e possiamo vederlo, le nostre sezioni quindi ci danno un'immagine che è ingrandita, che noi possiamo vedere (se non coloriamo le cellule in coltura non sono visibili, solo colorando possiamo avere delle informazioni in più e passiamo a capire qualcosa in più, p