Microscopie avanzate

OPTICAL TWEEZERS,

pinzette fatte con la luce. Sono fondamentalmente dei raggi laser che sono in grado di manipolare

piccole molecole e chiaramente spostarle per tratti molto limitati ma anche esercitare delle reazioni.

In questo caso è un pezzo di DNA che è fissato da una parte e viene stirato dall'altra con una luce e

poi ritorna ad essere di nuovo superavvolto. Sono di nuovo sistemi submolecolari che danno l'idea

di cosa succede all'interno di una molecola e di che cosa possiamo fare con un qualcosa che

normalmente ha un'interazione soltanto con la luce, invece in questo caso ci serve per spostare.

Allora otteniamo dei dati come una risoluzione ben diversa rispetto a quello di un'immagine che può

anche dare un'immagine funzionale; di nuovo non siamo a livello di cellule intere come magari

capita in qualche meccanismo più complesso, siamo a livello di proteine isolate, di molecole isolate

quindi almeno in un certo caso non esattamente equiparabili a quello che viene in vivo. Ci sono

meccanismi molecolari ma certamente non tutti, troppo semplificati da un certo punto di vista. Ma

una luce coerente, un laser può fare anche questo, come può modificare delle molecole, accenderle o

spegnerle ecc, si possono fare tante cose con questo tipo di energia concentrata.

Siamo partiti da un sistema che è un po' più complesso del microscopio normale (microscopio a

fluorescenza), l'abbiamo complicato e ci abbiamo aggiunto un sistema di un'analisi del preparato

confocale per arrivare ad utilizzare delle tecniche il cui risultato va come risoluzione ben al di là dei

limiti di risoluzione dei microscopio stesso. Questi microscopi arrivano ad un certo punto, il fatto

che io li rimpiazzi perché sono 190 nanometri per 190 per 500 nanometri in questa sezione ottica

virtuale che ottengo con il microscopio confocale e vorrei che fosse ben chiaro che è quello ottengo

quando lo sto facendo lavorare al massimo delle sue possibilità in condizioni ottimali, se già prendo

una fetta spessa ma colorata allora non arriverò mai a questi limiti. Ma quindi sono i limiti finali a

cui posso arrivare e per andare oltre dovrò usare altre strategie: una l'abbiamo già vista ed è quella

della microscopia elettronica che implica cose differenti (elettroni, strumenti più grossi e diversi e

che diano un risultato in bianco e nero), se vogliamo vedere del colore si passa ad un'altra tecnica di

super risoluzione a cui 3 anni fa hanno dato un nobel. Tuttavia ottenere un segnale può essere fatto

in tanti modi diversi, ottenere il vostro dato: se prendiamo quello che abbiamo visto adesso nel

sistema più semplice possibile vuol dire che prendiamo una molecola di fluorescenza anche non

tanto grossa, l'attacchiamo a qualcosa e andiamo a vedere il segnale, cioè vuol dire una risoluzione

elevatissima perché se il segnale di una è visibile allora ho effettivamente una buona risoluzione.

Ma non è sempre cosi' perché nella realtà le cose sono sempre più complicate. Ce ne sono tanti di

sistemi che implicano che si lavori in maniera differente, uno l'abbiamo già visto ed è

l'IMMUCITOCHIMICA. Per vedere un componente di base possiamo utilizzare diversi metodi: si

va dal western ad enzyme assays, a raggi X, a NMR, a immunocitochimica ecc. ognuno dà il suo

risultato. Nei miglior modi possibili della stessa proteina potreste avere tutti i dati e quindi si sa cosa

fare, dov'è, come e quanto si muove, come viene fatta cristallograficamente e bisogna solo scegliere

la via con cui agire. Se si sceglie la immunocitochimica, che cosa si utilizza per la risoluzione? Le

proteine che di per sé sono piccolissime, hanno un loro volume e questo vi riporta ai livelli di

sporcare la risoluzione che avrete come risoluzione potenziale del vostro strumento: avete 190 ma

se già si inizia a lavorare con delle proteine ci si complica la vita e il 190 non va più bene,

chiaramente sarete legati ad avere qualcosa di diverso come risultato. Buona parte di questi li avete

già visti ma ricordiamo un nome per la storia: Coons il quale ha utilizzato un sistema in grado di

riconoscere pneumococcus con un metodo fluorescente diretto ovvero gli anticorpi. Sapeva che

c'erano anticorpi diretti su pneumococco ed è andato a braccarli, ha fatto un'indagine di questo tipo

inventandosi un nuovo modo: in pratica è stato lui che ha utilizzato qualcosa che possiamo

considerare come un marcatore biologico, un'arma già presente in natura. Ce ne sono pochissime di

questo tipo, uno di queste sono le lectine che vanno a pescare solo un singolo residuo glicosilico.

Avidina e biotina sono considerati sistemi di detenzione perché sono utilizzatissimi poiché hanno un

legame che è tra uno dei più forti che ci siano tra le molecole conosciute, superato soltanto dalla

sptreptavidina (quella dello streptococco) e il loro legame una volta che c'è è praticamente

indissolubile, non solo c'è anche un'avidità mostruosa per questo legame. Quindi se si utilizzano

questi due complessi come qualcosa che possa dare un segnale colorato, avete sicuramente dei

risultati notevolissimi. Sono diffusissime quando si lavora in microscopia ottica se interessa avere

un segnale colorato.

Dove vado a pescare il mio bersaglio? Praticamente dovunque: posso giocare sui nuclei, citoplasma,

le membrane (ovvero siamo quasi certi che pesco qualcosa in superficie), possono esserci proteine

isolate o posso lavorare su fluidi, su qualche cosa che non è solido ma prodotto come la saliva o

fluidi corporei in generale che possono contenere antigeni che posso mettere in evidenza. Di tutti

questi l'unica cosa che mi interessa è un anticorpo e devo avere lo strumento che me lo riconosca, il

che fa si che di tutti questi possibili bersagli io sia costretto a scartarne una bella parte perché per

essere antigenico deve avere un certo peso molecolare. Ci sono anticorpi completamente di sintesi

ma anche altri che sono in grado di avere ulteriori possibilità, per esempio si sa che questi legami di

affinità hanno una certa stabilità ma uno dei sistemi per esempio per puificare un anticorpo, la

cosiddetta purificazione per affinità consiste nel stimolare la produzione policlonale di un coniglio,

prelevare una certa quantità di sangue, isolare il siero in cui all'interno ci sarà un cocktail di

anticorpi diretti contro questo bersaglio perché policlonale. Decido di purificarlo: prendo una

colonna, la saturo con il mio bersaglio (target), faccio passare il cocktail di immunoglobuline che si

legheranno ed io avrò eliminato sia quelle che si legano in modo debole sia l'aspecifico che potrebbe

disturbare, dopo di che prendo la colonna e con un'altra forza ionico eluisco le immunoglobuline

che si sono legate ed ottengo un anticorpo policlonale purificato per affinità, quindi più pulito di

quello che c'è circolante. Con un ma: in colonna va passato il siero e noi perdiamo l'aspecifico in

circolo e anche le immunoglobuline dirette contro il mio target ma a bassa avidità, in compenso

quando le proteine sono attaccate e devo staccarle perché mi servono, quelle ad altissima avidità

non si staccano più. C'è una bella variabilità di legame e di affinità il che vuol dire che riesco a

toglierne un po', la maggior parte riesco a salvarle e in compenso le altre saranno sicuramente perse.

I legami quindi sono variabili e questo mi condizionerà un po' sempre, sono strumenti biologici che

posso controllare fino ad un certo punto. Ci sono sistemi biologici particolari in cui ci sono dei

sistemi di supporto secondari: hanno provato ad utilizzare immunoglobuline, cioè anticorpi di un po'

di tutte le specie possibili (il pollo ha delle immunoglobuline cosiddette Y), i costi variano a

seconda dell'animale utilizzato (i secondari costano molto meno) e quelle di pollo per esempio non

sono costosissime. Per formare quelle di pollo basta prendere il nitrato di argento e dopo 15 giorni il

pollo ha sviluppato anticorpi contro la fibrillarina che è una molecola presente soltanto all'interno

dei nuclei, non serve fare il prelievo di sangue ma basta prendere l'uovo. Serve il tuorlo e vengono

fatte precipitare le proteine ed eliminati i lipidi del fenolo e successivamente fatti un paio di lavaggi.

È un sistema formidabile e sono immunoglobuline che hanno una durata lunghissima ed avidità

enorme. Ce ne sono tante e hanno scoperto che il lama ha degli anticorpi particolarissimi: sono

normalmente delle immunoglobuline con la forma di Y rovesciata e poi hanno una serie più rara di

anticorpi definiti secondari che sono a bastoncello ed hanno un solo sito variabile il quale una volta

che si attacca non si stacca più. Questi anticorpi costano tantissimo e se abbiamo una proteina

magari difficile deve essere misurata e precipitata, a quel punto non si riesce più a staccarla.

Ci sono anticorpi in giro di tutti i tipi possibile e immaginabili ed in fondo è la modulazione di uno

strumento biologico e tutto questo per dire che avete in mano uno strumento validissimo ma può

anche attaccarsi e staccarsi, può essere in una condizione di equilibrio, tutto questo è una cosa in cui

noi al momento che l'applichiamo può essere un fattore molto importante.

Vengono applicate per cellule che stanno replicando e una delle cose che possono essere utilizzate

sono dei target del tutto artificiali. Come si fa a sapere se una cellula sta replicando? Il metodo più

utilizzato e anche il primo, al di fuori di avere un'autopsia per vedere una metafase, è difficile

perchè la cellula in fase S ha l'aspetto di una cellula in interfase, non si vede molto la differenza,

allora si può marcarla. Uno dei sistemi fondamentali che c'è stato era quello di fornire alla cellula un

precursore in modo da marcare il DNA che si stava replicando utilizzando una base azotata o magari

che non c'era nel RNA così si toglieva di mezzo come la timidina triziata (con un atomo radioattvo)

che veniva incorporata solo nel DNA di nuova sintesi e di conseguenza solo le cellule in divisione

contenevano del DNA radioattivo perché contenevano del trizio che è un isotopo dell'idrogeno.

Dopo di che si andava a vedere quali erano le cellule marcate e quali no. È un metodo lungo e

difficile ma molto preciso sotto certi aspetti.

Dopo vengono utilizzate altre molecole che la cellula può incorporare al posto della timidina e così

fu sintetizzata la bromodesossiuridina che inganna le cellule e viene captata e utilizzata per la sintesi

del DNA: in pratica la cellula la adopera solo in fase di replicazione, in realtà la utilizza anche in

fase di riparo di DNA ma il mar