Microscopie avanzate

5/10/2016

MICROSCOPIE AVANZATE

Le cellule a meno che non contengano esse stesse dei pigmenti sono trasparenti, e molte

delle sostanze che riteniamo noi abbiano un colore di per sé, ad esempio il DNA, se

prendiamo un boccettino di DNA, un campione, vediamo che è bianco, al limite giallastro, è

importante quindi coloranti che venivano essenzialmente

lo sviluppo dei coloranti,

dall’industria tessile, ma erano nei colori limitati (alcuni di origine resinale altri di origine

animale) color rosso, nero, zafferano (ottenuto per sovrasaturazione di marrone o viola),

indaco, al massimo verde…

Questo fino a quando nell’800 c’è stato un inglese chimico, che voleva in effetti lavorare su

sostanze che potessero avere un'azione funghicida (all'epoca considerata antibatterica) e

allora è partito con la distillazione di residui che costavano poco, ad esempio derivati del

catrame o residui dal catrame, e ha cominciato a distallarli per vedere se riusciva ad ottenere

qualche sostanza particolare, ma ha visto che come funghicida questa sostanza è stata un

disastro però in compenso è riuscita ad isolare per esempio questa sostanza che lui ha

chiamato “Mauveine” (da mauve, malva) e questo ha avuto importanza per un suo amico

che aveva una fabbrica di tessuti, e quando l'ha vista è stato amore a prima vista, perché

poteva ottenere dei pezzi colorati, allora ha poi deciso di provare a venderli e le signore dell’

epoca sono letteralmente impazzite perché questo colore non esisteva, non c'era prima, non

a tal punto che in Inghilterra c’è stato un intero decennio, il

si trovava, era la novità, novità

“Decade proprio perché tutte le signore che potevano permetterselo vestivano di

Mauve”,

questo colore a Londra.

Questo chimico poi ha continuato nelle distillazioni e ha ottenuto un po' tutta la serie di

coloranti, che erano sì stati stabilizzati per l'uso sulla stoffa, ma potevano essere utilizzati

per tutta una serie di altre cose, per esempio all'epoca sono stati prodotti di questi coloranti a

basso prezzo che pittori più squattrinati potevano comprarsi, e tra questi per esempio c'era

anche Van Gogh: in uno dei suoi quadri Van Gogh aveva lasciato la strada come

incompiuta, ma successivamente è stato ritrovato un libretto in cui si diceva che la strada

doveva essere di colore rosa, ma il rosa sul quadro non c'era più, e questo perché era stato

utilizzato uno dei colori di nuova sintesi che non resisteva alla luce, questo colore era

l'eosina, che noi oggi usiamo naturalmente per colorare delle sezioni, ma non è stabile, a

luce prolungata se ne va e praticamente non lascia tracce, allora a quel punto quando hanno

scoperto che quella strada era effettivamente rosa hanno esaminato tracce di eosina con il

bromo (perché è un componente brominato) e hanno visto che effettivamente il colorante

(l’eosina) e se n'era andato.

era quello

A cellule molto grosse noi arriviamo anche con l'occhio nudo, mentre dopodiché noi

abbiamo bisogno di un supporto: questo supporto può essere microscopio elettronico, che ci

permette di arrivare fino a piccole parti della cellula, ma se noi dobbiamo guardare virus o

atomi allora ci vuole un altro tipo di strumento che è il microscopio ottico, che comunque ha

un limite.

Quello che ci interessa dunque è il che ci permette di vedere due punti

limite di risoluzione,

distinti per capirci qualche cosa utilizzando un mezzo che abbiamo a disposizione: questo

non vuol dire che noi siamo costretti ad utilizzare tutte le volte il massimo possibile

utilizzare al microscopio ottico per dire "sì allora si utilizza il microscopio ottico che è più

semplice, dopodiché se si avranno altre necessità si provvederà ad utilizzare altri strumenti"

(ad esempio immagini di un endotelio, che è spesso, con microscopio confocale, danno lo

stesso risultato che con microscopio a fluorescenza, quindi bisogna fare quel che serve)

Da tenere a mente: 1A°= 0,1 vm non 10 vm!

Ad esempio: polispermia, uovo di anfibio, l’uovo è visibile ad occhio nudo, ma non lo sono

gli spermatozoi, allora a questo punto la visione sarebbe parziale, passando a un

microscopio a scansione (anche alla minima potenza) vediamo che la situazione è più

complicata e c’è un processo biologico in atto.

In base a quello che vediamo possiamo avere delle informazioni riguardo alla struttura e alla

funzione di quel che vediamo, ma è importante che quel che vediamo noi è preparato per la

microscopia elettronica (o altro), che il preparato è il più vicino possibile alla realtà, e qui

cominciano le grane perché in alcuni casi il preparato è facile e non c'è bisogno di fare

niente (come per esempio una goccia di sangue su un vetrino, strisciata, otteniamo un

preparato che ha un monostrato di cellule in cui non si viene a creare quasi nessun artefatto,

e vediamo i tipi di cellule diverse tra di loro morfologicamente) ma se dobbiamo analizzare

altre cose cominciamo ad avere dei problemi perché quello che noi vediamo essenzialmente

è un tessuto (o cellule) che deve essere messo in condizione di essere analizzato e di essere

visto, e allora in pratica dobbiamo farlo attraversare dalla il che vuol dire che la nostra

luce,

struttura deve essere sezionata, deve essere talmente sottile, da poter essere attraversata

dalla luce, e se io l'ho colorata allora deve potermi dare un'immagine, un'immagine non

solo di morfologia (il nostro è un mondo 3D ma noi dobbiamo ragionare in 2D, inoltre

ragionando sul contrasto noi vediamo la luce riflessa, perché la luce incide e poi ritorna, con

determinate lunghezze d'onda più o meno assorbite) noi vediamo un in

contrasto di colore,

condizioni normali distinguiamo il mondo essenzialmente per i colori (mentre al buio

distinguiamo per il contrasto luce/buio), allora noi sull'immagine 2D dobbiamo dare colore

altrimenti la luce attraversa un preparato che non ci aiuta molto… però comunque noi prima

dobbiamo sezionare il campione, perché dobbiamo utilizzare i microscopi.

Ci sono stati tanti tipi di il parte dall'evidenza che una

microscopio: primo microscopio

biglia nella zona centrale ingrandisce, allora se posta al centro di una placca di metallo e

attraverso un ago per infilare il nostro oggetto, e se dall'altra parte c'era la luce, poteva avere

qualcosa di un po' ingrandito, poteva però osservare solo quello che trovava già di per sè

sottile, ad esempio buccia di cipolla o ali di farfalla, cose che sono talmente sottili da poter

attraversate dalla luce, e che hanno un pigmento, altrimenti non si capisce niente…

essere

Poi successivamente c'è stato qualcuno che ha pensato anche a sezionare, il ragionamento di

è partito da che a un certo punto ha avuto

come ottenere una sezione Leonardo Da Vinci,

interesse per l'occhio e a iniziato a studiare occhio che però con l'umor

l'occhio di bue,

vitreo era qualcosa che non si poteva sezionare, allora cosa ha fatto, ne ha fatto una

inclusione con i mezzi dell'epoca, ossia con l'albume, e facendolo indurire in questo mondo

questo modo poteva sezionarlo dopo.

Ma si potevano sezionare molte cose, ad esempio ha sezionato il

Robert Hooke sughero,

che era abbastanza duro da poter essere sezionato (perché il punto fondamentale è che si può

sezionare un oggetto il più vicino alla realtà, e sottile, se duro). Proprio Hooke ha definito le

zone del sughero come “piccole celle” vicine le une alle altre, e quindi ha dato il nome alle

cellule, nel sughero: è arrivato poi a definirne anche la struttura esterna.

Il è pressione esercitata in modo concentrato in unico punto, e quindi enormemente

taglio

aumentata: è importante che non comporti alterazioni, artefratti nel preparato, che quindi è

bene sia duro, ma elastico (così che con il taglio sia il meno danneggiato possibile).

Tutti i microscopi avevano in comune una cosa: la era la luce

sorgente di illuminazione

esterna, o la candela, e tutto questo comporta che o si lavora di giorno, o se si lavora di sera

i colori non sono quelli veri (perché la luce della candela per esempio non ha la stessa

tonalità di blu della luce del giorno) e quindi ci sono tutta una serie di errori dovuti alla

fonte di illuminazione.

Inoltre si sono sviluppati due e non solo uno, perché gli occhi sono due e si riesce a

oculari,

vedere meglio con entrambi, ovviamente.

Una delle cose che sono evolute enormemente e stanno ancora evolvendo enormemente è la

tecnica delle qualsiasi tipo di lente è in fondo un pezzo di cristallo che è modulato in

lenti:

modo da ingrandire, la tecnica ha dovuto evolvere per riuscire a dare un campo rotondo sul

vetrino uniforme, una qualità di immagine che è la stessa al centro e anche alla periferia,

senza aberrazioni (ad esempio un reticolato di linee parallele che alla periferia diventano

"cuscinetto" e si allargano, aberrazioni sferiche che alterano la vista del preparato,

astigmatismi, o realtà falsa), il preparato è visto in piano, l’immagine è buona in qualsiasi

piano.

La luce deve essere quanto più coerente possibile e stabile (quella del sole lo è, quella della

candela un po' meno): quello che si può fare è che sul vetrino, sul portacampione, la luce

arrivi tutta coerente, e che il fascio abbia la stessa intensità alla periferia e al centro, e viene

fatto da una serie di lenti che si chiamano che prendono il fascio di luce più

condensatori,

grande e lo condensano in uno più piccolo e coerente (l’unico fascio di luce coerente in

natura sempre è il laser, tutte le altre luci vanno corrette, e per questo esistono altre lenti, dei

e una zona del vetrino che è illuminata in modo coerente e sufficientemente

diaframmi,

forte).

Dopodiché c’è la formazione di una cosa fondamentale, ossia la luce che entra tocca la

sezione e quindi quando esce dal vetrino porta con sè l'immagine, che a questo punto però è

0 volte, ma i microscopi servono ad ingrandire, ma ingrandiscono l’immagine

ingrandita di

che viene dal passaggio della luce attraverso il campione, la luce appena uscita è immagine

ed è grossa quanto l’immagine uscita dal vetrino, perché è l’obiettivo che ingrandisce: è

l’obiettivo la vera propria lente di ingrandimento, fatta da una serie di lenti in realtà che

portano fino a un normalmente in un microscopio ottico un

limite di ingrandimento,

classico “Revolver” in sequenza va 2, 4, 10, 40, fino a 100x che è il massimo che si utilizza,

e non può lavorare con una distanza di aria ma deve essere immerso in olio che definisce il

minimo di diffrazione possibile, dopodichè l’immagine arriva all’oculare e viene ingrandita

l’ingrandimento

perché anche l’oculare è una lente, quindi è dato

finale

dall’ingrandimento dell’obiettivo moltiplicato per quello dell’oculare che vale praticamente

10x (ne esistono anche da 20x ma praticamente non li usa nessuno), e come risultato si

ottiene il massimo ingrandimento in quanto immagine di 1000, ovvero 100x10=1000 volte

immagine ingrandita del vetrino del preparato, che può poi eventualmente ulteriormente

essere ingrandita ma digitalmente.

Ma qui iniziano i problemi perché un’immagine ingrandità continuerà a aumentare di

risoluzione fino a quando non avrà aggiunto la sua risoluzione, ogni immagine ha un limite

di risoluzione, non si può aggiungere risoluzione è quello che è che.

La è la distanza minima a cui si possono ottenere due punti separati, visibili

risoluzione

chiaramente.

Risoluzione e contrasto sono in qualche modo intercorrelati, hanno un certo valore assieme,

mentre risoluzione e ingrandimento no, sono due cose diverse.

Il "gioco" delle lenti permette che ci sia sul vetrino del preparato un fascio di luce

assolutamente coerente, e a questo punto bisogna avere un preparato che sia visibile sul

preparato solido: il passaggio da 3D a 2D porta un sacco di problemi, e non ultimo dei quali

quello dell'interpretazione dell'immagine, perché è facilissimo ogni volta che abbiamo

un'immagine bidimensionale sbagliarsi e non interpretarla correttamente, il nostro cervello

fa dei giochi strani (ad esempio dati tre punti è facile che nostro cervello dica che sono in

fila, oppure che non sono in fila, il nostro cervello cerca di ragionare in questo senso) e lo

stesso vale per le immagini in 3D, su qualche tessuto solido si può lavorare in questo senso

(ad esempio sull'osso, che é compatto e solido, possiamo limarlo fino a diventare traslucido

e a questo punto ottenere un'immagine che però riusciamo a vedere con 20x 40x e non oltre,

perché i dettagli sono comunque annegati in una laminetta di osso che nel migliore dei casi

é 30 micron di spessore, non riesco a farlo più sottile perché si tratta proprio di una limatura,

e allora devo ricorrere altre metodiche) in pratica devo incominciare a preoccuparmi di

vedere la mia realtà il più vicino possibile a quello che é, devo giocare con una serie di

tecniche di preparazione che mi permettono di avere un preparato decente e ripetibile, e in

pratica se devo fare una sezione dobbiamo ottenere da un tessuto che tendenzialmente è

molle, qualcosa che sia duro, ma elastico, e per fare questo dobbiamo da subito "toglierci di

mezzo i problemi che abbiamo".

Ad esempio, abbiamo un campione biologico come è una biopsia epatica, cioè un pezzettino

di fegato, il primo problema che si presenta dal momento del prelievo è il deterioramento,

noi prendiamo un gruppo di cellule e le isoliamo dal loro ambiente e viene a mancare

l'ossigeno, ma soprattutto nell'arco di secondi viene a mancare l'acqua, le cellule vanno

incontro a perché le cellule vengono spostate da un ambiente umido-bagnato

disidratazione

all'aria, quando le cellule si trattano tendono ad asciugarsi e si seccano e allora la biopsia si

danneggia e si vanno a sommare altri danni all' ipossia e la carenza di acqua già presenti che

vendono irreparabile la situazione.

Quindi successivamente dopo il prelievo si interviene con una soluzione fissativa come la

formalina.

Esiste una di tipo fisico (agisce sull'acqua) e una fissazione di tipo chimico (può

fissazione

essere sull'acqua ma in genere agisce su altri componenti, si tratta praticamente di agenti che

noi diamo al tessuto e possono agire in tanti modi diversi, dipende sempre anche dal tipo di

microscopia che stiamo facendo perché ad esempio quello che può andar bene per la

microscopia ottica può andare bene anche per la microscopia elettronica ma può anche

andare malissimo, ad esempio la formalina può andare bene per certe cose ma la fissazione

alcolica che agisce tramite alcol é devastante per certi casi perché disidrata violentemente

così come fanno anche per esempio acido acetico e acido cloridrico o miscele di aldeidi (tra

cui la formalina in primis) che agiscono essenzialmente sul gruppo NH2 delle proteine, poi

legano anche in parte anche acidi nucleici altre sostanze ma essenzialmente il target è

proteico)

Formalina è una soluzione che viene venduta liquida in genere ma in realtà è la soluzione di

formaldeide con un po' di metanolo per stabilizzarla, mentre la formaldeide esiste ma non è

liquida, è in forma solida, e si chiama paraformaldeide, quindi per diventare liquida in

soluzione deve essere scaldato, non contiene metanolo, ma non si può tenere per giorni

(preparato può essere utilizzato con acqua per un periodo di tempo limitato).

Quindi una volta stabilizzato il preparato non basta fissarlo, perché il fine è quello di

indurire il tessuto in modo che si possa sezionare, e per essere sezionabile bisogna

fondamentalmente che l'acqua venga sostituita da qualcosa che ne faccia una sorta di

"scheletro stabile" qualunque sia questa sostanza, in genere paraffina, resine, vanno

benissimo, sono quasi tutte non miscibili con l'acqua e ci permettono quindi di disidratare

progressivamente il nostro campione, questo fa sì che l'intera struttura sia talmente stabile

che noi passiamo sezionare praticamente senza problemi utilizzando degli strumenti che si

chiamano ce ne sono a mano e elettrici, tanti tipi a seconda del tipo di sezione

microtomi,

che vogliamo fare noi, e sono oggetti in cui attraverso una lama spessissima di metallo

possono tagliare sezioni fino a fino al massimo a 3-5 micron, di solito 10 micron.

Questo vuol dire che noi abbiamo una sezione di 5 micron spessa, presa del tutto a caso

nella biopsia di fegato da cui siamo partiti, ma un nucleo di un epatocita è tranquillamente

10 micron di diametro, quindi vuol dire che se tutto va bene non ne abbiamo preso fino alla

metà, noi vediamo non soltanto una parte del tessuto ma soltanto una parte della cellula e

non necessariamente nella zona equatoriale della cellula, ma per esempio in una calotta del

nucleo, perché noi siamo andati a caso e abbiamo ridotto brutalmente il nostro tessuto in un

qualcosa di molto sottile di cui noi abbiamo solo una parte, quindi ovviamente conviene

avere più sezioni, però quello che abbiamo è così sottile che noi possiamo colorarlo, e

possiamo vederlo, le nostre sezioni quindi ci danno un'immagine che è ingrandita, che noi

possiamo vedere (se non coloriamo le cellule in coltura non sono visibili, solo colorando

possiamo avere delle informazioni in più e passiamo a capire qualcosa in più, p