Microbiologia, prof. Branduardi

Tecniche di Typing

1. Estrazione DNA

2. Analisi degli spazi intergenici che non sono codificanti, qui le mutazioni sono libere di accumularsi

3. PCR di quei tratti con primer costruiti sulle sequenze conservate

4. Elettroforesi

5. Confronto per distinguere ceppi diversi

Tutte queste tecniche di Typing non prevedono il sequenziamento del genoma batterico. ARDRA e AFLP richiedono l'utilizzo di enzimi di restrizione. RAPD e ARISA utilizzano primer random e noti per l'amplificazione. Queste tecniche hanno però perso di importanza con le nuove tecnologie; sono utilizzate solo per lo screening ad ampio raggio su numerosi isolati. Successivamente si può decidere di procedere col sequenziamento genomico solo di determinati gruppi individuati.

Analisi di comunità

La struttura di una comunità è la proporzione percentuale delle diverse popolazioni che compongono la comunità. Una popolazione è un insieme di microrganismi che condividono determinate caratteristiche.

Con questo tipo di analisi non c'è bisogno di coltivare i microrganismi. In una comunità si evidenzia il metagenoma: insieme dei genomi dei vari microrganismi che compongono la comunità. Analisi di comunità si intende caratterizzare l'abbondanza relativa di ciascuna popolazione che compare nella comunità, confrontando le sequenze con un database esterno si identificano i vari ranghi tassonomici. Una sequenza nuova tuttavia non è identificabile. La principale tecnica di sequenziamento di prima generazione è: Tecnica Sanger: utilizza i ddNTP, nucleotidi mancanti del gruppo -OH 3', che fanno terminare la polimerizzazione del segmento. Si determina la posizione di ciascun nucleotide a seconda di dove il ddNTP si è inserito e ha fermato la sintesi del filamento. Utilizzando quattro diverse provette si inserisce in ognuna lo stesso segmento da sequenziare e in ogni provetta è aggiunto un ddNTP diverso, mentre gli altri.

I nucleotidi restano normali. I vari frammenti sono poi fatti distanziare da elettroforesi e il computer conta le basi una per volta. Questa tecnica prevede il clonaggio in vivo per la separazione dei diversi segmenti, con questa tecnica inoltre non è possibile analizzare un metagenoma.

Oggi si usano tecniche più avanzate per poter analizzare contemporaneamente frammenti diversi, ciascun frammento viene separato dagli altri e poi sequenziato permettendo di analizzare un DNA metagenomico.

Le tecniche di seconda generazione sono:

• Pirosequenziamento: si utilizza la normale PCR per ciascuna base. Quando la base si attacca esce un gruppo fosfato che viene usato da un enzima per produrre ATP. Questa ATP viene usata dalla luciferasi per produrre un flash luminoso.
• Illumina
• Ion-Torrent

Le tecniche di terza generazione sono:

• SMR-Sequencing
• Nanopore: il campione si carica su una cartuccia monouso che poi viene inserita nel pc. In funzione della base che attraversa il poro

c'è un diverso segnale elettrico.

Distanza genetica: Sistema autoconsistente che riunisce sequenze che si assomigliano per almeno il 97%. Si ottengono quindi gruppi di sequenza senza che gli si attribuisca un nome. A differenza della classificazione, non avendo la necessità di un database precostituito, è possibile incasellare tutte le sequenze in determinate slot. Si utilizza poi la tecnica OTU(Operational Taxonomic Unit) per cui in base all'OTU utilizzato differenziamo i gruppi nei diversi ranghi tassonomici.

Per quantificare i microrganismi di una comunità si usano principalmente due tecniche:

FISH (Fluorescent in-situ hybridisation): Le molecole target sono o il 16s rRNA o il 32s rRNA; il target è il ribosoma e non il gene che lo codifica. Si utilizzano fluorocromi per visualizzare il numero di batteri che presentano questi rRNA. I fluorocromi sono contenuti in sonde oligonucleotidiche opportunamente disegnate per bersagliare una gamma di

batteri predefinita. L'ibridazione con questa sonda avviene a circa 46°C, successivamente si può passare alla visualizzazione al microscopio. I vantaggi di questa tecnica sono che si può determinare il numero assoluto di cellule, non necessita di colture pure, è una tecnica non distruttiva e permette una visualizzazione spaziale dei batteri. Gli svantaggi sono che bisogna decidere a priori che tipo di batteri bersagliare con le sonde e che i ribosomi devono essere molti per poter dare una fluorescenza visibile. Quantitative Real Time PCR: serve a quantificare il numero di copie di un gene presenti in un campione e qualsiasi gene può essere utilizzato. Tramite speciali termociclatori si può seguire in diretta il numero delle copie generate durante la PCR. Un input luminoso è proporzionale al numero di copie del frammento amplificato. SYBR Green: è un intercalante del DNA che quando si lega emette fluorescenza. Quando il doppiofilamento si forma si ha la fluorescenza poiché in fase di estensione il SYBR Green inizia ad intercalarsi.

Più è intensa la luminosità e più copie si sono formate di quel gene. La fluorescenza ottenuta tuttaviaè aspecifica perché non distingue amplificati diversi ma si intercala in maniera generale.

Taq Man: utilizza una sonda interna oligonucleotidica con fluorocromo e un “quencer” che riduce la fluorescenza quando è vicino alla sonda. In fase di estensione il fluorocromo viene perso e può dare fluorescenza che viene rilevata da un lettore. Il vantaggio rispetto al SYBR Green è che la fluorescenza è dovuta solo al frammento specifico poiché la sonda è costruita ad hoc.

Con tante copie del template le curve di amplificazione si alzano prima. Se abbiamo pochi frammenti il ciclo critico avviene più tardi. All’inizio i frammenti polimerizzati sono ancora incompleti e solo dopo

circa tre cicli si iniziano ad avere i primi frammenti utili. Per individuare l'attività della comunità il target si sposta sul mRNA poiché si forma solo in cellule attive. Si fa la PCR quantitativa in retrotrascrizione producendo cDNA a partire dal mRNA. Si analizza poi il cDNA. La metagenomica permette di sequenziare tutto il genoma del campione ambientale. Questa disciplina nasce con Craig Venter nel 2004 attraverso la pubblicazione di due articoli su Science e Nature. Dopo aver estratto il DNA e purificato si può passare al sequenziamento di ogni gene oppure alla ricostruzione dei singoli genomi. Alternativamente si possono isolare i singoli batteri e sequenziarne il DNA. Cicli Biogeochimici Carbonio: ci sono due grossi bacini in cui la CO2 è fissata: la terra e l'oceano. Le piante sono i fissatori terrestri e si equivalgono con i fissatori microbici oceanici. La fissazione è prevalentemente svolta tramite la fotosintesi.

carbonioterrestre segue un ciclo abbastanza lineare che connette piante -> animali -> microrganismi. Negli oceani invece lacatena trofica è meno lineare e si evidenzia il Microbial Loop: il carbonio viene fissato dal fitoplancton e risale lacatena fino ai predatori per poi essere rilasciato come scarti. I microrganismi eterotrofi possono riciclare questo pooldi carbonio per riconvertirlo a CO₂. Qui nei fondali la sua fissazione è minima a causa dell’assenza di luce.

In condizioni ossiche avvengono:

• Respirazione ossigenica (degrada zuccheri a CO₂)
• Fotosintesi (produce zuccheri da CO₂)
• Chemiolitotrofia (produce zuccheri da CO₂)
• Metanotrofia

In condizione anossiche avvengono:

• Respirazione anossigenica (degrada zuccheri a CO₂)
• Fermentazione (degrada zuccheri a CO₂)
• Fototrofia anossigenica (produce zuccheri da CO₂)
• Metanogenesi

La metanotrofia è il principale antagonista della metanogenesi:

Ox: CH₄ + 2O₂ -> CO₂ + H₂O

-Anox: CH + SO + H -> CO + HS + 2H O 4 2 2E si accoppiano con la produzione di NADH e ATP. La metanotrofia anossigenica è fatta attraverso l’azionecombinata di batteri SRB e Archea che fanno metanogenesi inversa. Tra le due popolazione si instaura unoscambio di protoni ed elettroni.

-La degradazione della sostanza organica complessa ha un andamento lineare: Polimeri -> Monomeri -> CH COO , CO ,3 2H -> CO , CH2 2 4L’aumento di CO porta al riscaldamento globale e inoltre anche il metano è un gas serra, tuttavia è usato solo in2condizioni molto riduttive e il suo metabolismo è di nicchia. L’ossidazione anossica del metano avviene sempremediante una solfato-riduzione con produzione di CO , acqua e composti ridotti dello zolfo. La CO nell’atmosfera è2 2dovuta sia ad attività biologiche che dal consumo antropico dei combustibili fossili. I composti idrati del metano siformano ad alte pressioni e basse

temperature nei fondali marini; questo metano rappresenta uno spot di biodiversità delle profondità marine. I Cold Seeps e le fumarole sono gli unici ambienti oceanici, ricchi di metano e solforati, che ospitano microrganismi autotrofi. L'aumento della temperatura media delle acque favorisce la stratificazione termica riducendo il trasferimento di nutrienti verso le acque sotterranee e ciò comporta la riduzione dei microrganismi autotrofi delle profondità. L'aumento di CO2, che non viene consumata, acidifica gli oceani destabilizzando l'equilibrio dei carbonati nell'acqua. La stratificazione termica comporta anche l'allargamento delle zone a bassa concentrazione di ossigeno. Legge del minimo di Liebig: Afferma che la crescita è controllata non dall'ammontare totale delle risorse naturali disponibili, ma dalla disponibilità di quella più scarsa. Azoto: il suo ciclo si divide tra ambienti ossici e anossici.

processi di ossidazione (nitrificazione) avvengono in ambienti ossici grazie a microrganismi autotrofi

2- 3-Ossidazione (ambiente ox): NH₄⁺ -> NO₂^- -> NO^2-

3- 2-Riduzione (ambiente anox): NO^2- -> (N₂O, NO) -> NO -> N₂ -> NH₃

La riduzione assimilativa è ubiquitario e quando questi organismi muoiono avviene il processo diammonificazione dell'ambiente in cui l'ammoniaca viene immessa nuovamente in circolazione.

Il nitrato può essere ridotto (denitrificazione) in condizioni prettamente anossiche attraverso delle respirazioni anossigeniche.

In condizioni anossiche avviene anche Annamox: NH₃ -> N₂

Thricodesmum (cianobatterio) e altri proteobatteri sono azoto fissatori e sono organismi colonizzatori di ambienti oligotrofici.

L'impatto antropico sul ciclo dell'azoto è determinato principalmente dalle attività agricole di fertilizzazione. Il ripristino del pool di azoto del terreno per la agricoltura porta allo

sbilanciamento del ciclo poiché nei pr