Microbiologia, prof. Branduardi

Microbiologia anno accademico 2017-2018

Storia della microbiologia

1600: Janssen inventa il primo microscopio.

XVII sec: Hooke utilizza il microscopio per pubblicare studi sulle muffe; grazie ai suoi studi sul sughero si è coniato il termine cellula. Purkinje ipotizza una prima teoria cellulare.

1676: Van Leeuwenhoek studia i primi batteri.

1688: Redi lavora per confutare la generazione spontanea della vita.

1770: Spallanzani pubblica una prima procedura di sterilizzazione.

1798: Jenner sviluppa il vaccino contro il vaiolo.

1864: Pasteur confuta definitivamente la teoria della generazione spontanea grazie a un esperimento che prevedeva l'utilizzo di una beuta col collo "a cigno": il liquido di coltura sterilizzato ed inserito in questa speciale beuta restava inalterato a lungo poiché i microrganismi restano intrappolati nel collo. Se il liquido veniva spinto fino all’apertura e successivamente fatto riposare, veniva attaccato da agenti esterni. Pasteur condusse inoltre studi sulla fermentazione scoprendo che essa è causata da microrganismi e non da proprietà inorganiche della materia.

1867: Lister introduce la sterilizzazione degli strumenti chirurgici.

Tyndall e Cohn scoprono le spore batteriche e mettono a punto la Tindallizzazione: un processo di trattamento antimicrobico.

Koch sviluppa i suoi postulati scoprendo così l'eziologia di molte malattie, è considerato il padre della microbiologia medica.

1884: Gram mette a punto la colorazione omonima.

Winograndski introduce i concetti di autotrofia e chemiolitotrofia.

Kluyver compie importanti studi biochimici sui metabolismi.

1929: Fleming scopre la penicillina.

1946: Tatum studia la coniugazione batterica.

1960: Jacub e Monod elaborano un modello di regolazione genica.

1967: Woese introduce il dominio degli Archea.

1981: Pusiner isola il primo prione.

1985: Mullis mette a punto la PCR.

1995: Venter sequenzia il genoma di Haemophilus influenzae.

Postulati di Koch

• Il sospetto patogeno deve trovarsi in tutti gli organismi malati e mai nei casi di sanità.
• Il patogeno deve essere isolato e coltivato come cultura pura.
• Cellule prelevate da tale cultura devono indurre la malattia in un individuo sano.
• Il patogeno deve essere nuovamente isolabile dall'individuo in cui è stata indotta la malattia.

Origine della vita

La Terra ha 4.6 miliardi di anni e la sua atmosfera inizialmente era priva di ossigeno. Ci sono voluti circa un miliardo di anni prima di trovare le testimonianze di vita (3.5 miliardi di anni fa). Le prime evidenze di vita microbica sono le stromatoliti, formazioni composte da sedimenti intrappolati da microrganismi, risalenti a 3.5 miliardi di anni fa.

Inizialmente l'atmosfera era riducente (ricca di Fe²⁺, NH₃, H₂, H₂S). 3.2 miliardi di anni fa inizia la produzione di ossigeno da parte dei cianobatteri e, dopo una prima fase di consumo che originò le BIF (Banded Iron Formation) tramite reazioni dell'ossigeno con ioni ferro, iniziò il suo accumulo nell'atmosfera. 2.5 miliardi di anni fa ci fu il Great Oxydation Event in cui l'atmosfera passò da riducente a ossidante. Il primo eucariote comparve circa 2.1 miliardi di anni fa e il primo pluricellulare 1 miliardo di anni fa (un'alga rossa), questa comparsa è circa coincidente con il raggiungimento dell'odierno livello di ossigeno in atmosfera (21%) raggiunto circa 900-800 milioni di anni fa.

Teoria sull'origine della vita

• Formazione spontanea da molecole inorganiche: Elaborata da Haldane e Oparin nel 1920, questa teoria afferma che la combinazione di gas riducenti ed energia termica, elettrica e luce abbiano favorito la formazione di composti organici. Questa teoria è sostenuta dall'esperimento di Urey-Miller del 1950 sulla formazione di biomolecole. I monomeri possono essersi formati nel brodo primordiale e la loro polimerizzazione è avvenuta successivamente su superfici esposte limacciose come argilla, basalti e piriti. Molecole organiche sono anche state trovate su resti di asteroidi; non è quindi da escludere la possibilità di un contributo extraterrestre alla formazione di biomolecole.
• RNA World: Sviluppata da Gilbert, Woese e Rich nella seconda metà del 1900. Questa teoria prevede che l'RNA fosse alla base della vita per via della sua doppia natura di molecola enzimatica ed informazionale. Si sono sviluppate molecole di RNA autoreplicanti che si sono poi riunite in micelle lipidiche dette coacervati: essi hanno la possibilità di gemmare spontaneamente dopo aver raggiunto una determinata grandezza. Successivamente le proteine avrebbero assunto il ruolo enzimatico e il DNA il ruolo informazionale con l'RNA come molecola di connessione. I primi ribonucleotidi si sono formati per sintesi prebiotica con una successiva oligomerizzazione casuale, il loro ingresso nelle cellule è tuttora sconosciuto.
• Era del solfuro di ferro: Di Russel, Hall e Martin a fine 1900. Questa teoria prevede l'accoppiamento di due reazioni: FeS+H₂S → FeS₂+H₂+2e unita a 4CO₂+7FeS+7H₂S → (CH₃COOH)₂+FeS₂+H₂O. Queste reazioni sono poi accoppiate ad una primitiva idrogenasi e ATPsintasi. L'ambiente adatto a questo tipo di reazioni si trova attorno ai vulcani sottomarini dove tuttora sono presenti ecosistemi con solfobatteri.

Si pensa a una successione di ere che hanno portato alla nascita della vita sulla terra, la sequenza è:

• Era geochimica: di accumulo di biomolecole
• Era prebiotica: reazioni chimiche spontanee
• Era RNA
• Era DNA

Gli orologi molecolari sono molecole che possiedono sequenze confrontabili attraverso il tasso di mutazione che è noto sotto forma di % di mutazione ogni x milioni di anni. La differenza % di due orologi molecolari indica anche i milioni di anni trascorsi dopo la loro divisione da un "antenato comune".

La cellula procariote

Mediamente una cellula procariote non supera i 10μm di lunghezza: E.coli ha una dimensione di 3μm fino a Oscillatoria sp. che raggiunge i 50μm. La forma delle cellule procariotiche è un buon criterio di classificazione e si distinguono diverse forme: cocchi, bastoncelli, spirilli, spirochete, batteri filamentosi, batteri peduncolati con appendici e bifidobatteri. Cocchi e bacilli sono spesso associati a formare: diplococchi, tetradi (2x2), sarcine (2x2x2), stafilococchi, streptococchi e streptobacilli. Arthrobacter è caratterizzato da polimorfismo associato ai vari stadi di crescita.

Colorazione di Gram

Nel 1884 Christian Gram sviluppò questa tecnica che permise di distinguere quelli che oggi sono chiamati batteri g+ e g-.

1. Colorazione delle cellule con cristal-violetto di genziana.
2. Fissazione del colorante con iodio.
3. Lavaggio con etanolo; solo i batteri g- vengono sbiancati.
4. Colorazione con safranina; permette di colorare i g- diversamente dai g+.

Da questa procedura Gram dedusse che le pareti dei g+ e dei g- dovevano avere delle differenze di composizione. Si isolarono successivamente le Forme-L: batteri con parete molto limitata o quasi del tutto assente; condizione provocata dall’intervento umano che permette a questi batteri di crescere in condizioni molto favorevoli con la quasi totale assenza di competitori. Le forme-L venivano inoltre trattate con esposizione a generazioni successive di quantità subletali di penicillina e lisozima. Nel 1952 Salton sviluppa tecniche di isolamento delle pareti batteriche attraverso digestione con lisozimi e centrifughe a gradienti osmotici crescenti. Questa tecnica era tuttavia ancora invasiva poiché non permetteva di studiare la parete batterica in un batterio vitale.

Parete batterica

Le funzioni della parete batterica sono:

• Dare forma e rigidità
• Resistenza meccanica e chimica
• Divisione cellulare
• Movimento cellulare
• Sede di determinanti antigenici
• Attività metaboliche

Esistono batteri privi di parete che sono costretti ad essere parassiti obbligati poiché andrebbero incontro a lisi osmotica se liberi nell’ambiente. La mancanza di parete è una condizione secondaria e questi batteri vivono spesso in colonie che sviluppano strutture polisaccaridiche esterne di protezione. Questi batteri sono inoltre deformabili e resistono agli antibiotici che inibiscono la formazione della parete. In questi batteri si riscontra spesso una bassa percentuale di G-C e un genoma mediamente più piccolo. Alcuni esempi sono Mycoplasma, Archoleplasma e Spiroplasma.

Il peptidoglicano è caratteristico della parete di tutti i batteri ed è un eteropolimero di zuccheri legati ad amminoacidi. È formato da N-Acetilglucosamina (NAG) e Acido N-Acetilmuramico (NAM), questi due zuccheri si legano con legami β1-4 formando lunghe catene. Gli amminoacidi che si legano al peptidoglicano sono 4 e sono in successione: L-Ala, D-Glu, L-Lis (g+) o Acido Mesodiaminopimelico (g-) e D-Ala. L’insolita alternanza di aminoacidi L e D ha come conseguenza una specificità nel riconoscimento. Questi aminoacidi sono importanti perché formano ponti trasversali tra le catene polissacaridiche.

Sintesi del peptidoglicano

Stadio citoplasmatico: Formazione di UDP-NAG e Nucleotide di Park: UDP-NAM-5aa, con grossa spesa di ATP.

Stadio di membrana: L'aminozucchero appena formato non è lipofilo ed è quindi preso dal Bactoprenolo che, caricando il nucleotide di Park, si inserisce nella membrana. Una volta nella membrana la sua struttura si capovolge esponendo all’esterno NAG e NAM. Il bactoprenolo-P può legare i componenti della membrana mentre una volta legati si trasforma in bactoprenolo-PP (pirofosfato).

• Il NAM-5aa è trasferito al bactoprenolo-P in corrispondenza della membrana.
• Il UDP-NAG forma il NAG-NAM-5aa.
• Il bactoprenolo-PP porta la molecola all’esterno.
• Il bactoprenolo-PP si defosforila rientrando nel ciclo.
• Si formano i legami crociati tra i peptidi.

Stadio di parete: Agiscono gli enzimi PBP (Penicillin Binding Proteins) che assieme alle Autolisine aprono lacune nella vecchia parte permettendo l’ingresso di nuovi oligomeri con conseguente crescita della parete. Avviene la Transpeptidazione: comporta la formazione dei legami crociati; nei g- ci sono due residui D-Ala nella catena amminoacidica di NAM, uno di essi è lisato con liberazione di energia che permette la formazione di nuovi legami per produrre nuova parete.

Antibiotici contro la sintesi; suddivisi per stadio di azione

• Citosolico:
  • Fosfomicina: Analogo strutturale del fosfoenol-piruvato. Blocca la formazione del nucleotide di Park, impedisce la sintesi di UDP-NAM.
  • Cicloserina: Analogo strutturale della D-Ala. Inibisce la formazione del substrato della transpeptidasi, impedisce di convertire 2D-Ala in D-Ala – D-Ala. Questo antibiotico è ad ampio spettro.
• Membrana:
  • Bacitracina: Blocca il bactoprenolo in forma pirofosfato, impedisce che carichi nuovi dimeri NAM-NAG.
  • Vancomicina: Blocca la transpeptidazione sequestrando dimeri di Alanina e blocca la transglicosilazione impedendo l’aggiunta di nuovi dimeri NAM-NAG. Questo antibiotico non è largamente usato in clinica poiché è tossico.
• Parete: Contengono anelli β-lattamici che sono analoghi strutturali di D-Ala – D-Ala, impediscono l’assemblaggio di monomeri del peptidoglicano legandosi con le PBP.
  • Penicillina
  • Cefalosporina

Le zone di accrescimento sono delimitate da due bandeggiature. Al centro avviene la strozzatura FtsZ ring del citoplasma a carico della proteina FtsZ associata alla proteina MreB; analoghi procariotici di tubulina e actina. Zone di accrescimento preferenziali contribuiscono al mantenimento della forma.

Parete dei g+

Composta per il 90% da peptidoglicano fittamente intrecciato. Sono presenti legami indiretti 3-4 che legano la L-Lis alla D-Ala di due catene diverse tramite un ponte poli-Gly. Ha uno spessore di circa 900Å. Oltre al peptidoglicano presenta altri componenti:

• Acidi teicoici: Formati da catene di ribitolo e glicerolo fosfati che restano nella parete in caso degli acidi teicoici oppure agganciano parete e membrana nel caso degli acidi lipoteicoici. La loro funzione è di ancoraggio e antigenica. Forniscono cariche negative verso la superficie esterna. Dato che le loro componenti sono fosforilate, il contenuto di acidi teicoici nella parete diminuisce in condizioni di P limitante.
• Polisaccaridi: Sempre presenti in quantità minime con funzione di antigene e fissazione al substrato.
• Acidi Micolici: β-ossiacidi che determinano l’aggregazione della colonia batterica e il suo aspetto ceroso. Conferiscono robustezza alla parte.
• Proteine: La loro composizione è varia ed eterogenea nei diversi ceppi batterici.

Parete dei g-

La parte dei g- è costituita da una membrana esterna e una citoplasmatica separate dal periplasma in cui è inserito uno strato di peptidoglicano. Le varie catene zuccherine sono collegate in vari modi: legami 3-4 diretti tra DAP e D-Ala di catene diverse, legami di gruppo A 4-3 tra D-Ala e DAP e legami di gruppo B 4-2 3-3 tra D-Ala e D-Glu e tra DAP e DAP. Lo spessore della parete è di 80Å (circa 1/10 rispetto ai g+) e la trama è più lassa.

Membrana esterna: Ha spessore e ultrastruttura tipiche di una membrana unitaria. Il foglietto interno è fatto da fosfolipidi che sono messi in contatto col peptidoglicano del periplasma dalla Lipoproteina mureinica.

Il foglietto esterno è composto da lipopolisaccaridi (LPS) composti da:

• Lipide A: Formato da due residui di glucosamina (GlcN) che complessano da 4 a 7 residui di acidi grassi. Svolge il ruolo di aggancio con i fosfolipidi. È anche detto endotossina poiché provoca le reazioni del sistema immunitario dell’ospite. Mutazioni a carico del lipide A provocano la morte dell’individuo. Il lipide A è riconosciuto da recettori del sistema immunitario causando la liberazione di citochine pro-infiammatorie.
• Core: In cui troviamo l’Acido 2-cheto-deossioctonico (KDO) che si aggancia al lipide A in posizione 6.
• Antigene O: Porzione variabile zuccherina composta da ripetizioni di unità tetra o pentasaccaridiche. Conferisce proprietà antigeniche peculiari poiché espone cariche negative che limitano l’azione fagocitaria del sistema immunitario dell’ospite. Questa parte induce la produzione di anticorpi specifici nell’ospite.

La membrana esterna porta anche un ampio corredo proteico:

• OMP (Outern Membrane Proteins): Sono le porine, proteine transmembrana che legandosi a trimero formano canali. I trasporti sono tutti diffusionali quindi senza consumo di energia. Queste proteine hanno una struttura a β-barrell che comprende da 8 a 16 strand. A seconda della OMP espressa si ha la formazione di canali per determinati metaboliti. Le diffusioni possono essere specifiche in base al tipo di soluto o alla sua dimensione. Le funzioni della OMP sono il nutrient uptake, il signalling, l’adesione cellulare e l’export di cataboliti. Nei ceppi patogeni le OMP sono fattori virulenti poiché aiutano la nutrizione ed evadono i meccanismi di difesa dell’ospite.
  • Sistema OMP C/F: Le due OMP, C ed F, sono costanti nel numero totale ma inversamente espresse. Hanno un canale con diametro differente l’una dall’altra.
  • PhoE: Prodotta in carenza di fosfato.
  • LamB: Specifica per il trasporto di maltosio prodotto dalla distrinizzazione dell’amido.
  • OmpA: Costituita da due subunità e serve a stabilizzare la membrana esterna durante coniugazione dei g-.

Durante la genesi della membrana i componenti vanno portati oltre il periplasma:

• Proteine integrali: Devono foldarsi in loco e quindi usano il traslocone SEC che utilizza ATP per traslocare molecole all’esterno del citoplasma. Viene impiegato il complesso BAM (β-barrell assembly machine): il precursore della OMP è preso da SecB e passato al traslocone. Nel periplasma delle chaperonine lo mantengono disteso. Le Skp impediscono il folding della porina. Le proteine SurA portano la OMP al complesso BAM che fa assumere il corretto ripiegamento alla porina.
• Lipoproteine: Tramite il complesso LOL (Lipoproteins outermembrane localization) la lipoproteina viene portata da un trasportatore ABC (ATP binding cassette) nel periplasma. Qui una chaperonina LolA con cavità idrofobica riceve la lipoproteina e la trasferisce a LolB che la dispone nella corretta posizione.
• Lipopolisaccaridi: Si forma una grossa struttura proteica che attraversa il periplasma per portare gli LPS alla membrana esterna. Si sono identificate sette proteine Lpt che formano il ponte. Coinvolge un trasportatore ABC per portare nel periplasma la LPS. Il ponte ha un solco idrofobico che aggancia il lipide-A del LPS. La ATP viene idrolizzata per estrudere LPS dal citoplasma. LptA ha un ruolo di chaperon. LptD e LptE con una struttura a toro inseriscono LPS nella membrana esterna.

Gli LPS sono assemblati nel periplasma. L’antigene O è trasportato dal bactoprenolo mentre il Lipide A e il core sono trasportati attraverso MsbA. Nel periplasma le subunità sono polimerizzate da Wzy.

Periplasma: Spazio definito dalla membrana esterna e da quella citoplasmatica. Al suo interno c’è un peptidoglicano idrato in una matrice gelificata. Tutti questi enzimi contengono un segnale N-terminale specifico che li indirizza verso il periplasma. Lo spazio periplasmatico contiene:

• Binding proteins: Con funzione recettoriale e di trasporto. Sono fluttuanti nel gel in attesa del proprio ligando.
• Enzimi idrolitici
• Enzimi detossificanti: Tra cui il più importante è la β-lattamasi che espressa in maniera costitutiva o a feedback inibisce l’azione degli antibiotici come penicillina e cefalosporina.
• Enzimi metabolici: Come idrogenasi o nitrito reduttasi.

Giunzioni di Bayer: Parte delle componenti della membrana esterna sono formati non solo a seguito di secrezione ma anche perché si formano dei punti di contatto tra le due membrane. Queste giunzioni servirebbero al turnover dei LPS.