Microbiologia

MICROBIOLOGIA

LA CELLULA BATTERICA

I microorganismi sono organismi microcellulari non visibili ad occhio nudo (viene infatti utilizzato il

microscopio ottico, pot. risolutivo =0,2m), in grado di formare aggregazioni/colonie di batteri equivalenti.

Inoltre, non presentano tessuti specializzati, ma strutture più complesse (film).

-Procarioti/batteri: nucleo primitivo e non ben definito detto nucleoide; il cromosoma a doppia elica

circolare aploide si trova nel citosol; organizzazione semplice (solo ribosomi piccoli). Diametro di frazioni di

micron fino a qualche micron. Possiedono una membrana citoplasmatica e una parete costituita da

peptidoglicano molto complessa, che dà forma e protegge il batterio. Dato che non possiedono mitocondri,

presentano strutture per sintetizzare l’E detti mesosomi

-Eucarioti/Protisti (miceti –alghe e funghi- e protozoi): nucleo definito; organuli; grandi da 7m a diversi

decimetri

-Virus: necessità di infettare un altro organismo per sopravvivere

PARETE

L’esoscheletro batterico è necessario per dare forma, proteggere, fornire E, rilasciare sostanze e

mantenere il potenziale. La composizione e lo spessore diversi ci permettono di distinguere batteri

GRAM+ e GRAM-.

Il PEPTIDOGLICANO (mureina) è un polimero formato da unità NAM (acido n-acetilmuramico) e NAG (n-

acetilglicosammina). Dal NAM sporge una coda di 4 amminoacidi (Alanina + Glu + a.

diamminomesopimelico nei G- e Lisina nei G+ + Alanina): proprio grazie al tetramero è possibile il legame

dei vari filamenti (le subunità dei filamenti sono legati da Il legame nei G- è diretto (l’ultimo a.a. lega

1-4).

il penultimo dell’altro filamento), mentre quello nei G+ il legame è mediato da un ponte pentaglicinico (5

Glicine). Poiché il peptidogligano dà rigidità, esso è spesso responsabile anche della forma dei batteri.

I GRAM+ presentano una parete altamente polare (non permette

l’ingesso a molecole idrofobiche), formata da membrana

citoplasmatica (doppio strato fosfolipidico) ed un’alta fascia di

peptidoglicano, che ospita ACIDI TEICOICI (funzione antigenica di

superficie, diversi in ogni batterio; polimeri di alcol polivalenti), ACIDI

LIPOTEICOICI (se gli a.t. legati ai lipidi; ancoraggio) e proteine

associate.

Durante l’infezione può interferire con la fagocitosi ed indurre la

risposta innata

I GRAM- hanno una membrana polare che non permette il passaggio

né di molecole idrofobiche, né di molecole idrofiliche a causa dell’alta

quantità di lipidi (si serve di proteine e carrier). Infatti è formata da

una membrana, uno strato di peptidoglicano immerso nello spazio

periplasmico (5/10% del peso della parete) e una MEMBRANA

ESTERNA ASIMMETRICA. Lo spazio tra le due membrane è detto

periplasmico. Dalla struttura sporgono lipopolisaccaridi LPS, catenelle

formate da una parte lipidica tossica attaccata alla membrana –

endotossine batteriche – e una parte polisaccaridica con all’esterno

un antigene variabile per la distinzione dei G-. Gli LPS sono

responsabili della risposta innata nell’ospite, che può portare anche a

shock.

La membrana esterna contiene anche porine, proteine strutturali e recettori molecolari.

Il peptidoglicano può essere eliminato con il LISOZIMA (lacrime e muco), formando così protoplasti (G+) o

sferoplasti (G-).

La procedura utilizzata per il riconoscimento del G+ e G- è la colorazione di Gram:

Fissazione Cristal mordente Controlorazio

Decolorazion

con becco violetto per LUGOL e con Etanolo ne con

Bunzen col. membr. (stabilità) fucsina

G+ e G- G+ e G- G+ e G- G+ colorati

G + colorati

incolore colorati colorati G- colorati di

(unici lipidi = fucsia

a.lipoteicoici-

> i fori

vengono

subito

tappati dalle

proteine

disidratate

ed il cristal

violetto non

esce)

G- bianchi

La colorazione di Gram non è adatta a batteri conservati da tempo o trattati con Ab, a causa della

degradazione del peptidoglicano.

ECCEZIONI

Micobatteri:

responsabili della tubercolosi;

batteri con membrana citoplasmatica, peptidoglicano e molecole lipidiche (a. lipolici, glicolipidi fenolici,

lipo-arabino-mannano).

Gli scambi con l’esterno sono molto selettivi (la crescita in laboratorio avviene in 7/15 giorni), sembrano

essere coperti di cera e sono molto resistenti agli agenti chimico-fisici.

Proprio a causa del rivestimento ceroso, viene utilizzata la colorazione per

acido-resistenza o di Ziehl-Neelsen contenente a. solforico; la colorazione

evidenzia l’acido resistenza dei micobatteri e di altri microorganismi

acido-resistenti. Anche se uccisi, questi batteri non sono colorabili con i

normali coloranti istologici se non mediante trattamento a caldo (Una

volta colorati, sono difficilmente decolorabili).

La colorazione prevede:

- lo stemperamento della sospensione batterica al centro del

vetrino,

- fissazione

- colorazione a caldo con fucsina basica,

- decolorazione (a. solforico 20%)

- lavaggio

- colorazione di contrasto con blu dimetilene

- asciugatura

- osservazione con microscopio ad immersione con obiettivo 100x

Micoplasmi: classe dei mollicutes; senza parete (non colorabili con Gram), ma incorporano steroli

provenienti dall’ospite nelle proprie membrane; hanno la pompa sodio traslocasi ATPasi per evitare di

riempirsi e scoppiare.

ELEMENTI NON ESSENZIALI

- CAPSULA: involucro aggiuntivo esterno ed importante fattore di virulenza, in quanto permette al

batterio di passare attraverso il torrente circolatorio dell’organismo infettato senza venire eliminato

e facilita inoltre l’aderenza. Non è sempre presente in batteri in vitro, ma si vede sempre in vivo. Si

colora mediante inchiostro di china

- PILI/FIMBRE: strutture proteiche filiformi (=tubi cavi formati da pilina), necessari per l’adesione

all’ospite e all’ancoraggio tra batteri: ognuno ha infatti un pilo sessuale F che permette la

coniugazione (il batterio ancorato riceve fattori di

virulenza)

- FLAGELLI/CIGLIA: organelli locomotori legati alla

membrana citoplasmatica e formati da subunità

proteiche avvolte ad elica (flagellina); aggiungono

il moto verso condizioni ambientali più favorevoli

al già esistente moto vibrazionale grauniano. Sono

quindi anche sensori dell’ambiente e reagiscono

alla presenza di veleni e nutrienti (chemiotassi). I

batteri possono essere mono/peri/lofotrichi (un

flagello; un mucchietto da un lato; flagelli sparsi).

- PLASMIDI: si trovano preferibilmente nei G-

(resistenza)

- ENDOSPORE: è una situazione di quiescenza

della cellula, che si forma quando le condizioni

diventano inadatte alla replicazione: grazie a questa proprietà è in grado di sopravvivere per tempi

indefiniti. Inoltre, resiste ad alte temperature e trattamenti con solventi organici. Queste struttura

disidratata e pluristratificata contiene una copia del cromosoma, poche proteine essenziali,

Clostridium).

ribosomi e molto dipicolinato di calcio (ex: Bacillus e La spora risulta rifrangente al

microscopio. Il ritorno alla forma germinativa è definito germinazione e si compie in una 90ina di

minuti.

LA CRESCITA BATTERICA

Per la maggior parte delle persone, i microrganismi sono noti solo per le caratteristiche che alcuni di essi

hanno di provocare malattie.

Robert Koch fu il primo ad adottare sperimentalmente quattro regole generali per stabilire se un certo

microrganismo è o meno causa di certa malattia. I postulati sono i seguenti:

1. il presunto agente responsabile della malattia in esame deve essere presente in tutti i casi

riscontrati di quella malattia.

2. deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura

pura

3. ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano (ma

suscettibile alla malattia), si riproduce la malattia.

4. il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato

sperimentalmente.

Questi postulati hanno evidentemente dei limiti sperimentali quando si parla di microrganismi che sono, o

si presume che siano, infettivi per l'uomo, essendo evidenti i limiti etici di una sperimentazione in tal

senso.

Le cellule batteriche si riproducono per via ASESSUATA. Durante la

duplicazione del DNA, la parete inizia ad invaginarsi. Man mano che il processo

di invaginazione procede, il DNA si ripartisce tra le due cellule figlie. Il processo

di invaginazione della parete procede fino alla separazione in due unità di uguale

misura.

Di una coltura si può misurare la VELOCITA’ DI CRESCITA, ovvero la variazione di

cellule (numero o massa) per unità di tempo. La crescita è di tipo esponenziale,

perché Le popolazioni batteriche in un dato intervallo di tempo raddoppiano il

numero di cellule.

METODI DI CONTA BATTERICA Si può osservare la curva di crescita batterica e risalire al

numero di cellule nel campione dalla densità ottica

ottenuta con lo SPETTROFOTOMETRO. Lo strumento misura

l’assorbanza/trasmittanza di un fascio di luce che

attraversa un campione.

Esiste una proporzionalità diretta tra assorbanza e

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concentrazione batteri: 1OD (600 nm) = 8x10 batteri

Una misurazione più diretta è la

CONTA MICROBICA direttamente dal

MICROSCOPIO; con questo metodo non è però possibile distinguere cellule vive da

cellule morte, si ha difficoltà ad individuare cellule di dimensioni molto piccole e

non è adeguato per sospensioni a bassa densità cellulare.

La CONTA VITALE è invece un metodo che permette la conta diretta mediante

formazione di colonie su piastra. Si definisce vitale una cellula capace di dividersi e

dare origine a una progenie. Si possono o spipettare le cellule (0,1ml o meno) in

una piastra con terreno agar distribuendole uniformemente, oppure si inserisce il

medium a seguito delle cellule. A seguito di incubazione, si osserva la tipica piastra

di coltura: nel secondo caso, oltre alle colonie di superficie, si osservano anche

quelle si sub-superficie.

Nella CONTA VITALE con il metodo delle DILUIZIONI, si diluiscono le colonie prima della conta, in modo che

il numero di cellule sia compreso tra 30 e 300 e si conta al microscopio. Per ottenere il numero di

cellule/mm ndel campione originale, si deve moltiplicare il numero di cellule per il fattore di diluizione

utilizzato.

IL METABOLISMO BATTERICO

CATABOLISMO Degradazione di substrati per la produzione di ATP

ANABOLISMO Utilizzo di ATP per la sintesi di componenti cellulari

METABOLISMO catabolismo + anabolismo

Gli elementi essenziali per la crescita microbica sono: una sorgente di Carbonio (CO2 per gli autotrofi o C

organico per gli eterotrofi), N, ATP, H2O, ioni, O2 per gli aerobi obbligati, zuccheri, grassi e proteine.

Molto importante è il METABOLISMO DEL GLUCOSIO. I batteri possono produrre energia dal glucosio

mediante due meccanismi differenti fermentazione (respirazione anaerobia) e respirazione (respirazione

aerobia). Il risultato finale è identico, ovvero la sintesi di ATP (reazione endoergonica). Ciò che cambia è

però il meccanismo e, soprattutto, la diversa resa energetica.

- Nella FERMENTAZIONE, la sintesi di ATP è il risultato della fosforilazione a livello di substrato; l’acido

piruvico della glicolisi viene convertito in diversi prodotti finali. Viene aggiunto un gruppo fosfato ad

un intermedio, che diviene un gruppo fosfato ad “alta energia” e alla fine viene trasferito all’ADP

per formare ATP. La glicolisi, detta anche via di Embden-Meyerhof, è un esempio di fermentazione.

Il suo risultato è il consumo di glucosio, la sintesi di 2 molecole di ATP e prodotti della

fermentazione.

- Nella RESPIRAZIONE, la membrana citoplasmatica viene caricata

energeticamente grazie alla forza proto-motrice. Dissipa parte di

questa energia nella formazione di ATP a partire da ADP e fosfato

inorganico (Pi) in un processo detto fosforilazione ossidativa.

L’accoppiamento della forza proto-motrice alla sintesi di ATP

avviene mediante un complesso enzimatico proteico di

membrana detto ATP sintetasi. Nel ciclo di Krebs o degli acidi tricarbossilici, il piruvato (prodotto

dalla glicolisi) viene completamente ossidato a CO2 e H2O liberando elettroni in un processo

denominato decarbossilazione ossidativa: la reazione produce NADH. Nella fosforilazione

ossidativa/ciclo dei TCA si formano 2CO2, 3NADH, 1FADH2 e 1GTP. I composti prodotti entrano a far

parte della catena di trasporto degli elettroni e vengono alla fine passati all’accettore finale

inorganico O2, cosa che porta alla formazione di ATP (dalla glicolisi alla catena=38 ATP/mol di

glucosio).

Con la riduzione di O2 a H2O, si formano molecole molto reattive e altamente tossiche per le cellule

(superossido, perossido di idrogeno…); per eliminare i derivati tossici dell’ossigeno, i microrganismi

aerobi hanno evoluto enzimi capaci di distruggerli (superossido dismutasi –fondamentale- e catalasi

–la catalati non c’è in alcuni aerobi-).

I principali fattori che svolgono un ruolo fondamentale nel controllo della crescita microbica sono:

- disponibilità di O 2

- temperatura

- pH

- disponibilità di H O e Sali (NaCl)

2

AEROBI

obbligati: Mycobacterium tubercolosis; richiesta la relazione con l’O2

 facoltativi: E. Coli; non obbligata ma consigliata la presenza di O2

 microaerofili: spirillum volutans; presenza di O2 ma a livelli minori rispetto a quelli atmosferici



ANAEROBI

aerotolleranti: la maggior parte dei batteri; non richiesta e indifferente la presenza di O2

 Anaerobi obbligati: Clostridium perfringens; la presenza di O2 è letale



La giara per anaerobiosi è uno degli strumenti utilizzati per eliminare ogni

traccia di ossigeno dai terreni di coltura usati per gli anaerobi stretti, che

contiene agenti chimici che lo consumano (l’aria nel contanitore ermetico è

sostituita con H2, CO2 e piccole quantità di O2, poi eliminate dal

catalizzatore.

È possibile la distinzione sulla base di come si distribuiscono in una provetta

contenente brodo tioglicolato. Si aggiunge una piccola quantità di agar per

evitare il rimescolamento ed un indicatore redox, rosa se ossidato e incolore

se ridotto.

(a) I mo aerobi obbligati possono crescere solo nel piccolo strato superficiale

in cui l’ossigeno riesce a diffondere. (La crescita non è migliore vicino alla

superficie, poichè tali organismi sono capaci solo di un metabolismo di tipo

fermentativo).

(b) I mo anaerobi, sensibili alla presenza dell’O , possono crescere solo sul fondo della provetta, lontano

2

dalla superficie.

(c) I mo aerobi facoltativi possono crescere sia in presenza che in assenza di O , e quindi si distribuiscono

2

lunga tutta la provetta.

(d) I microaerofili crescono a distanza dalla zona maggiormente ossigenata.

(e) Gli anaerobi aerotolleranti crescono lungo tutta la provetta.

Temperatura: pH:

acidofili

(neutro) e

alcalofili

(pH>7)

n.b.: Alofili/Alotollerante: amano NaCl (come Staphylococcus aureus); i non alofili sono per esempio

rappesentati da E. Coli

La concentrazione ottimale di NaCl per gli organismi marini, come per esempio V. fischeri, è il 3%; per gli

alofili estremi è invece compresa tra il 15 ed il 30%, a seconda del microrganismo.

IL MICROBIOTA

Nell’uomo si possono trovare 10^14 microrganismi, collocati soprattutto sulla pelle e sulle mucose, quindi

in epiteli esposti indirettamente all'ambiente esterno.

In particolare, si collocano in nicchie nel naso, bocca (10^9), pelle (la meno colonizzata), tratto gastro-

intestinale (il crasso è la zona più colonizzata del corpo, con 10^11 microrganismi) e tratto urogenitale

(10^6).

Il valore è stato ricavato grazie al Progetto Microbioma Umano, che ha permesso di identificare il tipo, il

prodotto ed il potenziale genetico di molti microrganismi della flora.

La flora microbica normale, ovvero i microrganismi normalmente associati al tessuto sano, è in equilibrio

con il corpo e ci aiuta a stare bene, perché ci proteggono da altri elementi nocivi, producendo

BATTERIOCINE e saturano i siti di aderenza, producono composti utili per le nostre reazioni. Infatti,

sintetizzano vitamine (tiamine, riboflavina, pirossidina, B , K), acidi organici (acetico, propionico,

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butirrico), enzimi (a e e ed intervengono nel metabolismo degli steroidi.

-galattosidasi, a -glucosidasi)

Stimolano inoltre il sistema immunitario con Ab cross-reattivi.

I liquidi (sangue, liquido pleurico/celebrospinale/pericardico/peritoneale/sinoviale ed urina), il sistema

linfatico e gli organi, però, devono essere sterili, ovvero devono essere privi di microrganismi.

Uno dei metodi di trasferimento di microrganismi sono le mani (n.b.: anche i G-, che non sono flora

endogena della pelle; le mani fungono da veicolo di infezione -Colonie di Klebsiella-).

CONTROLLO DELLA FLORA:

- Lisozima delle secrezioni, dissolve le pareti cellulari

- La flora normale compete con i patogeni

- La pelle è una barriera fisica che produce a. grassi antimicrobici e la sua flora normale contrasta i

patogeni

- Cambio repentino del pH o il pH acido dello stomaco

- Svuotamento tratto urinario

- Rimozione di particelle e microrganismi grazie al passaggio dell’aria tra le ciglia del nasofaringe

- Muco e ciglia della trachea

- Proteine del sangue

- Muco e fagociti nei polmoni

Gli ANTIBIOTICI distruggono i micro infettivi e la flora endogena: una perdita dei batteri commensali,

favorisce la prevalenza di microrganismi opportunisti, che normalmente non riescono a competere con la

flora normale, ma che in queste condizioni possono moltiplicarsi e dare malattie (Candida Albicans). Gli

antibiotici si devono infatti prendere solo a seguito di un antibiogramma di un campione. L’esame serve a

testare la resistenza della flora ad una determinata quantità