Microbiologia

Microbiologia: la cellula batterica

I microorganismi sono organismi microcellulari non visibili ad occhio nudo (viene infatti utilizzato il microscopio ottico, pot. risolutivo = 0,2 μm), in grado di formare aggregazioni/colonie di batteri equivalenti. Inoltre, non presentano tessuti specializzati, ma strutture più complesse (film).

Procarioti e eucarioti

Procarioti/batteri: hanno un nucleo primitivo e non ben definito detto nucleoide; il cromosoma a doppia elica circolare aploide si trova nel citosol; organizzazione semplice (solo ribosomi piccoli). Diametro di frazioni di micron fino a qualche micron. Possiedono una membrana citoplasmatica e una parete costituita da peptidoglicano molto complessa, che dà forma e protegge il batterio. Dato che non possiedono mitocondri, presentano strutture per sintetizzare l'energia detti mesosomi.

Eucarioti/Protisti (miceti – alghe e funghi – e protozoi): hanno un nucleo definito; organuli; grandi da 7 μm a diversi decimetri.

Virus: necessitano di infettare un altro organismo per sopravvivere.

Parete batterica

L'esoscheletro batterico è necessario per dare forma, proteggere, fornire energia, rilasciare sostanze e mantenere il potenziale. La composizione e lo spessore diversi ci permettono di distinguere batteri GRAM+ e GRAM-.

Il peptidoglicano (mureina) è un polimero formato da unità NAM (acido n-acetilmuramico) e NAG (n-acetilglicosammina). Dal NAM sporge una coda di 4 amminoacidi (Alanina + Glu + a.diamminomesopimelico nei G- e Lisina nei G+ + Alanina): proprio grazie al tetramero è possibile il legame dei vari filamenti (le subunità dei filamenti sono legati da β1-4). Nei G-, il legame è diretto (l'ultimo a.a. lega il penultimo dell'altro filamento), mentre nei G+ è mediato da un ponte pentaglicinico (5 Glicine). Poiché il peptidoglicano dà rigidità, esso è spesso responsabile anche della forma dei batteri.

I GRAM+ presentano una parete altamente polare (non permette l'ingresso a molecole idrofobiche), formata da membrana citoplasmatica (doppio strato fosfolipidico) ed un’alta fascia di peptidoglicano, che ospita acidi teicoici (funzione antigenica di superficie, diversi in ogni batterio; polimeri di alcol polivalenti), acidi lipoteicoici (se gli a.t. legati ai lipidi; ancoraggio) e proteine associate. Durante l’infezione può interferire con la fagocitosi ed indurre la risposta innata.

I GRAM- hanno una membrana polare che non permette il passaggio né di molecole idrofobiche, né di molecole idrofiliche a causa dell’alta quantità di lipidi (si serve di proteine e carrier). Infatti è formata da una membrana, uno strato di peptidoglicano immerso nello spazio periplasmico (5/10% del peso della parete) e una membrana esterna asimmetrica. Lo spazio tra le due membrane è detto periplasmico. Dalla struttura sporgono lipopolisaccaridi LPS, catenelle formate da una parte lipidica tossica attaccata alla membrana – endotossine batteriche – e una parte polisaccaridica con all’esterno un antigene variabile per la distinzione dei G-. Gli LPS sono responsabili della risposta innata nell’ospite, che può portare anche a shock.

La membrana esterna contiene anche porine, proteine strutturali e recettori molecolari. Il peptidoglicano può essere eliminato con il lisozima (lacrime e muco), formando così protoplasti (G+) o sferoplasti (G-).

Colorazione di Gram

La procedura utilizzata per il riconoscimento del G+ e G- è la colorazione di Gram:

• Fissazione con becco Bunsen
• Cristal violetto per G+ e G-
• Mordente con LUGOL
• Decolorazione con Etanolo
• Controllo di decolorazione con fucsina

G+ colorati di fucsia, mentre G- rimangono incolori. La colorazione di Gram non è adatta a batteri conservati da tempo o trattati con Ab, a causa della degradazione del peptidoglicano.

Eccezioni

Micobatteri: responsabili della tubercolosi; batteri con membrana citoplasmatica, peptidoglicano e molecole lipidiche (a. lipolici, glicolipidi fenolici, lipo-arabino-mannano). Gli scambi con l’esterno sono molto selettivi (la crescita in laboratorio avviene in 7/15 giorni), sembrano essere coperti di cera e sono molto resistenti agli agenti chimico-fisici. Proprio a causa del rivestimento ceroso, viene utilizzata la colorazione per acido-resistenza o di Ziehl-Neelsen contenente a. solforico; la colorazione evidenzia l’acido resistenza dei micobatteri e di altri microorganismi acido-resistenti. Anche se uccisi, questi batteri non sono colorabili con i normali coloranti istologici se non mediante trattamento a caldo. Una volta colorati, sono difficilmente decolorabili.

La colorazione prevede:

• Stemperamento della sospensione batterica al centro del vetrino
• Fissazione
• Colorazione a caldo con fucsina basica
• Decolorazione (a. solforico 20%)
• Lavaggio
• Colorazione di contrasto con blu di metilene
• Asciugatura
• Osservazione con microscopio a immersione con obiettivo 100x

Micoplasmi: classe dei mollicutes; senza parete (non colorabili con Gram), ma incorporano steroli provenienti dall’ospite nelle proprie membrane; hanno la pompa sodio traslocasi ATPasi per evitare di riempirsi e scoppiare.

Elementi non essenziali

Capsula: involucro aggiuntivo esterno ed importante fattore di virulenza, in quanto permette al batterio di passare attraverso il torrente circolatorio dell’organismo infettato senza venire eliminato e facilita inoltre l’aderenza. Non è sempre presente in batteri in vitro, ma si vede sempre in vivo. Si colora mediante inchiostro di china.

Pili/fimbre: strutture proteiche filiformi (=tubi cavi formati da pilina), necessari per l’adesione all’ospite e all’ancoraggio tra batteri: ognuno ha infatti un pilo sessuale F che permette la coniugazione (il batterio ancorato riceve fattori di virulenza).

Flagelli/ciglia: organelli locomotori legati alla membrana citoplasmatica e formati da subunità proteiche avvolte ad elica (flagellina); aggiungono il moto verso condizioni ambientali più favorevoli al già esistente moto vibrazionale browniano. Sono quindi anche sensori dell’ambiente e reagiscono alla presenza di veleni e nutrienti (chemiotassi). I batteri possono essere mono/peri/lofotrichi (un flagello; un mucchietto da un lato; flagelli sparsi).

Plasmidi: si trovano preferibilmente nei G- (resistenza).

Endospore: è una situazione di quiescenza della cellula, che si forma quando le condizioni diventano inadatte alla replicazione: grazie a questa proprietà è in grado di sopravvivere per tempi indefiniti. Inoltre, resiste ad alte temperature e trattamenti con solventi organici. Queste strutture disidratate e pluristratificate contengono una copia del cromosoma, poche proteine essenziali, ribosomi e molto dipicolinato di calcio (ex: Bacillus e Clostridium). La spora risulta rifrangente al microscopio. Il ritorno alla forma germinativa è definito germinazione e si compie in una 90ina di minuti.

La crescita batterica

Per la maggior parte delle persone, i microrganismi sono noti solo per le caratteristiche che alcuni di essi hanno di provocare malattie. Robert Koch fu il primo ad adottare sperimentalmente quattro regole generali per stabilire se un certo microrganismo è o meno causa di una certa malattia. I postulati sono i seguenti:

• Il presunto agente responsabile della malattia in esame deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia.
• Deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura pura.
• Ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano (ma suscettibile alla malattia), si riproduce la malattia.
• Il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente.

Questi postulati hanno evidentemente dei limiti sperimentali quando si parla di microrganismi che sono, o si presume che siano, infettivi per l'uomo, essendo evidenti i limiti etici di una sperimentazione in tal senso.

Le cellule batteriche si riproducono per via asessuata. Durante la duplicazione del DNA, la parete inizia ad invaginarsi. Man mano che il processo di invaginazione procede, il DNA si ripartisce tra le due cellule figlie. Il processo di invaginazione della parete procede fino alla separazione in due unità di uguale misura.

Di una coltura si può misurare la velocità di crescita, ovvero la variazione di cellule (numero o massa) per unità di tempo. La crescita è di tipo esponenziale, perché le popolazioni batteriche in un dato intervallo di tempo raddoppiano il numero di cellule.

Metodi di conta batterica

Si può osservare la curva di crescita batterica e risalire al numero di cellule nel campione dalla densità ottica ottenuta con lo spettrofotometro. Lo strumento misura l’assorbanza/trasmittanza di un fascio di luce che attraversa un campione. Esiste una proporzionalità diretta tra assorbanza e concentrazione batterica: 1 OD (600 nm) = 8x10⁸ batteri.

Una misurazione più diretta è la conta microbica direttamente dal microscopio; con questo metodo non è però possibile distinguere cellule vive da cellule morte, si ha difficoltà ad individuare cellule di dimensioni molto piccole e non è adeguato per sospensioni a bassa densità cellulare.

La conta vitale è invece un metodo che permette la conta diretta mediante formazione di colonie su piastra. Si definisce vitale una cellula capace di dividersi ed originare una progenie. Si possono o pipettare le cellule (0,1 ml o meno) in una piastra con terreno agar distribuendole uniformemente, oppure si inserisce il medium a seguito delle cellule. A seguito di incubazione, si osserva la tipica piastra di coltura: nel secondo caso, oltre alle colonie di superficie, si osservano anche quelle di sub-superficie.

Nella conta vitale con il metodo delle diluizioni, si diluiscono le colonie prima della conta, in modo che il numero di cellule sia compreso tra 30 e 300 e si conta al microscopio. Per ottenere il numero di cellule/mm³ del campione originale, si deve moltiplicare il numero di cellule per il fattore di diluizione utilizzato.

Il metabolismo batterico

Catabolismo: Degradazione di substrati per la produzione di ATP.

Anabolismo: Utilizzo di ATP per la sintesi di componenti cellulari.

Metabolismo: catabolismo + anabolismo.

Gli elementi essenziali per la crescita microbica sono: una sorgente di Carbonio (CO₂ per gli autotrofi o C organico per gli eterotrofi), N, ATP, H₂O, ioni, O₂ per gli aerobi obbligati, zuccheri, grassi e proteine. Molto importante è il metabolismo del glucosio. I batteri possono produrre energia dal glucosio mediante due meccanismi differenti: fermentazione (respirazione anaerobia) e respirazione (respirazione aerobia). Il risultato finale è identico, ovvero la sintesi di ATP (reazione endoergonica). Ciò che cambia è però il meccanismo e, soprattutto, la diversa resa energetica.

Nella fermentazione, la sintesi di ATP è il risultato della fosforilazione a livello di substrato; l’acido piruvico della glicolisi viene convertito in diversi prodotti finali. Viene aggiunto un gruppo fosfato ad un intermedio, che diviene un gruppo fosfato ad “alta energia” e alla fine viene trasferito all’ADP per formare ATP. La glicolisi, detta anche via di Embden-Meyerhof, è un esempio di fermentazione. Il suo risultato è il consumo di glucosio, la sintesi di 2 molecole di ATP e prodotti della fermentazione.

Nella respirazione, la membrana citoplasmatica viene caricata energeticamente grazie alla forza proto-motrice. Dissipa parte di questa energia nella formazione di ATP a partire da ADP e fosfato inorganico (Pi) in un processo detto fosforilazione ossidativa. L’accoppiamento della forza proto-motrice alla sintesi di ATP avviene mediante un complesso enzimatico proteico di membrana detto ATP sintetasi. Nel ciclo di Krebs o degli acidi tricarbossilici, il piruvato (prodotto dalla glicolisi) viene completamente ossidato a CO₂ e H₂O liberando elettroni in un processo denominato decarbossilazione ossidativa: la reazione produce NADH. Nella fosforilazione ossidativa/ciclo dei TCA si formano 2CO₂, 3NADH, 1FADH₂ e 1GTP. I composti prodotti entrano a far parte della catena di trasporto degli elettroni e vengono alla fine passati all’accettore finale inorganico O₂, cosa che porta alla formazione di ATP (dalla glicolisi alla catena=38 ATP/mol di glucosio).

Con la riduzione di O₂ a H₂O, si formano molecole molto reattive e altamente tossiche per le cellule (superossido, perossido di idrogeno…); per eliminare i derivati tossici dell’ossigeno, i microrganismi aerobi hanno evoluto enzimi capaci di distruggerli (superossido dismutasi – fondamentale – e catalasi – la catalasi non c’è in alcuni aerobi).

Fattori di crescita microbica

I principali fattori che svolgono un ruolo fondamentale nel controllo della crescita microbica sono:

• Disponibilità di O₂
• Temperatura
• pH
• Disponibilità di H₂O e Sali (NaCl)

Aerobi e anaerobi

• Aerobi obbligati: Mycobacterium tuberculosis; richiesta la relazione con l’O₂
• Aerobi facoltativi: E. Coli; non obbligata ma consigliata la presenza di O₂
• Microaerofili: Spirillum volutans; presenza di O₂ ma a livelli minori rispetto a quelli atmosferici
• Anaerobi aerotolleranti: la maggior parte dei batteri; non richiesta e indifferente la presenza di O₂
• Anaerobi obbligati: Clostridium perfringens; la presenza di O₂ è letale

La giara per anaerobiosi è uno degli strumenti utilizzati per eliminare ogni traccia di ossigeno dai terreni di coltura usati per gli anaerobi stretti, che contiene agenti chimici che lo consumano (l’aria nel contenitore ermetico è sostituita con H₂, CO₂ e piccole quantità di O₂, poi eliminate dal catalizzatore).

È possibile la distinzione sulla base di come si distribuiscono in una provetta contenente brodo tioglicolato. Si aggiunge una piccola quantità di agar per evitare il rimescolamento ed un indicatore redox, rosa se ossidato e incolore se ridotto.

(a) I microorganismi aerobi obbligati possono crescere solo nel piccolo strato superficiale in cui l’ossigeno riesce a diffondere. La crescita non è migliore vicino alla superficie, poiché tali organismi sono capaci solo di un metabolismo di tipo fermentativo.

(b) I microorganismi anaerobi, sensibili alla presenza dell’O₂, possono crescere solo sul fondo della provetta, lontano dalla superficie.

(c) I microorganismi aerobi facoltativi possono crescere sia in presenza che in assenza di O₂, e quindi si distribuiscono lungo tutta la provetta.

(d) I microaerofili crescono a distanza dalla zona maggiormente ossigenata.

(e) Gli anaerobi aerotolleranti crescono lungo tutta la provetta.

Temperatura e pH

Temperatura: pH: acidofili (neutro) e alcalofili (pH>7)

Alofili/Alotollerante: amano NaCl (come Staphylococcus aureus); i non alofili sono per esempio rappresentati da E. Coli. La concentrazione ottimale di NaCl per gli organismi marini, come per esempio V. fischeri, è il 3%; per gli alofili estremi è invece compresa tra il 15 ed il 30%, a seconda del microrganismo.

Il microbiota

Nell’uomo si possono trovare 10¹⁴ microrganismi, collocati soprattutto sulla pelle e sulle mucose, quindi in epiteli esposti indirettamente all'ambiente esterno. In particolare, si collocano in nicchie nel naso, bocca (10⁹), pelle (la meno colonizzata), tratto gastrointestinale (il crasso è la zona più colonizzata del corpo, con 10¹¹ microrganismi) e tratto urogenitale (10⁶).

Il valore è stato ricavato grazie al Progetto Microbioma Umano, che ha permesso di identificare il tipo, il prodotto ed il potenziale genetico di molti microrganismi della flora.

La flora microbica normale, ovvero i microrganismi normalmente associati al tessuto sano, è in equilibrio con il corpo e ci aiuta a stare bene, perché ci proteggono da altri elementi nocivi, producendo batteriocine e saturano i siti di aderenza, producono composti utili per le nostre reazioni. Infatti, sintetizzano vitamine (tiamine, riboflavina, pirossidina, B₁₂, K), acidi organici (acetico, propionico, butirrico), enzimi (α e β-galattosidasi, α e β-glucosidasi) ed intervengono nel metabolismo degli steroidi. Stimolano inoltre il sistema immunitario con Ab cross-reattivi.

I liquidi (sangue, liquido pleurico/celebrospinale/pericardico/peritoneale/sinoviale ed urina), il sistema linfatico e gli organi, però, devono essere sterili, ovvero devono essere privi di microrganismi.

Uno dei metodi di trasferimento di microrganismi sono le mani (n.b.: anche i G-, che non sono flora endogena della pelle; le mani fungono da veicolo di infezione - Colonie di Klebsiella).

Controllo della flora

• Lisozima delle secrezioni, dissolve le pareti cellulari
• La flora normale compete con i patogeni
• La pelle è una barriera fisica che produce acidi grassi antimicrobici e la sua flora normale contrasta i patogeni
• Cambio repentino del pH o il pH acido dello stomaco
• Svuotamento tratto urinario
• Rimozione di particelle e microrganismi grazie al passaggio dell’aria tra le ciglia del nasofaringe
• Muco e ciglia della trachea
• Proteine del sangue
• Muco e fagociti nei polmoni

Gli antibiotici distruggono i micro infettivi e la flora endogena: una perdita dei batteri commensali, favorisce la prevalenza di microrganismi opportunisti, che normalmente non riescono a competere con la flora normale, ma che in queste condizioni possono moltiplicarsi e dare malattie (Candida Albicans). Gli antibiotici si devono infatti prendere solo a seguito di un antibiogramma di un campione. L’esame serve a testare la resistenza della flora ad una determinata quantità.