Microbiologia

DISINFEZIONE

Per disinfestazione si intende qualsiasi procedimento mirato all’eliminazione dei microorganismi patogeni

dall’ambiente; il processo bersaglia diverse componenti strutturali (proteine/membrana/citoplasma…):

- denaturazione delle proteine

- ossidazione di gruppi solfidrilici liberi o altri gruppi funzionali

- alterazione delle membrane per solubilizzazione dei lipidi

La disinfestazione può essere ottenuta mediante:

- agenti fisici: calore (in tempi inferiori rispetto alla sterilizzazione)

- agenti chimici: acqua ossigenata, formaldeide, clorexidina, cloro, iodio, alcol etilico o

isopropilico… per solubilizzare i lipidi

Microrganismi dal più al meno resistente:

- prioni

- spore: 121°, 1atm, 15min, oppure stufe a secco 180°

- micobatteri: G+ ma con parete particolare, perché formata per il 70% del peso secco di lipidi;

cerosi e fortemente impenetrabili se non previo riscaldamento

- virus privi di envelope

- virus con envelope, i più facilmente eliminabili; muoiono anche naturalmente fuori dall’ospite

STERILIZZAZIONE

La sterilizzazione consente di eliminare tutti i microrganismi in un dato ambiente tramite l’utilizzo di mezzi

fisici (calore o radiazione), sostanze chimiche e filtrazione.

STERILIZZAZIONE TERMICA

Il metodo avviene in presenza di calore secco o umido.

CALORE SECCO

Si utilizzano stufe a 180°, generalmente non ventilate (per migliorare la circolazione dell’aria hanno

sistemi di ventilazione interni). Il metodo viene utilizzato solo per ciò che non prende fuoco, come vetreria

con buona resistenza, metallo, polveri senza principi attivi inattivabili; non è usufruibile per sterilizzare

gomma o plastica.

La sterilizzazione completa con le stufe avviene in 1h, un tempo più lungo rispetto a quello dell’autoclave

(vd sotto). Alla fine del processo, ‘l’etichetta’ applicata all’oggetto cambia colore. Si eliminano patogeni e

le spore.

CALORE UMIDO

Si utilizza l’autoclave, che segue di fatto lo stesso principio della pentola a pressione.

121° (sonda in una beuta) p=1atm per 15min.

Spesso si sterilizzano con questo metodo i liquidi senza sostanze attive degradabili, i terreni, la gomma e

le garze. Alla fine è importante sfiatare l’autoclave per portare la pressione a livelli basali. Distrugge anche

le spore batteriche.

La sterilizzazione non è applicabile a certe sostanze (Ab e sospensioni) ed emerge quindi la necessità di

preparare reagenti in ambienti asettici (locali nei quali l’aria in entrata ed uscita è filtrata con filtri HEPA e

sono pressurizzati – p + rispetto ad esterno -; 2 porte). I locali sono inoltre irradiati con raggi ultravioletti

(fortemente battericidi).

TERILIZZAZIONE PER FILTRAZIONE

S

Viene utilizzata per liquidi e gas e si serve di filtri porosi, il cui diametro dei fori dipende dai microrganismi

da trattenere.

È spesso anche utilizzata con le colture cellulari, terreni con molti fattori nutrizionali e per preservare la

sterilità

Elimina sostanza fino ai 0,2/0,45 micron (anche 0,1 per micoplasmi).

STERILIZZAZIONE CHIMICA

Un agente antimicrobico è un composto chimico che uccide i microrganismi o ne inibisce la crescita e può

essere sia un composto naturale che chimico di sintesi. Definiamo:

- Sostanze batteriostatiche: bloccano la crescita, una volta allontanate i batteri riprendono a

crescere

- Sostane battericide: uccidono i microrganismi

La distinzione a volte non è così netta: lo stesso composto può essere letale ad alte concentrazioni,

mentre, a basse concentrazioni, può limitarsi ad avere effetto inibente.

Formaldeide: per superfici, potere di penetrazione basso, irritante e tossico

Ozono: strumenti chirurgici, alto potere ossidante

Ossido di etilene: come le stufe a secco/umido elimina le spore; ha un elevato potere di penetrazione per

ciò che non è sterilizzabile nelle stufe o nell’autoclave, quindi si possono sterilizzare così anche sostanze

nel proprio contenitore definitivo; erogato utilizzando autoclavi ma con temperature più basse rispetto al

tradizionale, meno di 60° per più ore

STERILIZZAZIONE CON RAGGI GAMMA

I raggi sono molto penetranti e vengono quindi usati per siringhe, aghi, guanti chirurgici e derrate

alimentari, che non possono essere sottoposti ad altro tipo di sterilizzazione.

Raggi UV: basso potere di sterilizzazione, utilizzati per sale operatorie/laboratorio/ambiente delle cappe a

flusso laminale verticale; determina rotture nella doppia elica di DNA e quindi la morte dei patogeni.

Ottima efficacia se limitato alle superfici esposte

Raggi GAMMA: Radiazioni elettromagnetiche prodotte dal decadimento di nuclei radioattivi; comunemente

si usa il cobalto 60; determinano rotture e mutazioni negli acidi nucleici sia direttamente che attraverso

radicali dell'O che si producono dalla scissione dell'acqua. L’efficacia è ottima, ma il costo elevato.

Impieghi: derrate alimentari, strumentario in plastica (siringhe, cateteri, piastre, pipette).

MODALITA’ DI AZIONE DEI PRINCIPALI FARMACI, ANTIBATTERICI ED ANTIVIRALI

Il padre degli antibiotici è senza dubbio Fleming, che li scoprì alla fine del 1920. Nel

suo esperimento, piastrò degli S. aurei in una petri con terreno solido, li incubò a 37°

e vide cresciute delle colonie. Sulla piastra era anche cresciuta un’entità più grossa,

ai lati del quali non c’erano batteri. L’entità era la muffa prodotta da penicillum

notatum: scoprì la penicillina.

Gli antibiotici sono molecole a basso peso molecolare prodotte in modo secondario

da altri organismi. Ora la maggior parte sono quasi del tutto di origine sintetica

(derivati dalla modificazione di molecole naturali).

Diversamente dagli agenti chimici disinfettanti/sterilizzanti, bloccano i pathway

metabolici oppure impediscono al batterio di sintetizzare elementi strutturali; i pathway sono assenti o

radicalmente differenti da quelli delle cellule umane ospiti.

Anche gli Ab hanno azione batteriostatica o battericida, ma di nuovo senza una distinzione netta.

- Ad AMPIO SPETTRO: contro G+ e G-; molto utilizzati perché comodi, ma velocizzano l’insorgenza di

batteri multidrug-R

- A MEDIO SPETTRO: o G+ o G-

- A SPETTRO D’AZIONE LIMITATA: specifici

È molto importante isolare l’agente microbico dopo l’infezione pere valutare il suo grado di resistenza e

sensibilità; vengono valutati MIC (minima concentrazione inibente) e MBC (minima concentrazione

battericida).

DILUIZIONI IN BRODO

La diluizione misura l’attività antimicrobica per valutare la minima

dose necessaria per diminuire il m.o. (MIC).

Da una provetta con il patogeno preparo almeno 6 diluizioni (molto

diluito; in =[] in tutte) a cui aggiungo dosi scalari decrescenti di Ab

scelte empiricamente; incubazione se torbide vuol dire che il



batterio è cresciuto e quindi la [Ab] non è necessaria per inibire.

Nelle provette limpide si considera quella a [] più bassa (ho valutato

l’attività batteriostatica).

Si preleva dalle provette limpide e poi si piastrano e si incubano.

Dove crescono colonie = allontanando il farmaco, questo smette di

agire come batteriostatico e quindi non va bene devo scegliere la piastra dove non ho colonie e quindi



la [Ab] corretta per cui non solo la crescita è inibita, ma è anche avvenuto l’effetto battericida (ho valutato

l’attività battericida).

DILUIZIONI IN AGAR/ANTIBIOGRAMMA/SAGGIO DI DIFFUZIONE/KIRBY BAUER TEST:

È il test più usato.

Ottengo una sospensione batterica con il microrganismo isolato dall’ospite. Prelevo

parte del materiale e piastro sul terreno colturale solido. Pongo dei dischetti sul terreno

in modo equidistante precedentemente imbevuti o di Ab a dosi scalari o Ab differenti.

Dopo l’incubazione (24/48h), si notano situazioni differenti: se il batterio è

molto sensibile, attorno ai dischi ci sono aloni grossi dove non sono

cresciuti batteri

(più grosso= più efficace).

E TEST

I dischetti della diluizione in Agar sono sostituiti da un’unica striscia, imbevuta con dosi

decrescenti di Ab. Se il microrganismo è sensibile si forma un alone a pera. Consente di

valutare piccole differenze di sensibilità tra una dose e l’altra.

CLASSIFICAZIONE

I farmaci si differenziano per diverse caratteristiche, come il bersaglio e la struttura.

Gli antibiotici/antivirali agiscono su vie metaboliche che portano alla sintesi di enzimi, substrati e

componenti cellulari. In particolare, inibiscono la sintesi della parete batterica (penicillina), la sintesi

proteica agendo sulle subunità maggiore o minore del ribosoma, l’integrazione del DNA batterico, o la

trascrizione dell’a. folico (B9; necessità di sintetizzarla).

SULFAMIDICI

Presentano analogia strutturale all’a. paraaminobenzoico PABA, utilizzato per la sintesi B9.

Di solito vengono somministrati con trimethoprin, che inibisce l’ultimo enzima della catena di sintesi dell’a.

folico.

Presentano alto spettro nei confronti di G+ e G- e vengono principalmente utilizzati per le infezioni del

tratto urinario.

BERSAGLIANO LA PARETE (PENICILLINA-LIKE)

Questi Ab inibiscono la sintesi della parete batterica.

Purtroppo però, tanti batteri hanno già evoluto delle penicillinasi, che rompono l’anello della

-lattamico

penicillina, che non può più lavorare.

Gli Ab legano PBP sulla superficie delle cellule batteriche, inibendo le fasi finali del processo di

-lattamici

sintesi del peptidoglicano. Alcuni batteri senza hanno sviluppato ulteriori meccanismi per

-lattamsi

impedire l’entrata dell’Ab.

Anfotericina B: bersaglia la membrana citoplasmatica batterica, creando pori e disorganizzandola; è

tossico anche per le nostre cellule

BERSAGLIANO SINTESI PROTEICA

Sono Ab come cloranfenicolo (legano la subunità maggiore del ribosoma) e le tetracicline. Quest’ultime

legano la subunità minore del ribosoma ed impediscono un corretto legame di a.a.

IMPEDISCONO LA DUPLICAZIONE DEL DNA

Chinoloni: inibiscono la DNA girasi, determinando un clivaggio permanente nel DNA.

Ciproxin/cicprofloxacin

Rifampicina: inibiscono RNA Polimerasi DNA dipendente

RESISTENZA AGLI ANTIBIOTICI

Il microrganismo diventa resistente ad un farmaco quando la concentrazione minima diventa così alta da

essere tossica per l’ospite infetto.

Certi batteri sono naturalmente resistenti, altri la acquisiscono a seguito di mutazione spontanea o

acquisizione di geniR.

Infatti, tra batteri avviene lo scambio di materiale genetico attraverso meccanismi di trasformazione,

coniugazione, trasduzione; &egr