Microbiologia medica

Microbiologia medica - Lezione 1: La cellula batterica

Introduzione alla microbiologia

Microbiologia → Branca della biologia che si occupa dello studio dei microrganismi.

Microrganismi → Tutti gli organismi normalmente unicellulari. Hanno dimensioni assai piccole e sono visibili solo al microscopio. Talora possono formare aggregati pluricellulari nei quali però tutte le cellule sono equivalenti (non si ha cioè la formazione di tessuti specializzati). In questa definizione rientrano i batteri e i protisti (miceti microscopici e protozoi).

La microbiologia comprende anche la virologia, disciplina che si occupa dello studio dei virus, un gruppo sui generis di organizzazioni biologiche capaci di esprimere il proprio potenziale biosintetico solo se inserite nei circuiti metabolici di una cellula.

Microrganismi unicellulari e organizzazioni cellulari

• Microrganismi unicellulari:
  • Batteri
  • Protisti:
    • Funghi/miceti
    • Microalghe
    • Protozoi
• Organizzazioni pluricellulari:
  • Protisti:
    • Funghi/miceti - muffe
    • Microalghe
  • Metazoi
• Organizzazioni acellulari:
  • Virus

Microrganismi procarioti ed eucarioti

Microrganismi procarioti: Batteri con un nucleo primitivo e caratterizzati da un’estrema essenzialità di strutture morfologicamente evidenti.

Microrganismi eucarioti: Protisti (miceti, microalghe e protozoi) microscopici caratterizzati da un nucleo evidente ed organizzato con un'architettura cellulare identica a quella delle cellule degli organismi pluricellulari più evoluti.

Caratteristiche principali di eucarioti e procarioti

La parete batterica

Struttura rigida che conferisce forma alla cellula e protezione da fattori esterni

• Rappresenta l’esoscheletro della cellula batterica

Peptidoglicano

• Componente fondamentale della parete batterica
• Enorme polimero formato dalla ripetizione di un’unità strutturale peculiare della cellula procariotica

Acidi teicoici

• Polimeri di alcoli polivalenti
• Altamente antigenici
• Funzione non ben definita
• Alcuni sono legati ad una porzione lipidica

Parete cellulare gram +

• Conferisce la forma
• Protegge il batterio da danni di tipo meccanico ed osmotico
• È una struttura altamente polare impermeabile a molecole idrofobiche
• Gli acidi teicoici di parete contribuiscono alla specificità antigenica delle diverse specie batteriche

Parete cellulare gram -

• Protegge il batterio da danni di tipo meccanico e osmotico
• Conferisce la forma
• Non contiene acidi teicoici
• È polare e impermeabile a molecole idrofobiche
• La componente lipidica la rende impermeabile anche alle molecole idrofiliche
• Possiede canali (porine) per la diffusione passiva di zuccheri, aa e ioni e carrier di membrana

Involucri esterni gram -

Struttura: In due foglietti tipica di tutte le membrane biologiche, ma asimmetrica.

Composizione:

• Fosfolipidi: Simili a quelli della membrana citoplasmatica, situati nel foglietto interno.
• Lipolisaccaride (endotossina o LPS): Costituisce con la sua componente lipidica la maggior parte del foglietto esterno.
• Proteine/porine/carrier: Inserite a varie altezze.
• Lipoproteine: Ancorano la membrana esterna allo strato sottostante di peptidoglicano.

Lipopolisaccaride (LPS)

• Lipide A: È un glicofosfolipide. Rappresenta la porzione idrofobica che si ancora alla membrana esterna; rappresenta il principio tossico dell'intera molecola; altamente conservato in tutti i batteri Gram-.
• Core: È un oligosaccaride a struttura costante; contiene uno zucchero a 8 atomi di C (acido chetodeossioctonoico) e uno a 7 atomi di C (eptoso).
• Catena laterale O: Polisaccaride costituito dalla ripetizione di subunità a tre, quattro o cinque zuccheri responsabili delle proprietà antigeniche delle diverse specie batteriche. Rappresenta la parte più variabile (antigene O) alla base della classificazione sierologica dei batteri Gram-.

Funzioni del rivestimento batterico

Colorazione di Gram

• Fissazione
• Cristalvioletto
• Lugol
• Decolorazione
• Controcolorazione (fucsina)

Colorazione di Ziehl-Neelsen

Evidenzia l’acido resistenza dei micobatteri e di altri microrganismi acido-resistenti. Anche se uccisi, questi batteri non sono colorabili con i normali coloranti istologici se non mediante trattamento a caldo. Una volta colorati, sono difficilmente decolorabili.

1. Stemperare la sospensione batterica al centro del vetrino portaoggetti
2. Fissare i batteri
3. Colorazione a caldo con fucsina basica
4. Decolorazione (acido solforico al 20%)
5. Lavaggio
6. Colorazione di contrasto (blu di metilene)
7. Asciugatura
8. Osservazione microscopica con obiettivo 100x ad immersione

Batteri che non presentano parete

Micoplasmi

• Classe dei mollicutes

Strutture essenziali e accessorie

Strutture essenziali: Nucleoide, membrana citoplasmatica, mesosoma, ribosomi, parete.

Strutture accessorie: Capsula (strato mucoso), appendici filiformi, pili, flagelli, plasmidi (genetica batterica), le spore (fattori di virulenza batterica).

Capsula

• Involucro esterno alla parete presente in diversi Gram+ e Gram-
• È costituita da polisaccaridi

Proprietà: Antifagocitaria, di adesione, favorisce la sopravvivenza nell’ospite, scarsamente antigenica, presente nei batteri in vivo, non sempre in vitro.

Evidenziabile mediante colorazione con inchiostro di china.

Pili/Fimbrie

• Proiezioni filiformi
• Adesione (emoagluttinazione)
• Pilo sessuale F (coniugazione)

Flagelli e ciglia

• Organelli locomotori (motilità)
• Sensori dell'ambiente
• Reazioni a nutrienti/veleni
• Chemiotassi

Endospora

• Cellula quiescente
• Si forma quando le condizioni diventano inadatte alla replicazione
• Sopravvive per tempi indefiniti
• Resistente a:
  • Alte temperature
  • Trattamenti con solventi organici
• Contiene dipicolinato di calcio
• Bacillus e Clostridium

Germinazione → Ritorno alla forma vegetativa

Postulati di Koch

I microrganismi sono di eccezionale rilevanza per la vita sulla terra. Per la maggior parte delle persone essi sono noti solo per le caratteristiche che alcuni di essi (numerosi, ma comunque una frazione minima del totale) hanno di provocare malattie.

Robert Koch fu il primo ad adottare sperimentalmente quattro regole generali per stabilire se un certo microrganismo è o meno causa di certa malattia. I postulati sono i seguenti:

1. Il presunto agente responsabile della malattia in esame deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia.
2. Deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura pura.
3. Ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano (ma suscettibile alla malattia), si riproduce la malattia.
4. Il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente.

Questi postulati, estremamente potenti per determinare se un determinato agente microbico è o meno causa di una malattia, hanno evidentemente dei limiti sperimentali quando si parla di microrganismi che sono, o si presume che siano, infettivi per l'uomo, essendo evidenti i limiti etici di una sperimentazione in tal senso.

Riproduzione della cellula batterica

Durante la duplicazione del DNA, la parete inizia ad invaginarsi.

Riproduzione asessuata: Man mano che il processo di invaginazione procede, il DNA si ripartisce tra le due cellule figlie. Il processo di invaginazione della parete procede fino alla separazione in due unità di uguale misura.

Velocità di crescita di una coltura batterica

La variazione del numero di cellule (o della massa) per unità di tempo.

• Le popolazioni batteriche in un dato intervallo di tempo raddoppiano il numero di cellule: crescita esponenziale.
• La curva di crescita batterica analizzata con spettrofotometro: misura l’assorbanza o trasmittanza di un fascio di luce che attraversa un campione in soluzione. Proporzionalità diretta tra assorbanza e concentrazione batterica in soluzione. 1 OD (600 nm) = 8x10⁸ batteri

Misurazione diretta della crescita microbica

Conta totale (conta diretta al microscopio)

• Impossibilità di distinguere cellule vive da cellule morte
• Difficoltà di individuare cellule di dimensioni molto piccole
• Inadeguatezza del metodo per sospensioni a bassa densità cellulare

Conta vitale (metodo della semina in piastra)

• Conta diretta mediante formazione di colonie su piastra
• Si definisce vitale una cellula capace di dividersi e dare origine a una progenie

Conta vitale (metodo delle diluizioni)

• Per ottenere un numero appropriato di colonie, la sospensione cellulare va diluita prima della piastratura.
• Per essere statisticamente valida, le piastre devono contenere un numero di cellule compreso tra 30 e 300.

Elementi essenziali per la crescita batterica

• C (CO₂ per “autotrofi” o C organico per “eterotrofi”), N, O₂ e ioni
• +/- O₂
• Zuccheri, grassi e proteine

Metabolismo batterico

• Catabolismo: Degradazione substrati per produrre ATP
• Anabolismo: Utilizzo ATP per sintesi componenti cellulari
• Metabolismo: Integrazione di catabolismo e anabolismo

Metabolismo del glucosio

I batteri possono produrre energia dal glucosio mediante due meccanismi differenti:

• Fermentazione (respirazione anaerobia)
• Respirazione (respirazione aerobia)

Identico risultato finale: sintesi di ATP (reazione endoergonica), ma diverso meccanismo e, soprattutto, diversa resa energetica!

Nella fermentazione, la sintesi di ATP è il risultato della fosforilazione a livello di substrato; nella via biochimica viene aggiunto un gruppo fosfato a un intermedio, che diviene un gruppo fosfato ad “alta energia” e alla fine viene trasferito all’ADP per formare ATP.

La glicolisi, detta anche via di Embden-Meyerhof, è un esempio di fermentazione. Il suo risultato è il consumo di glucosio, la sintesi di 2 molecole di ATP e prodotti della fermentazione.

Nella respirazione, la membrana citoplasmatica caricata energeticamente grazie alla forza proto-motrice, dissipa parte di questa energia nella formazione di ATP a partire da ADP e fosfato inorganico (Pi) in un processo detto fosforilazione ossidativa.

L’accoppiamento della forza proto-motrice alla sintesi di ATP avviene mediante un complesso enzimatico proteico di membrana detto ATP sintetasi.

L’ossigeno molecolare è l’accettore finale di elettroni.

La respirazione avviene in due tappe successive:

1. Nel ciclo di Krebs o degli acidi tricarbossilici, il piruvato (prodotto dalla glicolisi) viene completamente ossidato a CO₂ e H₂O liberando elettroni
2. Nella fosforilazione ossidativa gli elettroni prodotti nella tappa precedente vengono trasferiti ad un accettore finale inorganico; la liberazione di energia che si accompagna a questo trasferimento di elettroni viene utilizzata per la sintesi di ATP

Riduzione dell’ossigeno molecolare ad acqua mediante l’addizione successiva di quattro elettroni

L’ossigeno è un potente ossidante ed un eccellente accettore di elettroni nel processo di respirazione aerobia. Durante questo processo, e con la riduzione di O₂ a H₂O, si formano molecole molto reattive e altamente tossiche per le cellule.

Enzimi che agiscono sui composti tossici dell'ossigeno

Per eliminare i derivati tossici dell’ossigeno, i microrganismi aerobi hanno evoluto enzimi capaci di distruggerli. I batteri aerobi e aerobi facoltativi generalmente contengono sia la superossido dismutasi sia la catalasi, sebbene alcuni aerobi obbligati siano privi di catalasi. Invece la superossido dismutasi è indispensabile alle cellule aerobie e la sua assenza negli anaerobi obbligati potrebbe essere il motivo per cui l’ossigeno risulta essere per loro molto tossico.

È possibile distinguere m.o. aerobi, anaerobi, aerobi facoltativi, microaerofili e anaerobi aerotolleranti in base a come si distribuiscono all’interno di provette contenenti brodo tioglicolato. È stata aggiunta una piccola quantità di agar per evitare il rimescolamento; inoltre è stato addizionato un indicatore redox, rosa se ossidato e incolore se ridotto.

• (a) I mo aerobi obbligati possono crescere solo nel piccolo strato superficiale in cui l’ossigeno riesce a diffondere.
• (b) I mo anaerobi, sensibili alla presenza dell’O₂, possono crescere solo sul fondo della provetta, lontano dalla superficie.
• (c) I mo aerobi facoltativi possono crescere sia in presenza che in assenza di O₂, e quindi si distribuiscono lungo tutta la provetta.
• (d) I microaerofili crescono a distanza dalla zona maggiormente ossigenata.
• (e) Gli anaerobi aerotolleranti crescono lungo tutta la provetta. Tuttavia, la crescita non è migliore vicino alla superficie, poiché tali organismi sono capaci solo di un metabolismo di tipo fermentativo.

Gaspak per crescita anaerobi

Per eliminare ogni traccia di ossigeno dai terreni di coltura usati per gli anaerobi stretti, è possibile incubare le piastre in apposite giare contenenti sostanze chimiche che consumano l’ossigeno. La più semplice giara per anaerobiosi è costituita da un contenitore con pareti spesse e coperchio a tenuta ermetica, al cui interno viene posto il materiale da incubare.

L’aria presente nella giara è sostituita da una miscela di H₂ e CO₂ e le piccole quantità di O₂ che permangono nel recipiente sono consumate da un catalizzatore immesso nella giara stessa, ottenendo così condizioni anaerobiche.

Effetti ambientali sulla crescita microbica

I principali fattori che svolgono un ruolo fondamentale nel controllo della crescita microbica sono:

• Disponibilità di O₂
• Temperatura
• pH
• Disponibilità di H₂O e sali (NaCl)

Effetto della concentrazione di ioni sodio sulla crescita di microrganismi che hanno diversi livelli di tolleranza alla salinità. La concentrazione ottimale di NaCl per gli organismi marini, come per esempio V. fischeri, è il 3%; per gli alofili estremi è invece compresa tra il 15 ed il 30%, a seconda del microrganismo.

Lezione 2: La flora microbica residente

Microbiota umano

m.o. Liquidi biologici e distretti sterili:

• Sangue
• Liquido cerebrospinale
• Liquido pleurico
• Liquido pericardico
• Liquido peritoneale
• Liquido sinoviale
• Urina
• Sistema linfatico
• Organi interni

Meccanismi di controllo della flora microbica

Flora microbica normale

Per flora microbica normale si intendono i microrganismi normalmente associati al tessuto sano. Si trova soprattutto sulla pelle e sulle mucose (epiteli esposti indirettamente all'ambiente esterno, es. bocca, tratto gastrointestinale, app. respiratorio, ecc).

Intestino = Contiene un enorme numero di batteri, responsabile di moltissime reazioni metaboliche:

• Sintesi di vitamine (tiamine, riboflavina, pirossidina, B12, K)
• Produzione di acidi organici (acetico, propionico, butirrico)
• Produzione di enzimi (α e β-galattosidasi, α e β-glucosidasi)
• Metabolismo degli steroidi

NB: Gli antibiotici, oltre che i patogeni, inibiscono anche la flora normale → perdita dei batteri commensali -> microrganismi opportunisti (es. Stafilococco aureo, Candida albicans) che normalmente non riescono a competere con la flora normale, possono moltiplicarsi e dare malattie.

Flora normale della cute

Staphylococcus, Corynebacterium, Acinetobacter, Pityrosporum (yeast), Propionibacterium, Micrococcus