Microbiologia I

Microbiologia

Biofilm

Il biofilm consiste in una complessa architettura microbica che aderisce su una superficie biotica o abiotica. Esso fornisce la formazione di una microcomunità batterica che influenza la sopravvivenza degli organismi presenti, il loro sostentamento in condizioni di inedia e una garanzia evolutiva. Prima di verificarsi l'aggregazione, i primi microrganismi, detti colonizzatori, immersi in un fluido in forma planctonica, fanno contatto con la superficie tramite interazioni di Van der Waals e altre interazioni elettrostatiche. In un secondo momento, questi prendono contatto diretto con essa tramite l'espressione di adesine di superficie che consentiranno anche l'aggregazione cellula-cellula.

Una volta aderiti alla superficie, passano allo stato sessile in cui si ancorano fermamente alla superficie apportando cambiamenti fenotipici indotti dal quorum sensing, in cui si riscontrano segnali di quiescenza mediante molecole autoinduttrici che nei batteri Gram – sono dati dall'omoserina lattone acetilata (AHLS), mentre nei Gram + da un oligopeptide che si diffondono in tutta la biopellicola e nelle cellule circostanti. In questo stadio si assiste a una forte produzione di autoinduttori che si intensifica sempre di più proporzionalmente all’aumento della densità cellulare; raggiunta la massima densità consentita (quorum), gli autoinduttori interagiscono con i recettori cellulari e modulare l'espressione genica e i batteri maturi si eradicano dalla biopellicola per colonizzare una zona più favorevole alla crescita.

I biofilm che si accrescono su piccole superfici hanno una bassa resistenza alla trazione e si rompono facilmente, al contrario quelli che si instaurano sulle superfici estese sono molto solidi e possono mantenersi integri anche in presenza di flussi continui, siano essi naturali (quelli a cui sono sottoposte le valvole cardiache) o artificiali (come quelli presenti negli impianti idraulici).

In quiescenza viene prodotto uno zucchero detto esopolisaccaride (EPS), la materia prima del biofilm, che per la presenza di polisaccaridi acidi, neutri e amminozuccheri favorisce la stabilizzazione della struttura ed è in grado di associare ioni metallici, cationi divalenti e altre macromolecole, come proteine, DNA, lipidi e acidi umici. Inoltre, queste componenti cariche causano un’elevata idratazione della struttura, prevenendo, in tal modo, l’essiccamento e formando un ambiente idoneo al passaggio di nutrienti, molecole segnale, acqua (grazie alla presenza di acquaporine), O₂ e anche materiale genetico utile per l’acquisizione di resistenze ad antimicrobici e batteriofagi. Esistono anche canali verso la periferia per il rilascio di materiale di scarto ed esotossine.

Il DNA che viaggia libero all’interno dell’EPS deriva molto spesso da batteri presenti negli strati più profondi della biostruttura che si sono lisati a causa della mancata ossigenazione e può entrare in altre cellule e ricombinarsi con altri genomi per mezzo della trasformazione, coniugazione e trasduzione. Queste complesse architetture possono trovarsi in due varianti: monospecie e multispecie. I primi sono utilizzati ad esempio da P. aeruginosa ma la maggior parte dei biofilm presenti sono rappresentati da quelli multispecie poiché forniscono un maggiore sostegno in quanto, grazie alla diversa natura dei componenti cellulari, vi è una maggiore cooperazione tra specie. Esempi di biofilm multispecie sono rappresentati dalla placca dentale (in cui troviamo lo S. mutans e S. sanguis), la flora batterica intestinale e del tratto urogenitale.

Azione della lattoferrina

La lattoferrina, appartenente alla famiglia delle transferrine, è una glicoproteina, presente nel latte e nelle secrezioni, prodotta dai neutrofili ed è in grado di chelare due ioni ferrici per molecola e presenta anche molti domini cationici. Grazie alla sua natura si presenta come una proteina multifunzionale che: protegge le mucose dall’ingiuria di batteri e virus, induce in apoptosi, inibisce l’adesività e l’invasività microbica, inibisce l’infezione di virus con e senza rivestimento. Con i suoi siti di legame per il Fe³⁺, materiale fondamentale per la vita batterica, impedisce alla maggior parte dei microrganismi di sopravvivere, replicarsi e aderire alle superfici nascondendo gli ioni; inoltre i suoi domini cationici promuovono la citolisi batterica in seguito al legame con i LPS della membrana batterica esterna, negativi, che si combinano con il lisozima che scinde il peptidoglicano.

Previene inoltre l’adesione di virus come Herpes Simplex e HIV grazie alla sua capacità di legarsi ai GAG della membrana plasmatica. Se viene somministrata per via orale in pazienti con carenza di ferro, quest’ultimo, accumulato nei tessuti, viene prelevato dalla glicoproteina e riportato in circolo. Pertanto modula il metabolismo del ferro interagendo con l’epcidina e la ferroportina, le due più importanti proteine coinvolte nell’omeostasi sistemica del ferro.

Disinfezione e sterilizzazione

Per impedire la trasmissione di agenti infettivi tramite strumenti di lavoro, oggetti e personale vengono utilizzate particolari procedure in grado di eliminare la flora microbica contaminante le superfici interessate; tali procedure si sostanziano nella disinfezione e nella sterilizzazione. Per disinfezione intendiamo la pulizia da germi potenzialmente patogeni, mentre la sterilizzazione è correlata all’uccisione di tutta la flora presente sulle superfici, comprese le spore.

A tal proposito quando si ha a che fare con antisettici si tende a ridurre la carica microbica potenzialmente patogena direttamente sull’epidermide; l’asepsi, invece, comprende procedure atte al mantenimento dello stato microbiologico presente. Le infezioni ospedaliere (nosocomiali) hanno la più alta incidenza nei reparti di terapia intensiva e sono un fenomeno diffuso. Tra le misure da adottare possiamo ricordare: la necessità di una sorveglianza attiva, l’aumento delle misure d’igiene personale e ambientale, con particolare riguardo al lavaggio delle mani del personale sanitario, ma anche una corretta gestione del paziente che se necessario deve essere rapidamente isolato.

Tra i responsabili di questi tipi d’infezione possiamo elencare alcuni batteri multiresistenti come S. aureus, P. aeruginosa, E. coli e Acinetobacter baumannii.

La disinfezione si ottiene mediante l’impiego di adatte concentrazioni di particolari sostanze chimiche atte all’uccisione di microrganismi patogeni su superfici od oggetti (disinfettanti) o su tessuti e mucose umane o animali integre o danneggiate (antisettici). I disinfettanti mostrano una diversa efficienza in base al tipo di agente target: solitamente hanno un’alta efficienza contro i micobatteri, le spore e i virus proteici, una media azione contro funghi, lieviti e alghe e una bassa efficienza contro batteri e virus lipidici (HIV, HCV, ...).

• Denaturanti proteici: gli alcoli hanno un’azione diretta sulle proteine di membrana e citoplasmatiche ma se viene utilizzato l’alcol puro (100%) l’azione sarà minima se non del tutto inefficace su virus, spore e miceti e provoca disidratazione; le aldeidi, come la glutaraldeide e la formaldeide, sono molto efficienti su superfici e ferri ma sono pericolose per la loro tossicità (sono in grado di legare anche gli acidi nucleici); molti iodo-derivati, come la tintura di iodio, Betadine, Braunoderm e Iodosorb, sono utili a tal proposito in quanto formano sali con le proteine alterandone la struttura e impedendo la replicazione cellulare; anche i metalli pesanti (mercurocromo - antisettico cutaneo -, mertiolato, nitrato d’argento – per oftalmia gonococcica -, solfato di rame –forte antifungino -), data la loro instabilità, tendono a legare le proteine e a denaturarle; la glutaraldeide, l’ossido d’etilene, l’acqua ossigenata e i Sali d’argento scindono i gruppi sulfidrilici delle proteine.
• Ossidanti: molto forti i perossidi (acqua ossigenata per cute e ozono per acque contaminate) poiché sviluppano molto ossigeno; i composti del cloro (amuchina 10-1,5-0,01%, euclorina, ipoclorito di sodio, varechina) utilizzati per superfici, cute, alimenti e bende, bloccano il ciclo energetico della cellula, sono molto efficaci per la loro azione rapida ma corrosivi, irritanti e inefficaci su micobatteri e spore e sono inattivati da sostanze organiche e pH elevati.
• Denaturanti delle membrane: gli alcoli e i fenoli (fenolo, cresolo ed esaclorofene) riescono ad alterare la conformazione delle membrane titolando le proteine che le compongono e per solubilizzazione di lipidi; tensioattivi potenti come i sali dell’ammonio quaternario, come Lysoform, Bergamon, cloruro di benzalconio, citrosil, germozero, benzogen, che posseggono una media azione e sono inattivati facilmente con trattamenti con sapone.

Neomercurocromo è più sicuro in quanto non sono presenti i metalli pesanti del composto originale ma è costituito principalmente da: cloroxifenolo, battericida ad ampio spettro che disinfetta rapidamente la zona trattata, eosina, batteriostatico ad attività cicatrizzante che si fissa sulla lesione proteggendola per lungo tempo da una possibile infezione, glicole propilenico, che favorisce la penetrazione attraverso la cute dei principi attivi ed esplica un potere battericida ed antifungino. L’amuchina ha sviluppato un processo di produzione elettrolitico, con materie prime e con un controllo qualità di livello farmaceutico; inoltre, l’ipoclorito di sodio allo 0,05% è un agente antimicrobico che assicura al prodotto stabilità e ha un ampio spettro d’azione contro virus, funghi e batteri.

Sterilizzazione

La sterilizzazione può avvenire mediante due tipi di strumentazione: mezzi fisici e mezzi chimici.

Mezzi fisici

• Fiamma diretta: avviene tramite il becco Bunsen da cui proviene una fiamma costituita da metano e ossigeno formata da più fasce, che vanno dai 300 ai 1500°C, che si alternano ossidanti (soprattutto all’esterno in cui abbiamo la zona di fusione e all’interno in cui si trova la prima fascia ossidante dei 300°C) e riducenti (all’interno).
• Calore umido: l’autoclave tiene il materiale da laboratorio in una cella a pressione di vapore saturo a 1 atm, a 121°C per 15’. A questa temperatura l’acqua bolle e viene trasformata in vapore che ha una buona conducibilità termica e un’ottima penetranza.
• Calore secco: viene utilizzato il forno Pasteur in cui vengono sterilizzati strumenti vitrei e metallici per mezzo di ventilazione ad aria forzata a 180°C per 1 h.
• Radiazioni: vengono sottoposti i materiali sotto raggi gamma (per lo più plastiche, fili di sutura…) e raggi UV, che sono dei potenti mutageni (i raggi UVB, con una lunghezza d’onda di 290-320 nm, hanno un maggior potere di penetrazione).
• Filtrazione
• Microonde: spesso non utilizzate in quanto non scaldano oltre l’ebollizione e quindi poco efficaci.

*La pasteurizzazione, eseguita principalmente sugli alimenti, consiste nell’innalzamento temporaneo della temperatura dell’alimento e il suo successivo rapido raffreddamento al fine di eliminare germi potenzialmente patogeni, ad eccezione delle spore, senza alterare i suoi valori nutrizionali.

Mezzi chimici

• Vapori di formaldeide od ossido d’etilene a caldo: utilizzati per strumentazione medica e filtri HEPA; costituiscono degli agenti alchilanti che presentano un’azione lenta, poco penetrante e sono altamente tossici e bisogna areare l’ambiente in seguito all’utilizzo. Altri vapori utilizzati sono fortemente ossidanti: ad esempio acido peracetico, cloro molecolare e acqua ossigenata che unita a un campo magnetico forma il plasma che libera radicali, molto reattivi, che attaccano i microorganismi presenti (utilizzata per materiali termosensibili e non lascia residui tossici).
• Acidi e basi concentrate: le più utilizzate sono formalina 37% e glutaraldeide (potenti alchilanti).

Biomateriali e biosensori

Durante la conta batterica solitamente un microbiologo si avvale dell’enumerazione delle cosiddette unità formanti colonia (CFU) che corrispondono a un valore approssimativo della flora microbica aderente su un materiale (1 CFU per essere visibile deve contenere almeno 10⁷ batteri). Per una conta molto più accurata vengono utilizzati macchinari specifici, come il Biotimer, che sono suscettibili a parametri specifici dei batteri presenti (sia che siano liberi, adesi, aggregati o formanti biofilm).

Il biotimer assay (BTA) è un biosensore che basandosi su curve standard specifiche per ogni genere batterico riesce ad enumerare i microrganismi presenti mediante il controllo di cambiamenti inerenti al metabolismo microbico. I batteri viventi rilasciano uno o più metaboliti che inducono un cambiamento di colorazione della soluzione in cui sono immersi per via di reattivi specifici che risultano indicatori interagenti con particolari prodotti metabolici; il tempo di viraggio degli indicatori è inversamente proporzionale al numero iniziale di batteri viventi presenti nel campione a tempo 0. I due principali indicatori selezionati e aggiunti a specifici reagenti di BTA sono il rosso di fenolo (BT-PR) per contare i batteri fermentanti e la resazurina (BT-RZ) per quelli non fermentanti. Il primo risulta rosso dopo la sterilizzazione, ma vira verso il giallo in presenza di batteri vivi; BT-RZ, invece, è blu dopo la sterilizzazione, ma vira verso il rosa in presenza di batteri. Per costruire le curve di correlazione le diluizioni di entrambi i tipi batterici citati in forma planctonica vengono contati in CFUs e usati per inoculare i reagenti (BT-PR e BT-RZ). I reagenti inoculati, in seguito, sono incubati a temperature appropriate e il colore viene monitorato. In questo modo, il tempo di viraggio viene registrato e correlato al numero di CFU.

L’elettrodo di Clark consiste in un dispositivo elettrochimico, con un catodo di Pt e un anodo di Ag/AgCl (dV=600-800 mV), rilevatore della concentrazione di ossigeno disciolto all’interno dei fluidi biologici che viene chiuso in fondo da una membrana di un polimero permeabile ai gas.

Un metodo per determinare la suscettibilità batterica agli antibiotici (in particolare conoscere la MIC dei diversi microrganismi) è costituito dal Calgary biofilm device (CBD). Consiste in un contenitore composto da due parti fondamentali: la parte superiore costituisce un coperchio con 96 aghi, sigillato superiormente in modo da poter rimuovere gli aghi senza aprire il dispositivo evitando eventuali contaminazioni. I picchetti possono alloggiare su alcuni canali scavati in pozzetti del componente inferiore; queste canalizzazioni serviranno per far scorrere i batteri che formeranno il biofilm nei siti dei picchetti. Per favorire la crescita batterica e la formazione dei biofilm si utilizza un terreno ricco di saccarosio e vengono lasciati incubare per 12-18 h. In seguito alla sonificazione degli aghetti e sottoposti alla conta batterica su piastre Petri: a tal punto si può testare la loro MIC attraverso il trattamento con antibiotici procedendo con l’incubazione delle piastre CBD a 35°C per una notte; a fine trattamento la copertura viene rimossa e le piastre, risciacquate in un ponte salino fosfato, posizionate in una seconda brodocultura a 96 pozzetti, ripetendo l’operazione descritta prima e eseguire nuovamente la conta batterica finale per determinare il viraggio del conteggio stabilendo la MBEC (minimal biofilm eradicating concentration). Il MIC (minimal concentration) è determinato dalla misurazione della torbidità a 650 nm delle piastre CBD dopo l’incubazione sotto antibiotici per 24 h.

Per la conta batterica possiamo utilizzare anche dei metodi diretti come la microscopia a fluorescenza marcando con fluorocromi differenti i batteri distinguendo i vivi dai morti: i coloranti più utilizzati sono il SYTO9 per la colorazione dei batteri vivi e lo ioduro di propidio per quelli morti. Il primo consiste in un colorante cationico lipofilico che penetra attraverso le membrane evidenziando i microrganismi con una fluorescenza verde; il secondo consiste in un colorante anionico che non penetra all’interno delle membrane e marca i batteri solo se le membrane vengono danneggiate con una fluorescenza rossa.

Meccanismi d’invasione intracellulare

Esistono due tipi di meccanismi principali: zipper e trigger. Nel primo meccanismo l’entrata del batterio (es. Listeria, Yersinia…) è promossa dall’interazione tra le adesine batteriche e alcune molecole di superficie delle cellula ospite; l’interazione attiva le vie del segnale della cellula portando al riarrangiamento dell’actina. Questo processo è mediato da alcune proteine di superficie batteriche, le invasine, che si legano alle beta-integrine della cellula ospite che portano alla polimerizzazione di actina, portata avanti dall’internalina B.

Il secondo meccanismo è dato da un complesso proteico definito sistema di secrezione III: questo macchinario, simile a un pungiglione, permette l’entrata dei fattori molecolari che portano al riarrangiamento actinico. La secrezione è preceduta dall’espressione dell’intimina sulla membrana del batterio (es. Salmonella, Shigella, EPEC…) che si lega al suo recettore (Tir), indotto ad esprimersi dai principi escreti dal fattore di secrezione III, sulla membrana della cellula ospite stabilizzando l’adesione.

Bioterrorismo

Il bioterrorismo consiste nell'utilizzo intenzionale di agenti biologici (virus, batteri o tossine) in azioni contro l'incolumità pubblica quali attentati, sabotaggi, stragi o in minacce volte a creare panico e isteria collettiva. Gli agenti biologici utilizzati possono essere reperiti in natura, o possono essere modificati dall'uomo al fine di aumentarne il potere distruttivo, la virulenza o la diffusione nell'ambiente. Quest'ultima può avvenire attraverso l'aria, l'acqua, il cibo o le bevande.

Il CDC statunitense (Centers for Disease Control and Prevention) suddivide gli agenti bioterroristici in categorie in base al loro potenziale di minaccia.