Microbiologia Generale e Biotecnologie Microbiche - Appunti

1865 - Mendel

Griffith

“Principio trasformante”

1944 - Avery

“Il DNA è il materiale genetico”

• In realtà ancora dubbi se materiale genetico era DNA o proteine

1952 - Hershey + Chase

Dimostrazione definitiva che il DNA è il materiale genetico Negli studi di genetica sempre utilizzato il fago come organismo modello negli esperimenti

XX secolo - Archibald Garrod

Alcune malattie metaboliche umane sono causate dall'assenza di alcuni enzimi Beadle e Tatum

• Esperimenti su Neurosopora: “Un gene, un enzima”

1953 - 1960 - Benzer

Fago T4 E.coli B E.coli K

• Selvatico Piccola Piccola
• rII Grandi Nessuna

Benzer dimostrò che il mutante rII, pur presentando lo stesso fenotipo, non era causato da mutazioni di un singolo gene Infettando una stessa cellula (K12) con due fagi rII osservò la formazione di placche Questo voleva dire che le due mutazioni rII non riguardavano lo stesso gene ma erano su geni diversi e ciò causava una complementarietà di questi I cistroni A e B di Benzer rappresentano i due geni separati del singolo locus rII Una co-infezione con due fagi mutati rII entrambi, nel cistrone A ma in punti diversi, può avvenire un evento di ricombinazione che permette la formazione di un fago normale e di uno portante entrambe le mutazioni Tramite tale esperimento Benzer definì l’unità minima di ricombinazione (quiver, un nucleotide)

Approccio genetico

Metodo scientifico irrinunciabile

1. Forward: Fenomeno

• Mutanti
• Fenotipo
• Gene
• Ipotesi
• Verifiche

2. Reverse: Fenomeno

• Ipotesi
• Gene
• Mutazione
• Fenotipo

Materiale genetico cellula batterica

Nucleoide

Citoscheletro eucariotico è costituito da:

• Microtubuli
• Microfilamenti (actin-like)
• Filamenti intermedi

• In realtà anche nei procarioti esiste il citoscheletro:
  • La scoperta è avvenuta mediante approccio genetico: la mutazione di una specifica proteina (MreB) causa un cambiamento morfologico → tale proteina permette una struttura a bastoncello. La sua mutazione causa una struttura sferica.
  • MreB (actin-like): polimerizza e depolimerizza con ATP
  • MapZ
    • Gene (muscolo che entra stamattina)
    • Proteina (militare che entra stamattina)
  • MreB proteina di E. coli, Mbl proteina in B. subtilis
  • MreB → Mbl: stessa proteina (actin-like)
  • ParM: Partizione SIPs ribartizione per cui singoli separati nucleoli

CresS

• If:la crescentina è un esempio di filamenti intermedi nei batteri:
• La formazione di tali filamenti avviene senza consumo di energia
• La crescentina è localizzata nella regione con più ampia curvatura batteri (costituisce una sorta di spina dorsale)

FtsZ → tubulin-like (anello)

• FtsZ forma un anello nel punto esatto in cui la cellula si dividerà da tubulina. Questo anello FtsZ è molto importante nella divisione cellulare
• FtsZ (come la tubulina) utilizza GTP per polimerizzazione
• FtsZ non forma estroflessioni come la tubulina

Divisione cellulare nei batteri

• I batteri si dividono per scissione binaria
• In realtà i microrganismi adottano diverse modalità di divisione (scissione binaria è un modello di riferimento)
• Alcuni batteri si dividono per gemmazione come i lieviti; altri adottano una gemmazione con formazione di miceli
• La scissione binaria è ineguale in alcuni batteri: una cellula è sessile, l'altra è dotata di recettore e flagello
• Un altro tipo di divisione, simile alla scissione binaria, comporta la formazione di una cellula figlia completamente nuova e una cellula identica alla cellula madre

Crescita batterica

1. Fase pre-esponenziale
2. Fase esponenziale
3. Fase stazionaria
4. Fase post-tarziva

N_t = N₀ 2^t/d

Dal grafico di crescita è possibile evincere il tempo che intercorre tra una divisione e l'altra. Tuttavia nonostante ogni batterio possieda il suo periodo di divisione, questo può essere variabile in funzione di parametri come la temperatura, pH, nutrienti ecc.

Mutanti di FtsZ

Produzione batteri con strutture filiformi

• Tutti descritti lineari senza setti fts (filamenting temperature sensitive)
  • A: batteri lineari senza setti!
  • B: gli stessi che non si dividono
  • C: batteri lineari con setti iniziali
  • D: batteri con formazione minorata

Tramite questi mutanti, è stato possibile ordinare le proteine coinvolte

Tutti questi mutanti sono temperatura-sensibili

• 30°C: temperatura permissiva (wild-type)
• 42°C: temperatura non permissiva (mutante)

REGOLAZIONE DELL'INIZIO DELLA REPLICAZIONE (FIRING):

• TITOLAZIONE DELLA FORMA LISCIA NELLA PROTEINA DNA A IN PARTE DEL SITO datA
• REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE DI DNA
• SEQUESTRO DELL'ORIGINE DI REPLICAZIONE DA PARTE DELLA MEMBRANA DI SeqA
• REJUVENATION DEGLI ATP MEMBRANI MEDIATO
• INATTIVAZIONE REGOLATI VA DI DnaA (RIDA)

MODELLO DEL SEQUESTRO DELL'ORIGINE

• REGIONE oriC RICCA DI SEQUENZE GATC CHE POSSONO ESSERE METILATE
• REPLICAZIONE SEMICONSERVATIVA DETERMINA DNA NEOMETILATO: IL SITO EMIMETILATO NEL GENOMICO VIENE LIMITATO IN ~1.3' QUELLO DELLA REGIONE oriC IMPIEGA ~12'-13'
• QUESTO RITARDO È DOVUTO AL LEGAME DI QUESTA REGIONE DELLA PROTEINA SeqA

➢ Seq A QUANDO LEGATA AL DNA EMIMETILATO INTERAGISCE CON LA MEMBRANA

- Seq A TASCINA DNA EMIMETILATO ALL'INTERNO DELLA MEMBRANA, DOVE dna NON PUÒ ACCEDERE

➢ A QUESTO MODELLO VA AGGIUNTA L'OSSERVAZIONE CHE IL GENE dnaA NON VIENE ATTIVAMENTE TRASCRITTO QUANDO IL DNA DEL SUO PROMOTORE SI TROVA IN UNO STATO EMIMETILATO

➢ QUANDO IL DNA METILATO LA PROTEINA DnaA SI AUTOREPRIME

➢ DnaA INTERAGISCE CON LA MEMBRANA: A SECONDA DELLO STATO DELLA MEMBRANA SI

- STABILIZZA IL LEGAME ATP-DnaA ADP-DnaA

• MEMBRANA RICCA DI FOSFOLIPIDI BASICI ADP DnaA -> NO REPLICAZIONE
• MEMBRANA RICCA DI FOSFOLIPIDI ACIDI ATP DnaA -> SÌ REPLICAZIONE

- QUESTO PERCHÈ REPLICAZIONE CELLULARE È ACCOMPAGNATA DA SINTESI DI MEMBRANA CELLULARE (IN PARTICOLARE FOSFOLIPIDI ACIDI)

➢ IL CONTROLLO R.I.D.A (REGULATORY INACTIVATION OF DnaA) MANTIENE L'INNESO DELLA REPLICAZIONE DOPO CHE QUESTA È INIZIATA E “SMONTA” IL FORCINE

TERMINAZIONE DELLA REPLICAZIONE

• IN GENERALE LA REPLICAZIONE TERMINA CON LA COLLISIONE DELLE DUE FORCHE REPLICATIVE
• SONO STATI INDIVIDUATI DEI SITI DI TERMINAZIONE DENOMINATI ter, LE PROTEINE CHE SI LEGANO AI ter FRENANO IL PROCEDERE DELLA FORCA REPLICATIVA INTERAGENDO CON ELICECASE
• I SITI ter SONO DISPOSTI IN UN CLUSTER (10 IN E. COLI)
• FUNZIONANO IN MODO UNIDIREZIONALE

- I SITI ter HANNO SEQUENZE IN PARTE CONSERVATE MA NON PALINDROMICHE; LA PROTEINA TUS CHE LI LEGA HA SITO TER ASIMMETRICA, LE PROTEINE SI ORIENTANO IN MODO OPPOSTO A SECONDA DELLA DIREZIONE DELLA FORCA REPLICATIVA

- LA FORCA REPLICATIVA PROCEDE INCONTRANDO LA PROTEINA TUS DISPOSTA IN SENSO CONTRARIO () BLOCCANDOSI SOLAMENTE IN PRESENZA DELLE PROTEINE TUS ORIENTATE CORRETTAMENTE

- QUESTO SUCCEDE PER ENTRAMBE LE FORCHE: FUSIONE DELLE DUE FORCHE

- CIASCUNA ELICASE LEGATA UTILIZZA L'ENERGIA DELL'ATP PER COMPIERE LA SUA FUNZIONE

➢ OGNI SUBUNITÀ PRESENTA UN SITO DI LEGAME PER L'ATP

• - OGNI SUBUNITÀ È LEGATA AD DUE E CIASCUNA DI ESSE PUÒ LEGAE ADP, ATP O NULLA
• - QUELLA CHE LEGA ATP VA HA DI FRONTE UN'ALTRA CHE LEGA ATP ECC

➢ L'AZIONE SEQUENZIALE DI CIASCUNA SUBUNITÀ PERMETTE UNA ROTAZIONE CICLICA IN CUI CIASCUNA SUBUNITÀ LEGA IN UN DETERMINATO ISTANTE UNA SPECIFICA MOLECOLA