Microbiologia generale

Lezione 1 - Introduzione

Tra i microrganismi (da qui in poi m.o.) ci sono strette relazioni: si aiutano tra loro o si inibiscono. La microbiologia influenza molto la nostra vita. I microrganismi vengono utilizzati anche nella produzione industriale, pensiamo all’acetone, oppure nella produzione di farmaci come gli antibiotici. Sono le prime forme viventi comparse sulla Terra. Sintetizzano molecole a partire dai componenti dell’atmosfera. I primi batteri furono quelli fototrofi, i cianobatteri che hanno prodotto l’ossigeno. Sono stati scoperti grazie a reperti fossili di batteri. Nel 1600 sono stati osservati per la prima volta con i primi microscopi creati per osservare le trame delle stoffe. Si pensava che gli insetti e i m.o. potessero alterare gli alimenti e che procedessero ad una generazione spontanea.

Nel 1805 Appert scoprì che se gli alimenti deperibili fossero stati posti in un barattolo chiuso e sottoposti a calore, avrebbero potuto essere stabilizzati, cioè i m.o. venivano uccisi e distrutti. Nel 1860 Pasteur osservò che il vetro con il calore poteva piegarsi ma che i cibi posti all’interno di contenitori di vetro restavano sterili. Se invece entrava aria, i liquidi all’interno si intorpidivano. Con il calore si riusciva a conservare gli alimenti per un certo periodo di tempo.

Le spore sono più resistenti rispetto alle cellule vegetative e si trasformano nuovamente in cellule non appena vengono ricostituite le condizioni favorevoli e quindi germinano. Le spore sono una forma di resistenza prodotte dalle cellule bicocche. Proprio con l’obiettivo di distruggere anche le spore, Tyndall mise a punto il cosiddetto riscaldamento frazionato, con ripetizioni successive di riscaldamento e raffreddamento. La sterilizzazione frazionata è ancora oggi anche detta tindalizzazione e si applica a una temperatura di 90-100 °C ripetuta per 3 volte in giorni consecutivi per una sterilizzazione totale degli alimenti, soprattutto di quelli termolabili che non possono essere sottoposti a temperature superiori ai 100 °C. La sterilizzazione classica avviene a una temperatura di 121 °C.

A fine 1700 venne messo a punto il primo vaccino, ottenuto da bovini malati di vaiolo. I medici con le mani potevano contaminare le partorienti e le infettavano perché si occupavano di tutti i malati. A fine 1800 Koch osservò le prime cellule con i microscopi che non ingrandivano molto ma potevano essere apprezzate le colonie di cellule. Zeiss inventò poi le prime lenti e nel 1930 venne messo a punto il microscopio elettronico con il quale era possibile vedere la struttura della cellula microbica, vedere al suo interno.

Non tutti gli alimenti permettono il proliferare dei m.o. per le loro caratteristiche e vengono definiti non permissivi anche se in essi sono stati rilevati batteri quali la Salmonella. Nel 1997 si sono osservati per la prima volta i prioni, residui di proteine senza una vera e propria cellula che possono essere anche patogeni. Sono stati responsabili della BSE - encefalopatia spongiforme bovina (morbo della mucca pazza). Il Clostridium botulinum sviluppa una tossina che provoca neuropatie e va a bloccare l’impulso nervoso trasmesso dall’acetilcolina, un neurotrasmettitore. Nel caso delle mozzarelle blu, è stato dimostrato che i responsabili sono m.o. che in presenza di ossigeno rilasciano un colorante. Batteri appartenenti al genere Listeria sono spesso presenti negli alimenti surgelati.

La cellula

La cellula è l’unità funzionale fondamentale più piccola degli esseri viventi. Si può osservare al microscopio ottico. Per vedere gli organelli interni alla cellula invece serve il microscopio elettronico. La cellula è compartimentata, è un sistema fisicamente chiuso ma aperto da un punto di vista metabolico. Le componenti chimiche sono le macromolecole. La tipologia di queste molecole cambia da cellula a cellula. Le cellule tra loro scambiano molecole con l’esterno e informazioni comunicando tra loro tramite segnali chimici. Le cellule si evolvono e vanno incontro a modificazioni del codice genetico. Queste sono caratteristiche comuni a tutte le cellule. Ma le cellule si differenziano per altri caratteri. Ad esempio, le endospore sono tipiche dei m.o. e prodotte solo da questi. Alcune cellule possono muoversi, altre no.

Distinguiamo i procarioti (nucleo “primitivo”) di cui fanno parte i batteri, dagli eucarioti (nucleo “fatto bene”) in cui sono ricompresi i miceti (lieviti e muffe) e i protozoi. I virus sono invece acellulari, non hanno una membrana che racchiude il nucleo come i prioni. Procarioti sono soltanto i batteri di cui fanno parte anche gli Archea. Tra la cellula procariote e quella eucariote cambia sicuramente il citoplasma, cambiano le proteine, gli acidi nucleici e i carboidrati. I batteri hanno bisogno di nutrienti per produrre energia. La cellula eucariote è molto più complessa rispetto alla procariotica ed è molto più grande. Ai m.o. è utile essere piccoli anche se esiste un limite dimensionale critico al di sotto del quale non possono andare. Le cellule batteriche hanno una membrana citoplasmatica, il citoplasma, il materiale genetico che comunque occupano uno spazio che deve essere garantito. Quando parliamo di m.o. utilizziamo come unità di misura i micrometri, µm (10^-6 m). Il m.o. più grande ha una lunghezza di 800 µm. I micoplasmi invece hanno dimensione minima, 0,3 µm di diametro, perché non hanno la parte esterna e possono essere anche patogeni.

Procarioti

Il codice genetico non è racchiuso in una vera e propria membrana, non hanno nucleo né nucleolo né gli altri organelli circondati da membrana come negli eucarioti. Nel citoplasma dei procarioti troviamo solo le strutture minime. Gli unici organelli del citoplasma sono i ribosomi che si trovano liberi in esso senza essere associati al reticolo endoplasmatico. Il DNA è raggomitolato in una zona non circondata da membrana detta nucleoide e si presenta come cromosoma in forma libera non stabilizzato da istoni, che troviamo invece negli eucarioti. Alcuni m.o. hanno un ulteriore involucro esterno oltre la membrana citoplasmatica ed è la parete cellulare composta da peptidoglicano, un polimero che troviamo soltanto nei procarioti. Alcuni batteri presentano poi anche strutture accessorie. I procarioti si riproducono per scissione binaria e non tramite mitosi come gli eucarioti. La membrana citoplasmatica dei procarioti è più complessa rispetto a quella eucariotica in quanto è deputata alla produzione di energia data la mancanza di organuli specifici dediti a tale funzione. Contiene enzimi e funge da sito di ancoraggio per ribosomi e flagelli.

Eucarioti

Sono cellule più complesse e più grandi di quelle procariotiche. Il materiale genetico è racchiuso in un nucleo circondato da membrana e particolari proteine, dette istoni, stabilizzano il DNA. All’interno del citoplasma troviamo sia ribosomi associati al reticolo endoplasmatico, sia ribosomi associati ai mitocondri e ai cloroplasti, che sono gli organelli deputati alla produzione di energia. I ribosomi associati a questi organelli hanno un coefficiente di sedimentazione di 70S come i ribosomi delle cellule batteriche. Da queste analogie si è sviluppata la teoria endosimbiotica secondo la quale cloroplasti e mitocondri erano un tempo cellule procariotiche inglobate poi in cellule più grandi che si sono poi evolute in organuli della cellula eucariotica.

Differenze tra i vari m.o.

Tra i batteri, cellule procariotiche, distinguiamo due domini: gli Archea, di interesse ambientale, e gli Eubatteri, di interesse alimentare e che noi studiamo. Per comodità li chiameremo soltanto batteri. I batteri sono unicellulari; si riproducono per scissione binaria; sono eterotrofi, cioè si nutrono di composti organici che altri organismi producono; alcuni di essi sono fotosintetici; sono dotati di parete cellulare composta da peptidoglicano.

I miceti sono m.o. eucarioti, possono essere unicellulari come i lieviti o pluricellulari come le muffe, dette anche miceti filamentosi. Sono dotati di parete cellulare ma questa non è composta da peptidoglicano, bensì da polisaccaridi come la chitina e il glucano. Si riproducono tramite spore, per via sessuata o asessuata. In genere i lieviti si riproducono per gemmazione. Hanno alimentazione eterotrofa. Le muffe sono pluricellulari e presentano cellule differenziate mentre i lieviti sono unicellulari a forma di cocchi o di bastoncelli.

I protozoi sono m.o. unicellulari, eucarioti, non hanno parete cellulare e quindi hanno forma indefinita. Sono mobili grazie al fatto che possiedono strutture accessorie. Sono eterotrofi, spesso patogeni. Ad esempio sono causa della malaria.

Le alghe sono m.o. eucarioti, in genere unicellulari, sia mobili che immobili. Hanno parete cellulare ma composta da cellulosa. Vivono sia in acqua che sul suolo. Possono essere patogene perché producono neurotossine. Producono tuttavia anche polimeri sfruttati nell’alimentazione umana come ad esempio le carragenine.

I virus sono acellulari con la struttura quasi interamente costituita da un acido nucleico (RNA o DNA) e proteine. A volte sono presenti anche lipidi ed enzimi. Sono parassiti obbligati, talvolta provvisti di envelope, cioè uno strato lipidico esterno.

I cianobatteri sono procarioti che effettuano fotosintesi. Possono essere tossici perché producono tossine, le cianoginosine e possono contaminare le acque.

Lezione 2 - Morfologia della cellula batterica

Per quanto riguarda le dimensioni della cellula batterica, queste dipendono dal volume dei componenti e non si può andare al di sotto di una certa dimensione, definita limite dimensionale critico. I batteri hanno forme differenti, la più comune è quella coccica, cioè sferica; può essere però anche allungata a bastoncino e questi batteri sono detti bacilli; oppure possono essere bastoncini ricurvi detti spirilli. Cocchi e bacilli quando si dividono, si sdoppiano. A seconda del piano di divisione possiamo osservare altre forme. Conoscere la forma dei batteri serve soprattutto per l’identificazione dei m.o. Possiamo escludere cosa non è. Quando parliamo di forma parliamo anche di come i batteri si compongono tra loro. I diplococchi sono coppie di cocchi uniti tra loro. Gli streptococchi sono uniti in catenella e sono spesso batteri lattici. Gli stafilococchi sono m.o. patogeni che causano malattie quali l’acne e la tonsillite. I batteri curvi sono spirilli o vibrioni. La forma inoltre dà il nome ad alcuni generi. I batteri pleomorfi sono m.o. che assumono forme diverse nel corso della vita o se sottoposti a stress. Se sono maggiormente compatti riescono a resistere meglio agli stress. La forma è definita dalla parete.

Struttura della cellula batterica

La parete è la struttura più esterna che si osserva nella quasi totalità dei batteri. Solo alcuni di essi possono poi presentare ulteriori strutture accessorie, più esterne della parete. Sono formate per lo più da molecole polisaccaridiche, dall’aspetto viscoso in grado di trattenere l’acqua. Una di queste strutture è la capsula. Può avere sia base polisaccaridica che talvolta peptidica. Aderisce alla superficie della parete in modo compatto e presenta contorni ben definiti. Si può evidenziare tramite colorazione negativa: colorando la cellula rimane in evidenza la capsula priva di colore perché è refrattaria alle colorazioni. Dunque è distinguibile per differenza. La capsula è utile al m.o. per sfuggire alle risposte delle difese immunitarie delle cellule che attaccano e li protegge dalla fagocitosi. Inoltre conferisce resistenza all’essiccamento grazie alla presenza di polisaccaridi. Alcuni batteri invece della capsula presentano uno strato mucoso che non ha contorni netti, è una struttura più lassa. Altri ancora hanno il glicocalice, una struttura lassa che favorisce l’adesione ad altre cellule o alle superfici tramite la formazione di un biofilm. Non ha contorni netti, ha fibre lasse e le cellule che sono immerse in questo biofilm risultano essere più resistenti. I batteri diventano stanziali grazie a questa struttura. Aderiscono ad esempio alle protesi e sullo smalto dei denti determinando la carie. Come strutture di superficie a volte troviamo uno strato detto S-layer composto da proteine che si associano ad avere una struttura cristallina. Le colonie di batteri derivano dalla moltiplicazione di m.o. diversi. Sono visibili anche ad occhio nudo se molto numerose.

La parete cellulare è presente in quasi la totalità dei batteri; manca in alcuni m.o. ad esempio in quelli che vivono all’interno di cellule eucariotiche. La parete ha una struttura rigida, solida e resistente alle alte pressioni. Non tutti i batteri hanno lo stesso tipo di parete e infatti distinguiamo i batteri Gram + da quelli Gram - proprio da come la diversa parete che possiedono, reagisce a una particolare colorazione. Per questo motivo la parete è un elemento fondamentale per individuare il tipo di batterio. Contiene anche antigeni di superficie diversi dagli antigeni somatici che hanno tutti i batteri. La parete dei Gram + è formata per la maggior parte di molecole di peptidoglicano mentre la parete dei Gram - è molto più complessa e contiene uno strato periplasmatico con peptidoglicano molto più ridotto.

Parete dei Gram +: il peptidoglicano costituisce il 90% di tutta la parete. Ha una parte proteica e una formata da zuccheri. Le catene di peptidoglicano sono formate dall’alternanza tra un acido e un’ammina legati da un legame glicosidico. Le catene sono poi sovrapposte tra loro e alternate legate in verticale da legami covalenti beta-glicosidici. L’ancoraggio tra gli strati successivi è invece dato da legami crociati tra i 4 aminoacidi di ciascuna unità funzionale e strutturale del peptidoglicano. Questi 4 aminoacidi (L-alanina, D-alanina, acido D-glutammico ed L-lisina; nei Gram - troviamo più frequentemente l’acido diaminopimelico - DAP invece che la L-lisina) costituiscono la porzione peptidica del peptidoglicano e formano un legame crociato tra i vari filamenti di NAM e NAG di due successive unità funzionali. Si tratta di legami covalenti forti che troviamo in tutti i batteri dotati di parete. Il legame crociato tra l’aminoacido di una unità e quello dell’unità successiva nei Gram + è costituito da un ponte di pentaglicine. Esiste un antibiotico che riesce a rompere proprio questo legame rendendo la parete meno resistente, si tratta della Penicillina. Nella parete dei Gram + troviamo poi gli acidi teicoici che attraversano in modo trasversale tutta la parete tra le catene di NAM e NAG. Gli acidi lipoteicoici, dopo aver attraversato gli strati di peptidoglicano, agganciano anche la membrana citoplasmatica conferendo alla parte maggiore stabilità e ancoraggio e carica antigenica superficiale.

Parete dei Gram -: la struttura è molto più complessa e il peptidoglicano rappresenta soltanto il 10-15% di tutta la parete. È immerso in uno strato periplasmatico che divide la membrana citoplasmatica dalla membrana esterna. Lo strato periplasmatico è formato da enzimi, substrati e molecole di trasporto. Le lipoproteine di Braun, legate tra loro da legami covalenti, ancorano il periplasma alla membrana esterna. La struttura è più complessa ma anche più fragile. Lo stato di peptidoglicano è sottile ed è l’unica struttura resistente dal punto di vista meccanico. Le proteine sono in genere purine sia specifiche che aspecifiche. Lo stato LPS - lipopolisaccaride ha caratteristiche antigeniche e contiene il chetodeossiottanato. La membrana esterna è una barriera selettiva in cui troviamo le porine, delle proteine canali. È infatti coinvolta nel sistema di trasporto. La struttura complessiva è acquosa, gelatinosa per via di tutte le molecole inserite nel periplasma che ha quindi più densità. Se viene danneggiato questo strato esterno entra acqua nella cellula. Il lisozima è un enzima che idrolizza i legami all’interno del peptidoglicano e quando si rompono l’acqua riesce a penetrare e la cellula può arrivare ad esplodere secondo il fenomeno della lisi osmotica. La cellula riesce a vivere solo se si trova in un ambiente isotonico. Il citoplasma è ricco di soluti e l’acqua tende a entrare per osmosi. Il lisozima ovviamente è più efficace nei confronti dei batteri Gram + perché va ad attaccare il peptidoglicano che rappresenta il 90% della parete cellulare di questo gruppo di m.o.

Formazione della parete batterica

Avviene all’interno del citoplasma dove vengono sintetizzati tutti i componenti del peptidoglicano. Questi poi devono essere trasportati all’esterno della membrana citoplasmatica. Questo trasporto avviene grazie a una molecola carrier, il bactoprenolo. È una molecola lipidica ed idrofobica che riesce ad attraversare la membrana mentre gli aminoacidi che sono carichi non riescono da soli a passare all’esterno. Una volta che i componenti sono fuori dalla membrana, avviene la reazione di transpeptidazione che assembla tra loro i vari componenti. Le FTS proteine formano l’anello FTSZ nella zona in cui avviene la divisione tra la cellula madre e la cellula figlia che è anche la zona dove si forma la nuova parete cellulare. Ci sono quindi tre passaggi:

• Il monomero e gli aminoacidi si legano ai gruppi fosfato.
• Questi si legano al bactoprenolo che riesce ad attraversare la membrana citoplasmatica.
• Una volta fuori si crea il legame peptidico tra i vari monomeri e gli aminoacidi che sono già all’esterno.

I micoplasmi sono particolari m.o. senza parete cellulare ma...