Microbiologia generale

Terreni colturali

Servono per poter visualizzare i m.o.; rappresentano l'insieme delle sostanze nutritive che consentono in vitro ai m.o. di riprodursi. Le colture pure si hanno quando dalla natura trasferiamo direttamente i m.o. su terreni solidi. In genere i m.o. sono su piastre dove vengono preparati i terreni; si chiamano colture quando il terreno è solido. Bisogna conoscere le abitudini nutritive dei m.o. che vogliamo coltivare. Nei terreni devono essere presenti composti chimici. Gli elementi principali sono:

• carbonio: rappresenta il 50% del peso secco di una cellula microbica. Cambia la forma in cui il carbonio viene utilizzato dai vari m.o. Alcuni hanno bisogno di usare carbonio già sotto forma organica quindi hanno bisogno di una fonte energetica che può essere la luce come composti chimici. Altri m.o. utilizzano il carbonio inorganico che poi loro stessi trasformano in organico. I m.o di interesse medico e ambientale sono chemiotrofi;
• azoto: bisogna

sempre aggiungere azoto inorganico o in forma già complessa: - zolfo: sotto forma di acido solforico, ione solfato; - fosforo: si trova nelle proteine e in generale nei macronutrienti; - ferro: soprattutto per i m.o. siderofori che legano il ferro e lo trasportano nella cellula. Dobbiamo poi aggiungere in coltura anche fattori di crescita quali vitamine del gruppo B (importanti per i batteri lattici), purine, pirimidine, aminoacidi. Nei terreni di coltura oltre ai costituenti bisogna inserire fonti di energia soprattutto zuccheri quali il glucosio. Queste sono tutte fonti nutrizionali ma c'è bisogno anche di altri elementi. Per esempio alcuni batteri potrebbero modificare il pH del terreno se fanno fermentazione degli zuccheri e producono acidi. Servono in questo caso anche dei tamponi. Altro ingrediente importante dei terreni colturali è l'agar, uno zucchero che non viene degradato dai m.o. La gelatina che veniva usata prima è stata.sostituita perché veniva degradata dai m.o. L'agar fonde sopra gli 80 °C. In autoclave si scioglie ma solidifica completamente intorno ai 37 °C. Il vetrino viene fatto raffreddare e l'agar va messo in piastra a circa 50-60 °C prima che solidifichi. Possiamo poi aggiungere antibiotici al quale la specie che vogliamo coltivare è resistente in modo da inattivare le altre. Oppure aggiungiamo ad esempio sali di bile non tollerati da alcune specie. Spesso il fosforo è usato nei terreni di coltura sotto forma di sale. Ci sono aziende che producono terreni di coltura già pronti (brodi, piastre o in forma liofilizzate). Se sono commercializzati in polvere, vanno prima risospesi in acqua. Il terreno poi va reso sterile con un trattamento termico in autoclave e soltanto dopo vado ad aggiungere le componenti termolabili. Il terreno di coltura va sciolto, travasato in una perga e chiuso con cotone idrofilo per sterilizzare e poi inserito in autoclave.terreni possono essere liquidi in piastre, provette o bottiglie. L'agar si trova già in qualche terreno liofilizzato oppure viene aggiunto dopo. È un agente solidificante, inerte e non tossico. Non viene utilizzato dai m.o. come nutriente quindi va bene come strato solido. Una volta che gelatinizza, l'agar solidifica ma non a tal punto da impedire il movimento dei nutrienti e il loro ingresso ma impedisce la fuoriuscita dei m.o. Classificazione dei terreni di coltura I terreni di coltura possono essere classificati in base alla composizione (possono essere sintetici o complessi) oppure in base alla funzione (terreni di arricchimento, mantenimento, selettivi..). I terreni più semplici non sono selettivi e consentono di coltivare più specie contemporaneamente. Classificazione in base alla composizione: Terreni empirici La composizione di questi terreni non è nota né costante e soprattutto non riproducibile. Può cambiare di volta in volta.carne di manzo, estratto di lievito, glucosio e cloruro di sodio. La composizione di questi terreni può variare a seconda delle necessità specifiche del microbiologo.

lievito (contiene il contenuto citoplasmatico). Questi ingredienti vanno bene anche per m.o. esigenti. Alcuni terreni sono poi arricchiti con sangue per i m.o. patogeni che spesso attaccano alcune componenti sanguigne: terreno Agar sangue. A volte i globuli rossi di pecora vengono scaldati per denaturare l'emoglobina e far apparire il terreno più scuro: terreno Agar choc. Tramite questi terreni possono essere individuati i m.o. esigenti o patogeni perché questi producono le emolisine, enzimi in grado di distruggere i globuli rossi del sangue, sono batteri emolitici. Alcuni effettuano emolisi completa, altri incompleta. Da ricordare che sia l'Agar sangue che l'Agar choc NON sono terreni selettivi.

Classificazione in base alla funzione:

Terreni di isolamento

Spesso questi terreni coincidono con quelli di mantenimento. In genere quelli di isolamento sono più ricchi di nutrienti perché i m.o. appena isolati hanno più esigenze.

Esempi di questo terreno sono l'Agar verde brillante, usato per coltivare la Salmonella, e il Nutrient Agar molto adatto per la crescita dei batteri. Tra i terreni di isolamento possiamo anche annoverare il Sabouraud che è anche un terreno selettivo. Contiene il destrosio che lo rende una sorta di melassa che non favorisce la crescita dei batteri. Terreni di arricchimento In coltura liquida un m.o. cresce in 10-12 ore. Per le colonie su piastra servono almeno 24-48 ore. Arricchire vuol dire favorire un m.o. piuttosto che un altro. Vado a fare una selezione lavorando sulla composizione nutrizionale o sul pH. Ad esempio usiamo il lattosio come fonte di carbonio invece che il glucosio per favorire i batteri lattici. Questi terreni vengono usati per cercare i patogeni che spesso sono presenti in piccolo numero e dobbiamo cercare di non avere un risultato che sia un falso negativo. In genere quindi si fa sempre un primo passaggio di arricchimento e soltanto dopo vado

Ad utilizzare un terreno selettivo in modo da inibire tutti gli altri m.o. per avere solo quello di interesse.

Terreni selettivi:

Questi terreni favoriscono la crescita solo di alcuni m.o. Andiamo ad utilizzare ingredienti come i sali biliari, i coloranti, gli antibiotici per favorire la crescita di specifici m.o. Ad esempio Escherichia coli è un batterio enterico adattato ai sali di bile. Con un pH di 5-6 riescono a crescere ad esempio soltanto lieviti e muffe. Un esempio di terreno selettivo è l'Agar PPLO utilizzato per i micoplasmi che sono m.o. senza parete molto piccoli. Questo terreno infatti contiene penicillina che disgrega la parete e quindi vengono inibiti tutti i m.o. dotati di parete e vengono favoriti i micoplasmi che non ce l'hanno.

Terreni differenziali:

Ci consentono di distinguere specie microbiche diverse e più specie nello stesso terreno. Un esempio di terreno differenziale è il Baird Parker che contiene tuorlo d'uovo.

Alcuni m.o. producono lecitinasi, un enzima che scinde i fosfolipidi della membrana del tuorlo d'uovo che si consuma e produce una chiarificazione. È un terreno giallo opaco e si forma una zona chiara intorno alle colonie di m.o. che producono questo enzima come ad esempio gli Stafilococchi. Posso ben distinguerli perché sono circolari, raggruppati in colonie, neri ma circondati da un alone chiaro.

Un altro terreno differenziale è il Mannitol Salt Agar che è anche selettivo. In questo terreno è presente il mannitolo come base di fermentazione per i m.o. e il sale che permette di riconoscere i batteri alofili.

I terreni differenziali ci consentono di coltivare specie microbiche diverse usando diversi coloranti in base alle specie e per distinguerle in base alla variazione di colore. Viene inoltre fornito un substrato particolare che induce i m.o. a produrre determinati enzimi per il suo metabolismo. Vengono anche forniti substrati cromogenici.

esempio nel terreno ALOA (Agar - Listeria Ottaviani e Agosti). E’ unterreno di colore giallino a cui viene aggiunto un x-glucoside, cioè un substrato per l’enzima beta-glicosidico che farà crescere le colonie che producono questo enzima e attorno ad esse si formerà un alone verde-azzurro. Possono essere invece forniti substrati fluorogenici con un supplemento che viene aggiunto al terreno rendendolo fluorogenico. Questi terreni vengono ad esempio utilizzati per i coliformi come Escherichia coli. Al terreno viene aggiunto il MUG e andando ad osservare sotto la lampada di Wood la colonia di Es. coli sarà diventata fluorescente. Alla luce normale avrò il risultato globale di tutte le colonie, sotto la lampada avrò il risultato parziale.

Tecniche di semina

Nell’allestimento dei vetrini servono le anse per trapiantare i m.o. da un terreno all’altro. Il campione va sempre omogeneizzato nello Stomacher. Flambare vuol dire

Arroventare l'ansa; quando tutto il filo è rovente, vuol dire che è sterile. A quel punto possiamo fare un trapianto in condizioni di sterilità. Ci sono diverse tecniche.

Striscio - questa tecnica serve sia per trapiantare che per ottenere colture pure. Sulla piastra potrebbero crescere anche specie diverse. Con lo striscio si vanno a separare le diverse colonie, o meglio le unità formanti colonie, cioè le singole cellule che hanno dato vita ad una colonia. Potrebbe essere necessario ripetere lo striscio più volte e man mano che vengono fatte nuove strisciate si ottiene la separazione delle singole colonie.

Spatolamento - con questa tecnica seminiamo una porzione, una sospensione di cellule e spatolando andiamo a distribuirle su tutta la superficie della piastra.

Inclusione - in una piastra sterile e vuota andiamo a seminare le cellule, l'inoculo all'interno del terreno e dopo muoviamo la piastra per distribuire le cellule in modo uniforme.

Le cellule saranno all'interno e non in superficie come nello spatolamento.