Microbiologia e Microbiologia orale

Microbiologia e igiene (13 CFU)

Odontoiatria e protesi dentaria LM46

Microbiologia e microbiologia clinica (5 CFU)

Prof.ssa G. Batoni

Libro di testo consigliato: Principi di microbiologia medica, III edizione Antonelli, Clementi, Pozzi e Rossolini

Introduzione alla microbiologia

La microbiologia è la scienza che studia i più piccoli organismi viventi. Tratta del mondo dell'invisibile. È una scienza molto giovane se comparata ad altre discipline, infatti per poterla studiare c'è voluto uno sviluppo tecnologico. Fermentazione: impiego di microrganismi per produrre vino e pane (l'uomo utilizzava i microrganismi senza sapere la loro esistenza).

La scoperta del mondo microbico si è avuta verso la metà del 1600, con l'invenzione del microscopio con potere sufficiente per osservare i microbi (i batteri orali sono i primi ad essere stati osservati). Verso la metà del 1800 si iniziò a capire che questi microbi erano anche portatori di malattie.

Varietà del mondo microbico

I microrganismi (m.o.) sono un gruppo molto eterogeneo di organismi viventi comprendenti alcuni metazoi, protozoi, numerose alghe, funghi, batteri o virus. Di solito sono unicellulari. Talvolta possono formare aggregati pluricellulari in cui tutte le cellule sono equivalenti. Solo occasionalmente possono presentare cellule o gruppi di cellule morfologicamente e funzionalmente differenziate.

Classificazione in base alla complessità strutturale

Classificazione dei batteri in base a criteri morfologici

(Forma, dimensioni, disposizione, caratteri tintoriali, ecc.)

Per quanto riguarda la forma, i batteri si distinguono in due forme principali:

• Cocchi (sfere)
• Bastoncelli (a forma di bastoncello, allungato)

Su queste due forme ci possono essere delle variazioni. Es. possiamo avere dei cocchi a forma di:

• Virgola (vibrioni)
• Neisserie cocchi (a forma di rene o fagiolo)
• Pneumococchi (cocchi a forma di lancia)

I bastoncelli possono essere:

• Spirale (spirilli)
• Filamentosi
• Dritti e regolari (bacilli)

La forma è una caratteristica stabile e costante di un certo batterio, specie o un certo genere. Può essere preso come criterio classificativo. Oltre alla forma è rilevante la disposizione (cioè, come una cellula si dispone rispetto a quelle vicine). È vero che ogni cellula è autonoma e indipendente, ma molto spesso i batteri tendono ad aggregarsi formando aggregati cellulari:

• Cocco (singolo)
• Diplococco (coppia)
• Streptococchi (catena)
• Stafilococchi (regolare a "grappolo d'uva")
• Sarcina (ottameri)
• Tetrarcina

Alcuni batteri tendono a disporsi sempre nello stesso modo quindi la disposizione è utile per classificare i batteri. Come si originano queste disposizioni? In base alla divisione cellulare. Es. un cocco che si divide e dà origine a due cellule. Se i piani di divisione sono tutti paralleli tra di loro si origina la catena (in cui le cellule figlie rimangano attaccate tramite un pezzettino tra di loro). Gli stafilococchi si originano se i piani di divisioni sono rivolti in tutte le direzioni dello spazio.

Colorazione di Gram

La colorazione utilizzata è la colorazione di Gram (dal nome dell'inventore). Le fasi principali della colorazione (che ci permette di distinguere tutto il mondo dei batteri in due grandi gruppi: gram positivi e gram negativi) sono le seguenti:

• Fase preparatoria: la coltura viene distribuita su tutta la superficie del vetrino
• Si fa asciugare all'aria la coltura
• Si fanno aderire strettamente al vetrino i batteri (per fissare si utilizza il calore): si passa il vetrino 3-4 volte su una fiamma, che fa aderire la cellula strettamente al vetrino).
• Colorazione primaria: il primo colorante è il cristal violetto (colorante viola). Colorante basico altamente affine alla superficie dei batteri e quindi tutti i batteri si colorano con questo colorante (sia i gram + che gram --).
• Mordente (coprire il preparato con una soluzione di ioduro di potassio e iodio, che si complessa sia con il cristalvioletto che con il materiale cellulare. Questo provoca l'aumento delle dimensioni del cristalvioletto che si incastra meglio tra le maglie della superficie del batterio e quindi si colora meglio)
• Fase determinante, fase di decolorazione (aggiungere allo striscio colorato gocce di etanolo (decolorante). I gram + non vengono alterati da questo passaggio che trattengono il cristalvioletto iniziale. Quelli Gram-negativi vengono decolorati dall'etanolo.
• Colorazione di contrasto: trattare il preparato con safranina (colorante rosso). Ha un colore diverso rispetto al cristalvioletto. Quelli gram-negativi sono colorati di rosso mentre i gram-positivi sono colorati di violetto.

Ora posso osservare il preparato con un obiettivo. La morfologia, le caratteristiche tintoriali e la disposizione delle singole cellule batteriche possono essere osservate solo con il M.O. dopo aver allestito un vetrino colorato con il metodo gram. Ad occhio nudo possono osservare le colonie batteriche. Le colonie batteriche sono il prodotto della divisione di una singola cellula batterica. Contengono milioni di cellule batteriche. Possono essere osservate ad occhio nudo sulla superficie di terreni di coltura solidi, ovvero mezzi artificiali che contengono vari nutrienti in grado di sostenere la crescita dei batteri. In questo modo posso osservare la morfologia della colonia che è un altro carattere tassonomico. Le colonie possono differire tra di loro dalla forma, dal margine, dal profilo e dalla superficie. Colonie di un certo batterio tendono ad essere sempre uguali su un determinato terreno.

Classificazione dei batteri in base a criteri metabolici e biochimici

• Tramite analisi del profilo biochimico. Vado a misurare una serie di proprietà biochimiche e metaboliche di quel ceppo batterico. Esempio vado a misurare:
• Utilizzazione di alcuni zuccheri come unica fonte di carbonio;
• Produzione di certi substrati;
• Utilizzazione del citrato;
• Produzione di certi enzimi;
• Decarbossilazione di alcuni AA;
• Necessità o meno dell'ossigeno per la crescita (anaerobi/aerobi);

Esistono kit commerciali che permettono di eseguire contemporaneamente sullo stesso isolato clinico, 20 o più test biochimici miniaturizzati. Dopo incubazione i risultati più o meno sono confrontati con un database utilizzando un programma computerizzato.

Classificazione dei batteri in base a caratteri sierologici

Permette di identificare una specie batterica o varianti all'interno di essa (sierotipi/ sierogruppi) tramite la rilevazione delle caratteristiche antigeniche (presenza di molecole di superficie riconosciute da anticorpi specifici prodotti dal sistema immunitario di animali o dell'uomo). L'antigene è qualcosa di estraneo all'organismo. L'organismo lo riconosce come estraneo e produce degli anticorpi. L'anticorpo può essere utilizzato per identificare un certo tipo di organismo. Posso distinguere le varie specie ma posso distinguere anche delle varianti sierologiche delle varie specie. Molti batteri patogeni esistono in natura come varianti antigeniche multiple. Questo conferisce un vantaggio selettivo perché il sistema immunitario ha più difficoltà nel riconoscere le varie varianti. Più varia quella specie, maggiore saranno le sue probabilità di trovare un ospite non immunizzato. Il soggetto può essere infettato più volte da varianti multiple che riproducono però la stessa malattia.

Classificazione dei batteri in base a caratteri genetici

È il metodo più accurato di identificazione di una specie; analizza una serie di caratteri genetici quali:

• % di guanina-citosina
• % di ibridazione del DNA
• Analisi dei plasmidi
• Analisi delle sequenze codificanti per l'RNA ribosomale
• Analisi della sequenza nucleotidica di particolari regioni genetiche o di tutto il genoma

Abbiamo la possibilità di disporre di una enorme quantità di informazioni dall'analisi comparativa delle sequenze. Dall'analisi del DNA posso sapere se un organismo appartiene o no a una stessa specie (se appartiene alla stessa specie deve avere almeno il 70% del DNA che caratterizza quella specie (devono essere vicini dal punto di vista tassonomico)).

Tutti i m.o. vengono denominati secondo una nomenclatura binomiale (ideata da Linneus) per tutte le classi evolutive. Il primo nome si riferisce al genere e il secondo nome si riferisce alla specie. Il primo nome va in lettera maiuscola, mentre il secondo in minuscola. Si utilizza il corsivo per entrambi i nomi. Sempre il genere abbiamo la famiglia, poi l'ordine, la classe, il phylum e il dominio. La specie raccoglie tutti quegli organismi con tantissime caratteristiche in comune (un DNA simile). I nomi dei batteri sono in latino.

Concetto di specie nei batteri

Una specie batterica è costituita da un gruppo di ceppi che mostrano un grado elevato di somiglianza fenotipica e che si distinguono da altri gruppi di ceppi correlati per un grande numero di caratteri indipendenti. Ceppo o clone: insieme di cellule geneticamente identiche, derivate da subcoltura di una singola colonia isolata in purezza. Il fenotipo è l'insieme delle caratteristiche chimiche, morfologiche, metaboliche, di virulenza ed altro in cui si presenta un batterio. Un fenotipo simile implica un genotipo simile. In questo contesto, i ceppi appartenenti ad una stessa specie devono possedere un grado di omologia (o somiglianza) della sequenza di nucleotidi del loro DNA uguale o maggiore al 70%.

Struttura generalizzata di una cellula batterica

Tutti i batteri hanno per forza un citoplasma e una membrana citoplasmatica (quindi una cellula). Ci possono essere altre strutture:

• Parete cellulare (al di fuori della membrana citoplasmatica, ce l'hanno quasi tutti i batteri)
• Capsula batterica (al di fuori della parete)
• Pili
• Flagelli

Ci sono delle strutture indispensabili come il citoplasma, il DNA e la membrana citoplasmatica. Delle strutture ectocellulari come la parete cellulare e la capsula e le strutture accessorie come flagelli e pili. Il citoplasma è una massa semifluida racchiusa dalla membrana citoplasmatica. È costituito da una soluzione acquosa in cui sono presenti tutti gli elementi che assicurano il metabolismo cellulare:

• Proteine
• Metaboliti intermedi
• Enzimi
• Ribosomi (fino a 20.000 in E. coli) costituiti da due sub-unità una maggiore e una minore. Costituiti da RNA e proteine. Si associano in catene chiamate polisomi. Sintetizzano le proteine attaccandosi al RNA messaggero.

Assenza di mitocondri, apparato del Golgi, reticolo endoplasmatico, lisosomi ecc. Possono essere presenti delle inclusioni citoplasmatiche (granuli) contenenti sostanze di riserva (accumuli di sostanze di riserva). Può utilizzare queste sostanze nutritizie in periodi di scarsità di sostanze nutrienti. Dentro il citoplasma abbiamo anche il materiale genetico, che non è racchiuso in una membrana nucleare, ma è libero nel citoplasma. È un unico cromosoma, molecola di DNA circolare a doppio filamento. Notevoli dimensioni (1mm), strettamente avvolto a formare un nucleoide da cui sono esclusi i componenti citoplasmatici. Associato a poliammine e a proteine basiche simil-istoniche.

Organizzazione del genoma batterico

La maggior parte del DNA batterico è raccolto in un singolo cromosoma. Una piccola percentuale di DNA (1-2%) ha localizzazione extracromosomica e va a costituire, nel citoplasma, piccole unità circolari di DNA chiamati plasmidi. I plasmidi possono moltiplicarsi indipendentemente dalla normale divisione della cellula ospite e trasportano informazioni genetiche non indispensabili alla vita del batterio, ma che possono essere importanti per la sua patogenicità. Tra i caratteri legati a geni plasmidici sono da ricordare:

• La resistenza agli antibiotici (insensibile all'attività di un certo farmaco) (vantaggio selettivo avere questo plasmide)
• La produzione di alcune tossine
• La produzione di batteriocine (proteine ad attività antibatterica, importanti nei fenomeni di competizione tra batteri)

I batteri si possono passare questi plasmidi tra di loro.

Membrana citoplasmatica batterica

Racchiude il citoplasma batterico. La membrana è molto simile a quella degli eucarioti. L'unica differenza è che è priva di steroli ad eccezione di un piccolo gruppo di batteri che sono i micoplasmi. È strutturata secondo il modello a mosaico fluido. Composta da:

• Fosfolipidi (molecole anfipatiche che in ambiente acquoso si organizzano a formare un doppio strato lipidico)
• Proteine (periferiche, blandamente associate alla membrana; integrali, le più abbondanti che attraversano tutto lo strato idrofobico)
• Carboidrati, in piccola quantità sotto forma di glicoproteine o glicolipidi

È una barriera selettiva che trasporta i soluti dentro e fuori la cellula. È responsabile della ritenzione del contenuto intracellulare e del controllo dello scambio dei metaboliti. La disposizione del doppio strato lipidico rende la membrana impermeabile agli ioni e alla maggior parte delle molecole polari (idrofiliche) ed anche a quelle non polari (idrofobiche) con un peso molecolare superiore ad un certo valore a meno che non esistano sistemi di trasporto specifico. Ha una funzione biosintetica: nella membrana sono localizzati gli enzimi che sintetizzano i precursori polisaccaridici della parete cellulare così come i trasportatori lipidici su cui vengono riunite le sotto-unità della parete cellulare. Ha una funzione del trasporto degli elettroliti e fosforilazione ossidativa nelle specie aerobie: i citocromi e gli altri enzimi della catena respiratoria sono situati nella membrana citoplasmatica che risulta analoga funzionalmente alla membrana interna dei mitocondri delle cellule eucariotiche. Ha una funzione dell'intervenire nel processo di duplicazione del DNA (contiene gli enzimi che servono per la duplicazione del DNA).

Mesosomi

Invaginazione della membrana citoplasmatica di notevoli dimensioni di forma irregolare, spesso circonvoluta, abbondanti e voluminosi soprattutto nei batteri Gram+. Svolgono molte delle funzioni della membrana citoplasmatica. I mesosomi settali intervengono nella divisione cellulare e tengono legato il DNA facilitando la separazione dei due cromosomi e la produzione del setto trasverso. Al di fuori della membrana citoplasmatica abbiamo la parete.

Differenza tra la parete dei gram-positivi e quella dei gram-negativi

La parete è un involucro posto all'esterno della membrana citoplasmatica in quasi tutti i batteri (ad eccezione dei micoplasmi). Spessore variabile. Costituenti peculiari, alcuni dei quali presenti solo nei batteri. La funzione principale della parete è quella di proteggere il batterio dai danni di tipo osmotico. Il citoplasma dei batteri è molto più concentrato rispetto all'ambiente esterno. Quindi abbiamo in contatto due compartimenti separati da una membrana permeabile all'acqua. Quindi l'acqua tenderebbe ad andare dal reparto più diluito a quello più concentrato (entra dentro la cellula). Il batterio si gonfia incanalando l'acqua. Questo processo continuerebbe fino a causare la lisi per osmosi. La parete però è rigida e più compatta quindi impedisce che il batterio si rigonfi più di un certo limite e che scoppi. Oltre a questa funzione, la parete essendo rigida mantiene la forma del batterio, protegge dalle offese meccaniche e ha una funzione immunitaria (sulla parete ci sono molte molecole che funzionano come antigeni).

Composizione chimica della parete: Il componente principale si chiama peptidoglicano (componente peptidica e una glucidica) o mureina (ricorda il muro perché è rigido come un muro) responsabile delle caratteristiche di rigidità della parete. Le due componenti del peptidoglicano sono separate. Gli zuccheri si organizzano in lunghe catene disaccaridiche poste concentricamente alla cellula batterica. Delle corte catene peptidiche che sono attaccate alle catene degli zuccheri trasversalmente e le uniscono andando a creare una sorta di rete.

La parete ha un’organizzazione profondamente diversa tra i Gram+ e i Gram-. Queste differenze sono responsabili delle differenze proprietà tintoriali. Nei GRAM+ abbiamo uno spesso peptidoglicano anche di 40 strati concentrici (40-80% del peso secco). Oltre al peptidoglicano abbiamo acidi teicoici, acidi teicutonici, proteine, carboidrati intercalati nel peptidoglicano. Nei GRAM- abbiamo un sottile peptidoglicano (pochi strati concentrici (2-3) (5% del peso secco e pochi legami crociati). Altri componenti oltre al peptidoglicano: organizzati a formare una struttura complessa all'esterno della mureina (la membrana esterna). Quindi nei GRAM - abbiamo 2 membrane separate da un sottile strato di peptidoglicano. Nei GRAM+ il peptidoglicano trattiene il cristalvioletto che si va ad incastrare nelle maglie del peptidoglicano che è molto spesso. I GRAM- rilasciano il cristalvioletto perché il peptidoglicano è molto sottile, e l'alcol lava via la membrana esterna perché fatta essenzialmente di lipidi solubili in alcool (ecco perché l'etanolo lava via il cristalvioletto).

La parete cellulare è una struttura caratteristica della cellula batterica. Il costituente della parete è il peptidoglicano che è una molecola grossa costituita da due componenti: Compon