Microbiologia e Microbiologia orale

PLACCA SOTTOGENGIVALE

- Il prelievo può essere effettuato con una curette, ma ciò può essere difficoltoso in caso di ta-

sche parodontali profonde; la curette infatti non può essere fisicamente inserita in tasche più

profonde di 6 mm; ha il vantaggio che rimuove i batteri della placca

- Più spesso si usano conetti di carta bibula sterile (perio paper) che devono essere inserite nelle

tasche parodontali più significative, generalmente le più profonde di ogni quadrante, per un

tempo minimo di un minuto.

- I coni assorbono per capillarità il liquido crevicolare contenente i batteri fluttuanti (potrebbe

non essere rappresentativo di tutti i batteri della placca).

- Prima del prelievo è opportuno isolare il campo con rotolini di cotone, asciugare la saliva e ri-

muovere la placca sopragengivale per evitare contaminazioni con batteri pro-

venienti da questi siti.

2)Il campione una volta prelevato deve essere TRASPORTATO

AL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA.

Se si ricercano germi non labili il campione può essere trasportato al laboratorio

come tale nell’apposito contenitore;

Nel caso si voglia isolare germi labili (facilmente inattivati da agenti fisici e chimici come

essiccamento, sbalzi di temperatura, sbalzi di pH, ossigeno) è necessario utilizzare dei terreni di

trasporto

- Possono essere sia SOLIDI che LIQUIDI;

- Di solito contengono soluzioni tampone e/o proteine (es: siero fetale) che non sostengono

la crescita dei batteri (inattivano le proteasi), ma mantengono la loro vitalità e prevengono

l’essiccamento

3)L’ARRIVO IN LABORATORIO: L’ACCETTAZIONE DEL CAMPIONE

Il nome ed i dati anagrafici del paziente vengono registrati in un sistema computerizzato, insieme al

tipo di campione, la clinica, il medico richiedente, l’ora del prelievo ed il tipo di microrganismo/i

che si deve ricercare (germi comuni o specifiche richieste)

4)VERIFICA DELL’IDONEITA’ DEL CAMPIONE:

5)SCELTA DEL METODO DI DIAGNOSI:

DIAGNOSI DIRETTA DI INFEZIONE BATTERICA:

ESAME MICROSCOPICO DIRETTO

L’esame microscopico in alcuni casi è veramente importante considerando anche che è un esame

rapidissimo che si svolge in pochi min

A FRESCO: motilità, presenza di capsula, etc

-ESAME DI PREPARATI COLORATI: Gram, Ziehl-Neelsen

-ESAME

Si può fare due tipi di diagnosi diretta: esame colturale o test rapidi

ESAME COLTURALE

: si avvale dell’ausilio di terreni di coltura diversi

1) TERRENI LIQUIDI: usati per arricchire il campione, cioè favorire la crescita delle specie che si vuole

isolare se presenti in basso numero

2) TERRENI SOLIDI: usati per osservare le colonie (strutture visibili ad occhio nudo che sono l’insieme

di tante cellule batteriche) e per l’isolamento in coltura pura. Si presuppone che colonia derivi da

singola cellula batterica e che si abbia una coltura pura

3) TERRENI COMPLESSI (RICCHI) ricchi di substrati organici usati come nutrienti (estratti di lievito, di

organo); usati per l’isolamento di germi esigenti o presentati in campioni clinici di norma sterili.

Classificazione sulla base della funzione: I SEGUENTI TRE TERRENI sono usati in laboratorio

per isolamento di germi patogeni da campioni polimicrobici

4) TERRENI SELETTIVI: sono terreni che contengono sostanze che inibiscono la crescita dei batteri

che non vogliamo isolare (selezione negativa). Sono usati per isolare specifici microrganismi da

campioni clinici che possono contenere germi della flora normale.

Si usa con campione polimicrobico (contiene tante specie diverse tra cui quella patogena) à

ES DI CAMPIONI POLIMICROBICI: FECI, TAMPONE FARINGEO, TAMPONE CUTANEO ecc.

se faccio campione di cute infetta prelievo patogeno responsabile dell’infezione ma anche quelli

normalmente presenti. Per isolare faccio semina su un terreno selettivo. Si mette ad incubare a 37

gradi celsius. Ottengo batteri che voglio isolare.

ESEMPI DI TERRENI SELETTIVI:

- AGAR SALE MANNITE: contiene il 7.5% di NaCl che inibisce la maggior parte dei Gram-; terreno se-

lettivo per l’isolamento degli Stafilococchi;

- AGAR McCONKEY: contiene sali biliari che inibiscono la maggior parte dei Gram+; terreno selettivo

per l’isolamento degli enterobatteri (GRAM NEGATIVI)

- THAYER MARTIN: terreno selettivo per l’isolamento delle neisserie patogene. Contiene antibiotici

ed antifungini verso cui le neisserie patogene non sono sensibili

5) TERRENI DISCRIMINATIVI: sono terreni di coltura che permettono di discriminare tra specie batte-

riche diverse sulla base del colore delle colonie nel terreno ci sono degli indicatori che permet-

à

tono di rilevare eventuali reazioni biochimiche avvenute.

AGAR SALE MANNITE: contiene la MANNITE come unica fonte di carbonio; permette di discrimi-

nare gli Stafilococchi patogeni (S. aureus) nell’ambito degli Stafilococchi; La fermentazione della

mannite porta a produzione di sostanze acide. Terreno selettivo perché crescono solo stafilococ-

chi, ma discriminativo perché posso discriminare i diversi stafilococchi.

Colonie acidificanti (gialle): la fermentazione del mannitolo produce acidi che fanno virare il colore

dell’indicatore di pH verso la forma acida. ES: S. aureus

Colonie incolori: il germe non fermenta il mannitolo; le colonie rimangono del colore del terreno

ES: S. epidermidis

AGAR McCONKEY: contiene il LATTOSIO come unica fonte di carbonio; permette di discriminare gli

enterobatteri patogeni (S. typhi) nell’ambito degli enterobatteri.

Colonie acidificanti (rosse): la fermentazione del lattosio produce acidi che fanno virare il colore

dell’indicatore verso la forma acida. ES: E. coli

Colonie incolori: il germe non fermenta il lattosio; le colonie rimangono del colore del terreno ES:

S. typhi

6)TERRENI DI ARRICCHIMENTO O SELETTIVI: sono terreni selettivi liquidi. La presenza

di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita in numero delle specie

da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitrici.

ESEMPIO: TERRENO AL SELENIO PER ISOLAMENTO DELLE SALMONELLE PATOGENE DELLE FECI

Tifo causato da salmonella tifi che deve essere

ricercata in campione di feci dove ci sono

tanti altri batteri: allora io arricchisco cam-

pione in modo da bloccare batteri normal-

mente presenti e favorire crescita della sal-

monella.

Se ASPETTO TROPPO ANCHE GLI ALTRI BAT-

TERI CRESCONO.

COLTIVAZIONE DEI GERMI ANAEROBI:

Varie procedure a seconda della sensibilità all’O2:

- 1). Chiusura ermetica delle provette o aggiunta di olio di vasellina;

- 2). Aggiunta al terreno di agenti riducenti (es: TIOGLICOLLATO) che riducono l’ossigeno ad

acqua;

- 3). Giara per anaerobiosi

All’interno del contenitore, accanto alle piastre, viene sistemata una busta contenente

composti per lo sviluppo di H2 (boroioduro di sodio) e di CO2 (acido citrico e sodio bicarbo-

nato).

I composti vengono attivati mediante l’aggiunta di 10 ml di acqua. Nella busta è presente

anche un catalizzatore che permetta la combinazione dell’O2 contenuto nel recipiente con

l’H2 liberato e la formazione di H2O

- 4). CABINA ANAEROBICA

- L’atmosfera all’interno della cabina contiene: 85% N2; 10% H2; 5% CO2

INCUBAZIONE dei terreni di coltura inoculati con i campioni clinici A 37 GRADI PER TUTTA LA

NOTTE e poi si procede con IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA

A) OSSERVAZIONE DELLA MORFOLOGIA DELLE COLONIE:

COLORE, FORMA, MARGINI, EMOLISI, ACIDIFICAZIONE, ODORE

B) TESTI PRIMARI DI IDENTIFICAZIONE

Si effettuano direttamente sulle colonie sospette senza necessità ulteriore incubazione

TEST DELLA CATALASI

incubazione

Mette in evidenza la produzione di catalasi mediante la formazione di bolle (O ) in seguito

2

all’aggiunta di H O sulla coltura.

2 2

Utile per differenziare Streptococchi da Stafilococchi.

TEST DELLA COAGULASI

Mette in evidenza la produzione di coagulasi mediante la formazione di coaguli in seguito

all’aggiunta della coltura a plasma citratato di coniglio.

Utile per differenziare S. aureus dagli altri Stafilococchi

Una volta identificata la specie è fondamentale il test di sensibilità agli antibiotici per vedere

se patogeno è suscettibile al farmaco che si intende somministrare

Antibiogramma: Indagine di laboratorio per saggiare la suscettibilità di un microrganismo ai

farmaci antibatterici; si può eseguire solo se abbiamo coltivato ed isolato il germe in coltura pura

Raramente effettuato in odontoiatria; usato soprattutto in caso di pazienti con infezioni odontogene

refrattarie alla terapia empirica.

Metodo più usato per eseguire questo test: sistemi automatizzati o manuali con diffusione in

agar (metodo di Kirby Bauer)

- Il ceppo da testare viene strisciato su tutta la superficie di una piastra di agar sterile in

modo da ottenere una crescita batterica consistente ed uniforme (come patina)

- Una volta che lo abbiamo distribuito si aggiunge dei giltri di carta a forma di disco conte-

nenti concentrazioni note di diversi agenti antimicrobici vengono posti sulla piastra. Incu-

bazione di 18 ore a 35°C per consentire la crescita batterica. Antibiotico diffonde in ma-

niera radiale.

- Viene misurato il diametro degli aloni di inibizione osservati sulla piastra intorno a determi-

nati ceppi batterici (in mm) significa che batterio non è resistente a all’antibiotico (se al

à

posto dell’alone si vede crescita batterica significa che è resistente) ed i valori ottenuti pa-

ragonati a quelli standard per il ceppo batterico in esame, in modo da stabilire se è sensi-

bile o meno ad un dato antibiotico (Sensibile, Intermedio, Resistente).

Piu il diametro è lungo e piu il ceppo è sensibile

Attualmente ci sono sistemi automatizzati che PERMETTONO DI SVELARE

CONTEMPORANEAMENTE IL PROFILO METABOLICO E LA SUSCETTIBILITA’ AI

FARMACI DI UN ISOLATO CLINICO es: IL SISTEMA VITEK

6)REFERTAZIONE DEI RISULTATI (VEDI SLIDE 30)

ABBIAMO VISTO BATTERI.

DIAGNOSI DIRETTA DI INFEZIONE VIRALE

ORA VEDIAMO

Virus sono parassiti intracellulari obbligati, quindi dovrò coltivarli su delle cellule, molti virus

quando infettano le cellule le danneggiano, quindi posso vedere l’effetto citopatico. Non tutti i virus

danneggiano le cellule.

L’ISOLAMENTO VIRALE A FINI DIAGNOSTICI SI ESEGUE IN COLTURE DI CELLULE

(colture primarie; linee cellulari)

IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA MEDIANTE OSSERVAZIONE DELL’EFFETTO

CITOPATICO (non dato da tutti i virus) (ECP):

- VIRUS CHE DETERMINANO AGGREGAZIONE A GRAPPOLO DELLE CELLULE (Adenovirus)

- FORMAZIONE DI SINCIZI (virus respiratorio

sinciziale)

- NECROSI E LISI CELLULARE (picornavirus,

echovirus 3)

- EMOADSORBIMENTO (influenza virus A)

- TRASFORMAZIONE (virus oncogenico es.