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Microbiologia e Microbiologia orale

Si tratta di appunti per i C.d.L in Odontoiatria e protesi dentaria (6 anni) su microbiologia generale con particolare attenzione alla microbiologia orale e alla specie batteriche responsabili dei processi cariogeni, parodontopatici, endodontici etc...

Esame di Microbiologia e igiene docente Prof. G. Batoni

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ESTRATTO DOCUMENTO

F+ del plasmide, lo fa

passare tramite il pilo e

ne duplica una copia,

così alla fine del

processo entrambe le

cellule hanno il

plasmide con gene F+

(che precedentemente

come cellula ricevente

non aveva il plasmide

ed era F-). Ma con

questo processo di

trasferimento di

plasmide, possono

essere anche distribuiti

altri geni che

codificano per

resistenze ai farmaci

vantaggiosi per il

batterio e ulteriormente

dannosi per l’ospite).

Spesso il plasmide può

attaccarsi al

cromosoma e integrarsi

in esso. La cellula col

plasmide integrato nel

cromosoma, può

trasferire non solo il plasmide ma anche dei geni cromosomici che ricombinano nella cellula

ricevente. Quindi nel primo caso trasferisco solo il plasmide, nel secondo caso quando si ha

cellula HFR (high frequency recombination) in cui il plasmide è interato al cromosoma

batterico, al momento del trasferimento alla cellula ricevente sarà conferito oltre che il

plasmide anche una parte del cromosoma batterico della cellula donatrice HFR.

3. Trasduzione: si verifica quando plasmidi e frammenti di DNA cromosomico vengono

trasportati da un batterio all’altro tramite un virus parassita delle cellule batteriche

(batteriofago) a cui segue ricombinazione genica con acquisizione di nuove proprietà. Il

virus qui è l’intermediario, la particella trasducente. È un evento casuale perché per errore

nella testa del fago al momento della replicazione virale, uno di questi fagi è ibrido e andrà a

infettare un’altra cellula batterica e inietta

FARMACI ANTIMICROBICI ad ATTIVITA’ ANTIBATTERICA

• “ Sostanze capaci di interferire con la moltiplicazione dei m.o. a concentrazioni che siano

invece tollerati dall’ospite”. Abbiamo che lo stesso agente patogeno può essere reso

insensibile all’attività di quel farmaco epr sviluppo di resistenza batterica. L’ospite può

mettere in atto meccanismi di

immunità che si sommano

all’eventuale attività del farmaco

e, infine, l’ospite può attivare

alcune molecole del farmaco e può

essere dannoso all’ospite che

triangolo

costituiscono il

chemioterapico

.

La tossicità consiste nella

capacità di interferire

come un “proiettile

magico” lasciando il più

possibile inalterato la

condizione delle cellule

dell’ospite: questo può

essere quantificato con

l’indice terapeutico (IT).

Quanto più l’indice

terapeutico è alto allora

meglio sarà.

Il primo antibiotico fu

scoperto nel 1928 da

A.Fleming che per

sbaglio aveva lasciato sul

bancone alcune capsule

Petri e vi erano cresciute

delle muffe e tutto

introno a quella muffa

notò un alone forte di inbizione dei batteri causata da questa muffa che pensò potessero produrre

sostanze battericide (penicillina, dal nome tassonomico del fungo Penicillium notatum). Nel 1945

Sir A. Fleming fu insignito del Nobel per la Medicina.

CLASSIFICAZIONE DEI FARMACI ANTIBATTERICI IN BASE A:

1. Origine

• ANTIBIOTICI: classe di agenti microbici che agiscono su altri m.o. e hanno un’origine

BIOLOGICA;

• CHEMIOTERAPICI: agenti antimicrobici sintetizzati in laboratorio e vengono sintetizzati

solo se si è identificato un target contro il quale il farmaco deve agire;

• CHEMIOANTIBIOTICI: agenti semisintetici che in parte vengono modificati in

laboratorio per migliorarne anche le proprietà antimicrobiche e antibatteriche.

2. In base alla MODALITA’ D’AZIONE (gli effetti che

provocano sulla cellula batterica)

• BATTERIOSTATICI: inibiscono la replicazione

delle cellule batteriche, ma non le uccidono e sono

capaci di mantenere una causa molto bassa e quindi

permettono al sistema immunitario di risolvere

l’infezione;

• BATTERICIDI: che causano morte e lisi dei

microbi e la loro azione è irreversibile.

3. In base allo SPETTRO D’AZIONE

• AMPIO SPETTRO: sono attivi con tutti i GRAM + e – (es. tetracicline,

cefalosporine)

• SPETTRO RISTRETTO: attivi verso un limitato numero di specie (penicillina

verso GRAM +). Chiaramente non è possibile rispondere in maniera assoluta a quale

possa essere la scelta d’elezione per il tipo di antibiotico perché a seconda del quadro

clinico e del tempo che il clinico ha a disposizione per agire, possiamo se ne

abbiamo la certezza prediligere uno spettro ristretto che è più specifico e

4. In base alla STRUTTURA CHIMICA;

5. In base al MECCANISMO D’AZIONE

• Inibitori della sintesi della parete batterica;

• “ della sintesi delle proteine;

• “ della sintesi degli acidi nucleici;

• “ della funzione della membrana citoplasma

INIBITORI DELLA SINTESI DELLA PARETE BATTERICA

Sono dotati di elevata tossicità selettiva e a questa classe di farmaci appartengono tutte le

penicilline, le cefalosporine, i carbapenemi e i monobattami. Tutti sono antibiotici beta-lattamici.

Questi agiscono su tutte le fasi della sintesi della parete. I precursori del peptidoglicano sono

sintetizzati nel citoplasma e poi devono attraversare la membrana ed essere legati agli altri

componenti del peptidoglicano con tutte e tre le fasi di produzione dei peptidoglicani. La maggior

parte dei farmaci agiscono in sede extracellulari.

(vedi slides della 5 per studio lezione seguente)

I VIRUS I virus non sono

cellulari, ma strutture

subcellulari e sono

parassiti intracellulari

obbligati e hanno una

struttura semplice tanto

che se non infettano la

cellula. Non sono in

grado di replicare.

Possono infettare

cellule animali,

vegetali, batteri. Hanno

una struttura

estremamente semplice

e hanno delle misure

che vanno a un

massimo di diametro di

10-300 nm. Non sono visibili al microscopio ottico, ma solo al TEM. Sono parassiti che devono

replicarsi all’interno di una cellula e le particelle virali complete sono chiamate virioni.

STRUTTURA VIRALE

La particella virale è anche detta virione ed è costituita da un acido nucleico, il genoma che può

essere a DNA o RNA.

Il genoma è circondato da un contenitore di natura proteica detto capside e spesso anche da un solo

tipo di proteina e alcuni virus a questo stadio cono completi.

L’acido nucleico può essere associato a proteine e il nucleo capside è detto core.

• Alcuni virus oltre al capside hanno l’envelope oppure pericaspide e si parla di virus

rivestiti. Questa è una struttura membranosa con inserite delle glicoproteine;

• Abbiamo poi virus nudi senza pericapside.

CAPSIDE

Di natura proteica costituito da poche subunità strutturale i capsomeri assemblati a formare il

capside.

FUNZIONI DEL CAPSIDE

• Protezione dell’acido nucleico, perché nell’ambiente ci sono DNAasi, RNAasi e agenti

denaturanti che degradano l’acido nucleico e il capside proteico protegge il genoma virale

• Altra funzione per i virus nudi è quel che gli permette di aderire alle cellule ospiti che

presentano dei recettori dell’ospite che li riconosce. Le subunità che costituiscono il capside

possono aggregarsi con 2 modalità o simmetrie in modo da contenere tutto il genoma:

• Simmetria elicoidale: quando 2 capsomeri sono le unità strutturali proteiche e la catena

polipeptidica è una spirale come una scala a chiocciola al cui interno troveremo il genoma a

forma tubulare. Nei virus nudi i capsomeri sono più compatti, mentre quelli con pericapside

sono più lassi;

• Simmetria eicosaedrica: forma solida a 12 vertici e 20 facce

triangolari. Le proteine che costituiscono i vertici sono i

pentoni, mentre le proteine degli spigoli sono esameriche e

chiamate esoni; INVOLUCRO O

PERICAPSIDE O

ENVELOPE

È una struttura membranosa

che deriva dalla cellula ospite

infettata al momento in cui esce

dalla cellula infettata. Ha un

doppio strato di fosfolipidi e

proteine virali. Si ha questa

fuoriuscita per gemmazione. Nel caso dei virus rivestiti le molecole sono sul pericapside ed è

l’involucro che viene acquisito nella fase finale. È di natura lipidica ed è sensibile ai solventi,

contiene antirecettori per legare i recettori della cellula ospite e in alcuni caso le glicoproteine virali

formano delle protrusioni dette spicole.

Abbiamo anche virus complessi che comprende anche il virus del vaiolo (Poxvirus) e sono anche i

virus più grossi.

Abbiamo una grande variabilità morfologica: I virus nudi sono più resistenti alle

alte temperature per quando vengono

rilasciati dalle cellule infettate per lisi.

Di conseguenza questo determina il

fatto che siano motlo diffusi e può

rimanere molto infettivo nell’ambiente

a lungo tempo e spesso può superare il

pH dello stomaco basso. I virus con

involucro invece sono più sensibili e

quando vengono liberati dalla cellula

infettata per gemmazione, spesso la

cellula rimane viva e non si lisa. I virus

rivestiti sono i più fragili e non

sopravvivono nel tratto gastro-

intestinale.

ACIDI NUCLEICI VIRALI

Può essere a doppio filamento o a singolo filamento e può essere o a singola molecola o

frammentato, può essere lineare o circolare. Siccome questi genomi sono minuscoli, i geni sono in

numero limitato e questo determina il fatto che siano parassiti endocellualri obbligati. Ci sono delle

proteine nel virione insieme al genoma e ritroviamo vari tipi di enzimi come quelli per la sintesi

dell’mRNA e in particolare nei retrovirus che è l’enzima trascrittasi inversa ed è un enzima che

sintetizza DNA a partire da uno stampo di RNA. Poi possono esserci proteasi, nucleasi etc…

Proprio per risparmiare sul materiale genetico come nel virus dell’apatite B, i loro mRNA sono

sintetizzate da regione “overlapping”.

Possono essere a DNA o RNA e possono presentarsi:

• RNA: a singolo filamento o (con polarità positiva o negativa) o a doppio filamento;

• DNA: a doppio filamento lineare o circolare o a singolo filamento.

REPLICAZIONE DEI VIRUS ANIMALI

Devono obbligatoriamente infettare e penetrare in una cellula ospite e replicarsi all’interno di essa e

ricostituire una serie di progenie virali. Il virus introduce, penetra all’interno, il genoma si duplica

ed esprime e poi rilasciati dalla cellula ospite e infettare altre cellule. I virus infettano determinati

tipi cellulari.

Il virus deve essere:

• SENSIBILE: deve possedere dei recettori, delle molecole di superficie riconosciute dai

recettori ed è sensibile la cellula quando ha i recettori riconosciuti dal virus;

• PERMISSIVA: la cellula deve poter permettere la completa duplicazione del genoma virale

e di tutte e proteine.

L’INFEZIONE può ESSERE DI TIPO:

• Produttiva: quando c’è produzione di una progenie virale;

• Abortiva: un’infezione che non va a completamento o perché la cellula non è produttiva o

quando la cellula consente l’espressione di soli alcuni geni virali portando all’arresto

dell’infezione; • Restrittiva:

quando le cellule sono

permissive solo in una

parte del loro ciclo vitale

(possono comunque

consentire la persistenza

del virus all’interno e poi

a seguito di particolari

condizioni dare

l’infezione produttiva.

REPLICAZIONE 1. Adesione alla cellula

ospite o ADSORBIMENTO;

2. PENETRAZIONE;

3. SCAPSIDAMENTO;

4. REPLICAZIONE;

5. ASSEMBLAGGIO;

6. RILASCIO o

LIBERAZIONE

1. L’adsorbimento è la fase

in cui il virione aderisce alla

cellula ospite e ci

sono molecole

specifiche del virus

che riconoscono

molecole specifiche

della cellula ospite.

L’antirecettore sulla

superficie del virus sul capside per i virus nudi o sul pericapside sui virus rivestiti.

Quindi il legame tra recettore dell’ospite e antirecettore determina la specificità di specie

e l’infettività preferenziale per certi tipi di ospite.

2. Ci sono varie modalità di

PENETRAZIONE attiva: tra i

meccanismi ne abbiamo 3 in particolare.

La traslocazione che viene mantenuta dai

virus nudi molto piccoli. Per endocitosi

sia per virus nudi che rivestiti e in questo

caso il virus viene racchiuso dal

plasmalemma della cellula ospite e

portato all’interno. Ultimo meccanismo

per fusione della membrana

citoplasmatica con il pericapside

(possibile perché lipidici, della stessa

natura).

3. SCAPSIDAMENTO: è la fase in cui il

capside si disaggrega e il genoma virale

viene liberato. Questo processo di scapsidamento non è molto noto forse per intervento

di proteine virali e

porta comunque alla

liberazione del

genoma virale della

cellula e il genoma

virale da un lato viene

duplicato e replicato, dall’altra viene trascritto e tradotto in proteine;

4. REPLICAZIONE: Il DNA virale va nel nucleo dove viene trascritto e poi va nel

citoplasma in cu si ha la sintesi proteica con i ribosomi e poi rientrano le proteine nel

nucleo in cui verrà riassemblato. I virus a RNA a polarità + vengono direttamente nel

citoplasma tradotti, mentre quello a polarità – vengono ritrascritto. Eccezione per i virus

Figura 1 Avviene tutto nel citoplasma

a RNA che riguarda i virus

antinfluenzali. L’eccezione è quella dei retrovirus che

presentano una DNA polimerasi RNA

dipendente e converte RNA in DNA,

va ne nucleo e si inserisce nel genoma

cellulare e a questo punto il DNA

virale segue l’apparato biosintetico

cellulare. Quindi passando da un

intermedio a DNA si replicano anche

nel nucleo, a eccezione di tutti gli altri

virus in cui la replicazione si ha nel

citoplasma.

5. MONTAGGIO: tutte le

component virali si assemblano per

formare il virione e questo processo

è spontaneo e il processo è

spontaneo.

6. Liberazione del virione maturo: avviene per lisi cellulare

o per gemmazione per i virus rivestiti attraverso siti

specifici. ecco spiegato perché il capside virale è

membranoso. Quindi per i virus rivestiti non si ha

necessariamente una lisi della cellula. Spesso la

gemmazione no determina la morte cellulare.

COLTIVAZIONE DEI VIRUS

In laboratorio non potrò usare gli stessi terreni dei batteri e si usano colture cellulari per propagare i

virus. Si hanno colture primarie con animali dopo trattamento con enzimi. Quello che viene

impiegato sono le linee tumurali e per ogni virus occorre scegliere linee che abbiano recettori

riconosciuti dagli antirecettori dei virus. Vengono usate queste fiasche di varie dimensioni e poi

vengono infettate con i virus e l’effetto sulle cellule dannoso che viene detto citopatico e viene

impiegato anche in diagnostica per identificare in virus ed è quel danno cellulare legato

all’infezione virale produttiva. L’effetto citopatico a seconda del tipo di virus ha un certo tempo in

cui svilupparsi: abbiamo per esempio emoassorbimento nel virus A influenzale, trasformazione nel

virus oncogenico HTLV-1.

EFFETTI DEI VIRUS SULLE CELLULE OSPITI

• Infezione litica o citocida in cui la cellula muore;

• Infezione cronica in cui la cellula continua a produrre virus senza morire;

• Infezione latente in cui il virus integra il proprio genoma in quello della cellula ospite e

possono riattivarsi infezioni litiche;

• Infezione trasformante il virus “oncogeno” fa acquisire alla cellula un fenoripo trasformato

con una crescita incontrollata,

• Infezione abortiva per incompatibilità virus-cellula o per difetti nel virus.

FARMACI ANTIVIRALI Selettivi e avere come bersaglio dei processi

virali. Nella maggior parte dei casi non

necessitano di intervento terapeutici e spesso i

virus acquisiscono resistenza. I farmaci

potranno agire:

• Inibendo replicazione;

• Inibendo scapsidamento e liberazione;

Ma andare a inibire questi passaggi vuol dire

anche inibire la cellula dell’ospite.

Abbiamo per esempio inibitori dello

scapsidamento (Amantadina, rimandatina) e nel

caso dell’amantadina viene inibito lo

+

scapsidamento della proteina virale e non fa entrare H che impedisce l’acidificazione della

cellula virale essenziale per lo scapsidamento. Si hanno poi gli inbitori della sintesi degli acidi

nucleici virali come l’Aciclovir (ACV) usato per il trattamento soprattutto per virus herpetici

umani e va a inibire la DNA polimerasi virale bloccando la catena di DNA nascente. Si hanno

poi gli inibitori della trascrittasi inversa per i retrovirus e sono di 2 tipi: analoghi

nucleosidici e inibitori non nucleosidici. I secondi sono derivati dalle benzodiazepine e dei

primi il principale è l’AZT (azidotimidina) e lì’AZT-3P viene riconosciuta come una normale

base e inserita al posto della T.

Gli inibitori delle proteasi virali: quando l’RNA viene tradotto in proteina, si sintetizza una

poliproteina precursore che poi viene tagliata dalla proteasi virale nelle singole proteine

mature. Quindi la poliproteina non viene processata e anche questi farmaci sono impiegati come

inibitori della trascrittasi inversa e usati nelle epatiti.

Aggiungere precedente lezione su resistenza ai farmaci (slide 5)

MECCANISMI DI RESISTENZA AI BETA-LATTAMICI

1. A causa di una mutazione nel gene che codifica per la

porina: questa acquisisce una ridotta permeabilità

all’antibiotico;

2. Altro meccanismo di resistenza cromosomica è per una

mutazione del gene PBP che codifica per la transpeptidasi;

3. Meccanismo plasmidico che codifica per un enzima, la

beta-lattamasi che idrolizza l’anello betalattamico

(meccanismo principale);

Nell’ambito della stessa specie ma anche fra specie diverse si ha

questo principale meccanismo di resistenza ai betalattamici.

BETALATTAMASI

L’anello betalattamico viene rotto dalla betalattamasi e rende

l’antibiotico inattivo. Le penicillinasi sono dirette contro la

penicillina, le cefalosporinasi contro le cefalosporine, le

carbapenemasi dirette verso i carbapenemici.

RESISTENZA PER MODIFICA DEL BERSAGLIO

La vancomicina inibisce la reazione di traspeptidasi andandosi a

legarsi al dimero di Ala e i batteri possono modificare con un D-

lattato al posto di D-alanina e quindi sintetizzano una parete diversa

per resistere all’antibiotico (Cambio della struttura).

Si ha anche la resistenza ai MACRTOLIDI e si realizza per

acquisizione di un gene plasmidico che codifica per una metilasi.

L’enzima è responsabile della metilazione dell’RNA ribosomale 235 e

rende la subunità 50 S del ribosoma resistente all’antibiotico.

Ancora una modifica del bersaglio dell’antibiotico si esercita ai

fluorichinoni.

RESISTENZA PER MODIFICA DELL’ANTIBIOTICO (vedi betalattamasi)

1. Resistenza al CLORAMFENICOLO: è dovuta a geni plasmidici che acetilano l’antibiotivco

e lo inattivano rendendolo incapace di legarsi alla subunità 50 de ribosoma;

2. Resistenza agli AMINOGLICOSIDI con produzione di enzimi inattivanti.

RESISTENZA PER ALTERATA PERMEABILITA’ CELLULARE AL FARMACO

L’espressione del fenotipo di

resistenza è conseguente alla

ridotta concentrazione

intracellulare del farmaco per

effetto del:

• Ridotto uptake (ingresso

per porine)

• Aumentata espulsione

del farmaco (sistemi di efflusso

attivo).

PARTE SPECIALE: MICROBIOLOGIA ORALE

• ECOSISTEMA ORALE: IN CONDIZIONE DI SALUTE: la

cavità orale è uno degli ambienti più

colonizzati dell’organismo. I siti interni

(sangue, organi interni etc…)

dell’organismo al contrario devono essere

sterili. Nella cavità orale si riscontrano più

di 750 specie di batteri, virus, funghi e

protozoi.

Si ritrovano sia batteri GRAM + che

batteri GRAM -:

questo è legato all’eterogeneità legata sia

alla diversità anatomica che crea una

diversa presenza di habitat distinti

ciascuno da fattori chimico-fisici diversi e

idoneo a popolazioni microbiche distinte.

Sulle superfici mucose la più colonizzata è

la lingua soprattutto sulla linea mediano

per la ricchezza di papille che crea anfratti

e superfici rugose dove è più facile aderire.

Qui si creano anche condizioni di

anaerobiosi. Sulle superfici solide non

desquamanti come sullo smalto, la

deposizione dei batteri è alla base della

formazione della placca dentale. Ma anche

i denti sono tutt’altro che omogenei:

superfici lisce, superfici interprossimali, le

fessure delle facce trituranti e il margine

gengivale che mi permette una distizione

tra placca sopra e sottogengivale (con

maggiroe condizione di anaerobiosi e

minore diffusione dell’O2). Il dente a sua

vota è un universo in cui riscontrare più

sottohabitat e la placca

SOPRAGENGIVALE è colonizzata da

batteri GRAM + soprattutto streptococchi,

mentre nella placca SOTTOGENGIVALE

si ha maggiore sviluppo di anaerobi sia facoltativi che obbligati (come Tennerella forsythia.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans etc…) Alcune specie batteriche sono presenti solo a livello

del cavo orale per la presenza sia del tipo di nutrienti che per le caratteristiche chimico-fisiche

dell’habitat. Nuovi habitat si aggiungono in caso

di patologia come la lesione cariosa e la tasca

parodontale.

I FLUDI ORALI

• SALIVA: miscela complessa di acqua, ioni,

glicoproteine, pochi carboidrati e m.o. che

provengono dalle superfici limitrofe. È

responsabile del tipo e della crescita delle

comunità microbiche sia in senso positivo che

negativo. La saliva in qualche modo promuove la

colonizzazione della cavità orale da parte dei

batteri, ma ha anche una funzione antibatterica

con IgA, lisozima, lattoferrina etc…

Le glicoproteine possono altrettanto fungere da

agenti agglutinanti con formazione di grossi

agglomerati di batteri che

possono poi facilmente

essere eliminati con la

deglutizione. C’è un

equilibrio tra FORZE

POSITIVE E FORZE

NEGATIVE che si

oppongono alla

colonizzazione.

• FLUIDO CREVICOLARE: è un essudato di origine plasmatica e la

sua composizione riflette quella del plasma (tra cui albumina,

complemento, leucociti, Ig). Rappresenta un’ulteriore fonte di nutrienti

per la microflora come per esempio l’emina cofattore essenziale per

alcuni batteri anaerobi.

Condiziona il tipo e la crescita sempre delle comunità microbiche:

1. POSITIVO: ricca fonte di nutrienti, per lo più proteine in caso di

infimmazione in cui per effetto della vasodilatazione fuoriuscita di

plasma, abbondano le sieroproteine;

2. NEGATIVO: difese aspecifiche e rimozione fisica dei batteri.

Oltre che una diversità SPAZIALE si ha anche una diversità TEMPORALE

perché questi habitat possono cambiare la loro attività sia a breve termine che a

lungo termine con conseguenti cambiamenti

della flora residente.

FATTORI FISICO-CHIMICI CHE INFLUENZANO LA

CRESCITA DEI M.O. NELLA CAVITA’ ORALE

1. Temperatura: si mantiene realtivamente costante e

leggermente più bassa a quella corporea (35-37 °C) con

abbassamenti o aumenti improvvisi in base al cibo/bevande

ingerito/e e può essere modulata anche con processi infiammatori.

I batteri sono in grado di mettere in atto meccanismi di ressistenza allo shock termico. Nei

solchi gengivali sani la temperautra va da 33.7°C a 37.6 °C a seconda del dente, mentre

nelle tasche parodontali in infiammazione si raggiungono i 39 °C.

2. Tensione di O2: va da essere indispensabile per la crescita a essere tossico, uccidere i batteri

anaerobi. Rappresenta circa il 20 %, ma poche specie orali sono anaerobiche strette, mantre

gli anaerobi obbligati vivono grazie all’associazione di aerobi stretti o facoltativi che

consumano O2 o producono agenti riducenti come H quali prodotti della fermentazione.

2

3. Il pH: in condizioni di salute è attorno alla neutralità

(6.75-7.25 pH) per ioni e proteine, ma i batteri orali

hanno una elevata tolleranza per un’acidità

intermedia.

I batteri orali hanno vari gradi di tolleranza con pH

ottimali di crescita e che vanno da debolmente acido

ad alcalino. Quindi, sbilanciamenti del pH hanno

effetti diversi e favoriscono diversi batteri:

• pH ACIDO: selezione di specie ACIDURICHE

implicate nella CARIE;

• pH BASICO: selezione di specie coinvolte nelle

PARODONTOPATIE.

4. La disponibilità di nutrienti:

• Nutrienti esogeni: introdotti nella dieta e

sono meno importanti perché si tratta di polimeri ad alto peso molecolare e

dovrebbero essere spezzettate nei vari AA (per esempio le proteine);

• Nutrienti endogeni: stazionano sempre nella cavità orale come saliva, fluido

crevicolare, cellule epiteliali desquamate etc…

Un’eccezione è il SACCAROSIO che è un disaccaride a basso peso molecolare e può essere

rapidamente degradato e utilizzato.

ACQUISIZIONE DEL MICROBIOTA ORALE

Nella cavità orale questi batteri sono acquisiti per effetto di un processo progressivo con un serie di

tappe ben definite. Inizia a partire dalla vita intrauterina perché la placenta umana ha dei m.o. che

erano molto simili a quelli presenti nella cavità orale della mamma. Quindi, l’ipotesi che si fa strada

è che per effetto di un maggior grado di vasodilatazione della cavità orale per un maggior ricircolo

sanguigno andare nella placenta. È fondamentale la salute orale della madre perché ipotetici batteri

potrebbero per questa via passare nella cavità orale del bambino.

Poi c’è la nascita con una colonizzazione più massiccia ed è stato visto che la modalità di nascita ha

un’influenza sulla cavità orale dei batteri: i bambini nati con taglio cesareo crescono in condizione

di maggiore sterilità e quindi hanno una minore colonizzazione orale rispetto a quelli nati

naturalmente. Questo suggerisce che i batteri acquisiti possono in qualche modo proteggere da altri

batteri potenzialmente patogeni, quindi LA NASCITA NATURALE POTREBBE ESSERE UN

FATTORE PROTETTIVO DI DIFESA DA ALTRE SPECIE BATTERICHE

POTENZIALMENTE PATOGENO.

Anche il tipo di allattamento nel microbiota orale ha un’influenza notevole: nel latte materno ci

sono soprattutto dei lattobacilli che sono stati isolati e non sono presenti nel latte artificiale, questo è

sempre un fattore di protezione per il bambino allattato naturalmente.

Nei primi giorni di vita si ha la colonizzazione delle SPECIE PIONIERE come S. salivarius ed è

stato isolato a partire da 18 h dalla nascita. Una caratteristica di queste specie pioniere è che

producono IgA1 proteasi in grado di inattivare le IgA orali e del latte materno. Nei primi mesi di

vita aumentano gli streptococchi e col tempo l’attività metabolica delle specie pioniere modifica

l’ambiente e crea le condizioni per la colonizzazione da parte di specie GRAM -. A un certo punto

lo sconvolgimento è la comparsa dei denti e compaiono m.o. che possono aderire a specie dure e

alcune di queste specie avranno a che fare con le carie e possono essere presenti nei bambini di

quest’età. E compaiono anche già a 12 mesi di età batteri associati alla malattia parodontale.

Dipende molto dalla carca di queste specie e ci vuole molto circa 1 ANNO per stabilirsi di una

comunità “CLIMAX” per lo stabilirsi di un alto grado di diversità. Variazioni sono state descritte

anche NEL PASSAGGIO DELLA DENTIZIONE DA DECIDUA A PERMANENTE con specie

batteriche che aumentano e altre che diminuiscono. PLACCA DENTALE

Nella placca la comunità 11

microbica contiene 1-2 x 10

germi/grammo (60-70 % della

placca). È un insieme molto

compatto che si configura come

un vero e proprio biofilm e un

biofilm MULTISPECIE (vi sono

acnhe funghi, protozoi etc…). Ha

tutte le proprietà generali del

biofilm: Si distinguono una placca

sopragengivale e

sottogengivale ed è una

risposta dell’ospite che

contribuisce alla

resistenza

all’organizzazione. Il

problema è quando la

placca insorge in maniera

esorbitante e si deposita

soprattutto nelle superfici

interprossimali, nel solco

gengivale e nel margine

gengivale.

TAPPE DELLA FORMAZIONE DEL

BIOFILM ORALE

1. Formazione della PELLICOLA

DELLO SMALTO: spessore sottile di

saliva che si forma entro 90-120 minuti e

contiene proteine, glicoproteine, lipidi etc…

è importante questa fase con inteerazioni

chimico-fisiche deboli si tramutano in

interazioni stereochimiche specifiche a breve

raggio. Questo per interazione tra adesine

batteriche della pellicola stereospecifiche. Le

ADESINE sono strutture che consistono in

una serie di molecole come polisaccaridi,

proteine, lipopolisaccaridi etc…

2. Co-aggregazione o co-adesione che

porta a un aumento della diversità della microflora: di solito la più comune è una

coaggregazione intergenere, ma si può avere anche intragenere e possono

coaggregare anche tra loro.

3. Moltiplicazione dei m.o. attacati: con produzione di uno strato confluente o

biofilm. Sintesi polimeri extracellulari;

4. Distacco dei m.o. dal BIOFILM nella saliva e colonizzazione di altri siti

(PROCESSO DINAMICO)

ORGANIZZAZIONE SPAZIO-TEMPORALE DEL BIOFILM ORALE:

Fusobacterium è il batterio che risulta in grado di coaggregare con il maggior numero di generi; i

colonizzatori precoci della placca coaggregano con Fusobacterium; quelli tardivi non coaggregano con i

precoci, ma con Fusobacterium.

È stato proposto che Fusobacterium agisca come un ponte tra i colonizzatori precoci e tardivi à

La stretta vicinanza tra specie batteriche fa sì che si possano instaurare delle interazioni tra queste specie

comunità batterica e interazioni sia SINERGICHE (aiutano processo di colonizzazione e sopravvivenza) sia

ANTAGONISTICHE (si oppongono a massiccia colonizzazione e prediligono il sopravvivere di alcune

specie a scapito di altre).

il processo di co-aggregazione può portare a strutture complesse a forma di “pannocchie di grano” in

cui cocchi sono disposti lungo il corpo batterico di organismi filamentosi

SVILUPPO DELLA PLACCA DENTALE:

- Adesione delle specie pioniere (entro 2 ore dalla formazione della pellicola) (a)

- le specie pioniere si moltiplicano per formare microcolonie (b)

- le colonie si accrescono a formare uno strato confluente (c)

- aumenta la diversità: compaiono bastoncelli e batteri filamentosi (d,e)

- si osservano molte associazioni tra differenti popolazioni batteriche (f)

INTERAZIONI MICROBICHE NELLA PLACCA DENTALE:

INTERAZIONI SINERGICHE: in cui i batteri si aiutano gli uni con

gli altri

1) COOPERAZIONE METABOLICA o COMPLEMENTAZIONE

ENZIMATICA:

Consiste nella stretta cooperazione tra specie batteriche che producono

set distinti di enzimi degradativi (glicosidasi, proteasi, lipasi, ecc)

necessari per digerire le macromolecole dell’ospite e ridurle in elementi semplici che possono essere

trasportati attraverso le membrana e usate come nutrienti (che servono a loro volta per accrescersi o per

dividersi).

Il corredo enzimatico di una specie complementa quello della specie adiacente e questo aumenta la capacità

di utilizzazione dei substrati. (è difficile che un singolo batterio abbia tutti gli enzimi necessari)

es. i microrganismi A e D posseggono gli enzimi capaci di liberare lo zucchero terminale della catena

oligosaccaridica laterale della proteina dell’ospite permettendo al microrganismo B di liberare il penultimo

residuo e così via

2) CATENE ALIMENTARI:

si stabiliscono quando i prodotti del metabolismo di un m.o. (feeder primario) costituiscono la principale

fonte di nutrienti per un altro microrganismo (fedeer secondario).

Nel biofilm ci sono gli streptococchi. à

L’acido lattico è l’unico prodotto della fermentazione degli streptococchi è depositato su dente e dà inizio

a lesione cariosa.

Se nel biofilm orale oltre agli streptococchi è presente veillonella che è in grado di usare prodotto di scarto

degli streptococchi (ovvero l’acido lattico) come nutriente.

Acido lattico è uno scheletro carbonioso che presenta ancora energia di legame estraibile.

à può essere spezzettato con produzione di altri composti di scarto che sono acido propionico e eacido

acetico, meno forti rispetto all’acido lattico.

Succede che al di là del fatto che la Veillonella trova nutrimento dove sono presenti streptococchi si verifica

anche che convertendo acido lattico in acidi meno forti ha una sorta di produzione nei confronti

à

dell’individuo copresenza si traduce in meno carie.

Dal metabolismo della veillonella si produce anche vitamina K

COAGGREGAZIONE:

l’aderenza indiretta di specie batteriche alle superfici orali

•permette

coaggregate sono più resistenti alla fagocitosi ed al killing da parte dei neutrofili

•cellule

MODIFICAZIONE DELL’AMBIENTE:

Man mano che si forma il biofilm il metabolismo delle specie pioniere modifica l’ambiente e crea condizioni

adatte per la colonizzazione di specie più esigenti.

Es: gli aerobi o anaerobi facolativi (colonizzatori precoci) consumano l’O e producono CO o altri gas dalle

2 2

fermentazioni favorendo la crescita delle specie anaerobie obbligate.

INTERAZIONI ANTAGONISTICHE: in cui batteri si fanno la guerra

Contribuiscono a mantenere l’equilibrio dell’ecosistema orale prevenendo la crescita smisurata di alcune

specie a scapito di altre o l’impianto di specie esogene a più alto potere patogeno.

- competizione per i recettori di adesione quando sono saturati questo impedisce che altre specie

à

possano aderire

- competizione per le sostanze nutritizie

- produzione di sostanze inibitorie (acido lattico o altri acidi organici, acqua ossigenata)

- Produzione di batteriocine: proteine ad alto peso molecolare codificate da plasmidi con attività an-

tibatterica; di solito lo spettro di azione è ristretto; quello degli streptococchi è abbastanza ampio

A tutto ciò va aggiunto il SISTEMA IMMUNITARIO DELL’OSPITE che tiene un po' sotto controllo la

situazione.

E nelle cavità orale ci sono diversi

MECCANISMI DI DIFESA DELL'OSPITE DELLA CAVITA’ ORALE CONTRIBUISCONO A

CHE

MANTENERE L’OMEOSTASI OPPONENDOSI ALLA MASSIVA COLONIZZAZIONE DA PARTE

DEI MICRORGANISMI

Fanno capo all’immunità innata o all’immunita aspecifica

Noi ci occuperemo di capire cosa succede quando si passa da STATO DI SALUTE a STATO DI

MALATTIA. à

Si parla di alterazione dell’equilibrio del biofilm della placca dentale DISBIOSI

OMEOSTASI MICROBICA: equilibrio tra comunità microbica ed ospite

OSPITE SUSCETTIBILE: difetti di immunoregolazione, immunodeficienze, malattie sistemiche, obesità,

fumo, stress, Età, problemi ormonali, Scarsa igiene orale, dieta ricca di carboidrati, terapie antibiotiche.

Questi fattori possono alterare omeostasi e

permettere a microrganismi ospiti di entrare a far parte del biofilm ospite se non erano presenti o se erano

presenti di prendere il sopravvento.

Si passa quindi da simbiosi commensale a patologia come carie e malattia parodontale.

CARIE DENTALE

CARIE DENTALE: distruzione localizzata e progressiva dei tessuti del dente ad opera degli acidi

(soprattutto acido lattico) prodotti dalla fermentazione batterica dei carboidrati assunti con la dieta

La FREQUENZA delle assunzioni di saccarosio ed il TEMPO di stazionamento a pH acido

influenzano la capacità tamponante della saliva

Con introduzione di carboidrati, i batteri della placca cominciano a usare saccarosio come fonte energetica.

- Individuo che fa tanti pasti:

In una ventina di minuti si osserva rapida caduta di pH nella placca.

Poi pH da valore di poco piu di 7 cade a valori al di sotto del fattore critico che è di crica 5.5.

La saliva ha però capacita tamponante ph risale e torna verso la neutralità.

à

Ogni volta che individuo fa spuntino, caffè, pranzo … eccetera c’è oscillazione continua del va-

à

lore di pH intorno a valore critico a livello del quale inizia dissoluzione dei tessuti del dente.

- Se individuo fa solo pasti principali è molto meno a rischio.

CARIE è UN PROCESSO MULTIFATTORIALE:

- SUSCETTIBILITA’ DELL’OSPITE:

ETA’: > incidenza fino alla pubertà

o SESSO: > incidenza nel sesso femminile (gravidanza, allattamento, mestruazioni)

o GENETICA: caratteristiche anatomiche della dentatura, microstruttura dello smalto, flusso

o salivare, composizione della saliva

MALATTIE: disfunzioni endocrine, diabete, malattie infettive ecc..

o

- FATTORI AMBIENTALI:

ABITUDINI ALIMENTARI: consumo di cibi ricchi di carboidrati; frequenza delle assunzioni di

o saccarosio e tempo di stazionamento a pH acido

ESPOSIZIONE AL FLUORO

o ABITUDINI DI IGIENE ORALE

o CONDIZIONI SOCIO-ECONOMICHE

o

- MICRORGANISMI CHIAVE: con potenziale patogeno. COMPOSIZIONE E PROPRIETA’ DEI BATTERI

CHE COMPONGONO IL BIOFILM ORALE

Il riconoscimento dell’eziologia microbica della carie dentale ha tardato ad arrivare…

- Già dai tempi più antichi, molto prima della possibilità di visualizare i microrganismi, l’uomo aveva

sospettato una possibile relazione tra certi “vermi dei denti” (così descritti in un testo sumerico nel

5000 A.C.) e la carie dentale;

- Tuttavia la vera identità dei “vermi dei denti” fu svelata solo migliaia di anni più tardi.

ANTOINE VAN LEEUVENHOEK il primo “microbiologo orale”: con un microscopio rudimentale da

egli stesso costruito fu il primo a descrivere i batteri della placca (1684)

Nonostante i primi microrganismi ad essere descritti siano stati i batteri orali e la relativa facilità

con cui è possibile ottenere campioni di placca, è sorprendente che l’eziologia batterica della carie

non sia stata dimostrata prima del 1960

Fine del XIX secolo: contributo decisivo ad opera di W.D. Miller

Aspirante dentista, aveva studiato le scienze naturali, e lavorava presso il laboratorio di Robert Koch

(microbiologo) a Berlino dove trascorreva tutto il suo tempo a cercare di identificare i germi responsabili

della carie.

Nel 1890 nel suo libro “Microorganisms of the Human Mouth” (Miller, 1890), enuncia la:

TEORIA CHEMIOPARASSITARIA DELLA CARIE:

In individui suscettibili che consumano carboidrati fermentabili i microrganismi orali convertono questi

carboidrati in acidi e ciò causa la demineralizzazione dei denti

A causa delle limitate tecniche di isolamento e coltivazione dei batteri a disposizione nel 19° secolo, Miller

fu incapace di identificare i batteri responsabili della carie

1924: un certo Clarke J.K. per primo isolò un batterio da una lesione cariosa umana e lo

chiamò Streptococcus mutans a causa della sua forma non perfettamente sferica

Clarke JK (1924). On the bacterial factor in the etiology of dental caries. Br J Exp Pathol, 5: 141–147

Dimostrò che il batterio era capace di fermentare numerosi zuccheri e di far cadere il pH a valori di

4.2 in un brodo contenete glucosio, ma non riuscì a dimostrare formalmente che questo batterio causa

la carie

Metà del XX secolo (anni 60’): prova definitiva di una relazione causale tra batteri orali e carie dentale

grazie al contributo di Keyes e Fitzgerald in modelli di animali «germ free».

Per dimostrare una relazione causale tra una specie batteria e una malattia si è dovuto ricorrere ad

animali che erano liberi da batteri.

Keyes PH (1960). Infections and transmissible nature of experimental dental caries. Arch Oral Biol, 1: 304–

320.

Fitzgerald RJ, Keyes PH (1960). Demonstration of the etiologic role of streptococci in experimental caries in

the hamster. J Am Dent Assoc, 61: 9–19.

Questi autori dimostrarono:

- NATURA INFETTIVA: Criceti inoculati nella cavità orale con una coltura pura di streptococchi svilup-

pavano carie

- TRASMISSIBILITA’: Streptococchi isolati da una lesione cariosa di roditori da esperimento inoculati

nella cavità orale di roditori liberi da carie causavano l’insorgenza delle lesioni cariose, a differenza

di quanto osservato nei controlli

LA CARIE DENTALE COME MALATTIA INFETTIVA: STUDI NELL’UOMO

Nonostante gli studi sugli animali la correlazione tra batteri orali e carie nell'uomo può essere ottenuta solo

da osservazioni indirette:

- individui trattati per lunghi periodi con antibiotici a largo spettro presentano una ridotta incidenza

di carie

- studi epidemiologici hanno più volte dimostrato una stretta associazione tra alcuni batteri orali

(streptococchi "mutans") e sviluppo di carie, anche se tale associazione non è sempre univoca

I dati provenienti da osservazioni epidemiologiche indicano che l'incremento del consumo di saccarosio si

accompagna ad un aumento dell'incidenza di carie nell'uomo:

- Nella popolazione esquimese o tahitiana l'introduzione di consistenti livelli di saccarosio nella dieta

ha condotto ad un amento dell'incidenza di carie;

- Simili risultati ottenuti in volontari umani;

- Durante la 2° guerra mondiale si è assistito ad una riduzione dell'incidenza di carie sia in Europa

che in Giappone

I PRINCIPALI GENERI DI BATTERI CARIOGENI NELL’UOMO:

Streptococcus: Genere molto vasto implicato in un ampio spettro di malattie che vanno dalla setti-

1. cemia alla carie.

Include anche numerose specie non coinvolte nella carie (es: S. pyogenes, S. pneumoniae, S. agalac-

tiae..)

2. Lactobacillus

Actinomyces

3.

STREPTOCOCCHI ORALI:

COCCHI GRAM+, DISPOSTI IN CATENELLE, CATALASI-, IMMOBILI, ASPORIGENI, ANAEROBI

FACOLTATIVI, appartenenti al gruppo dei "viridanti"

Sono stati isolati da praticamente tutti i siti della cavità orale e rappresentano i microrganismi prevalenti della

placca dentale

- Specie generalmente a bassa patogenicità presenti nelle vie aeree superiori e nella cavità orale;

- Non sono divisibili in gruppi secondo la classificazione di Lancefield;

- Bassa virulenza: non hanno capsula né proteina M e non producono leucocidine;

- Includono specie ritenute i maggiori responsabili della carie dentale

- Possono comportarsi da PATOGENI OPPORTUNISTI!!; in seguito a chirurgia orale possono entrare

nel circolo sanguigno; in soggetti con difetti valvolari possono essere responsabili dell’ENDOCAR-

DITE BATTERICA subacuta

Studi molecolari di omologia DNA-DNA hanno permesso di suddividere gli streptococchi orali in 4

gruppi principali:

1) Mutans

2) Salivarius

3) Anginosus

4) Mitis

Streptococchi del gruppo «mutans»: i più strettamente associati alla carie dentale

Forma: non perfettamente sferica, ma di cocco-bacillo (nome). Disposizione in corte catenelle. m.o. molto

omogenei per forma e dimensione.

Colonie: piccole, a forma di cono, strettamente adese all'agar, con margini irregolari. Su terreni contenenti

saccarosio sono circondate da polisaccaridi extracellulari che conferiscono a queste colonie un aspetto molto

lucente.

Grande attenzione quando ne fu dimostrato il potere cariogeno in animali da esperimento;

Furono isolati numerosi ceppi da lesioni cariose dell'uomo e degli animali, anche grazie allo sviluppo di

terreni di coltura idonei e fu evidenziata una notevole eterogeneità tra i vari isolati

Oggi: si riconoscono

- 8 sierotipi (a, b, c, d, e, f, g, h) sulla base dei carboidrati associati alla parete di peptidoglicano (per

lo più residui di glucosio e galattosio legati tra di loro secondo diverse combinazioni con legami a e

b);

- 7 specie sulla base dell'omologia DNA-DNA

- 7 biotipi sulla base di caratteristiche biochimiche

à

COLLETTIVAMENTE CHIAMATI Streptococchi del gruppo "mutans"

Si differenziano tra di loro anche per profilo biochimico

S. mutans (sierotipi c,e,f):

Corrisponde al m.o. originariamente isolato da Clarke

è la specie più frequentemente isolata da campioni di placca dentale

è strettamente associato alla carie sia dei bambini che degli adulti.

S. sobrinus (sierotipi d, g):

• è la seconda specie isolata per frequenza;

• è anch'esso associato alla carie;

S. rattus (b), S. cricetus (a):

• raramente isolati dall'uomo, sono stati isolati per la prima volta dal topo e dal criceto dove determi-

nano insorgenza di carie.

• Raramente è possibile isolare più di una specie di Streptococchi "mutans". La coesistenza di S. mu-

tans e S. sobrinus è associata ad un elevato tasso di carie.

ASSOCIAZIONE TRA STREPTOCOCCHI DEL GRUPPO MUTANS (MS) E CARIE

DENTALE.

Si è analizzato la distribuzione di varie specie dello streptococco mutans in pazienti.

Si prelevò la placca dentale in individui suddivisi in 3 cruppi:

- CA: carie attiva

- CI: carie inattiva avuta in precedenza e curata

à

- CF: carie free

Si vide prevalenza di S.mutans.

La differenza nelle percentuali è stata dimostrata statisticamente significativa.

I batteri in esame vengono isolati con maggiore frequenza nei batteri che hanno la malattia rispetto a quelli

che non ce l0hanno.

Ma c’è anche certa frequenza di individui che non hanno mai avuto la malattia ma che hanno batteri.

E un gruppo di individui che ha avuto malattia e ora non ce l’hanno più e in cui non si trovano batteri.

Associazione significa che devo trovare maggiore frequenza in soggetti malati ma li possono trovare anche

in soggetti non malati.

Nonostante la stretta associazione tra MS e carie numerosi studi hanno riportato risultati contrastanti

ALTI LIVELLI DI MS IN ASSENZA DI SEGNI DI CARIE

- Per presenza di altri batteri che "consumano" l'acido lattico (Veillonella cocco Gram- anaerobio ob-

bligato)

- Per presenza di altri batteri che producono ammonio per deaminazione dell'urea o dell'arginina (S.

salivarius, S. sanguis)

- Tipo di dieta

Es. studi in Africa hanno rivelato alti livelli di MS in assenza di segni di carie. I ceppi isolati erano ca-

riogeni in modelli animali in maniera paragonabile ai ceppi isolati in Paesi industrializzati

à CARIE È MULTIFATTORIALE

B) BASSI LIVELLI DI MS IN PRESENZA DI

CARIE

à CI SONO ALTRI BATTERI CON POTENZIALE

CARIOGENO

GENERE LACTOBACILLUS

- casei

- fermentum

- acidophilus

- salivarius

- Bastoncelli Gram+ frequentemente isolati dalla

cavità orale anche se, di solito, rappresentano

meno dell'1% della microflora orale. La loro proporzione aumenta considerevolmente nelle lesioni

cariose avanzate sia dello smalto che delle radici ed in seguito alla colonizzazione della cavità orale

da parte degli Streptococchi “mutans” che, causando un abbassamento del pH, creano un ambiente

acido favorevole alla colonizzazione dei Lattobacilli

Mentre streptococchi li ritroviamo in stadio precoce, i lactobacilli li ritroviamo nelle le-

o sioni cariose avanzate

- Batteri fermentanti (FERMENTAZIONE OMOLATTICA O ETEROLATTICA)

- Altamente acidurici

- A differenza degli Strept. “mutans” non aderiscono facilmente alla superficie liscia del dente e, per-

tanto, richiedono zone di ritenzione naturali od iatrogene per la colonizzazione.

- Sono inoltre più resistenti degli Strept. “mutans” alla clorexidina ed all’effetto inibente del fluoro e

si trovano in zone difficilmente raggiungibili con adeguate pratiche igieniche.

- C’è una correlazione significativa tra carie dentale e quantità di Lattobacilli sia nei bambini che negli

adulti

ESISTE UNA CORRELAZIONE TRA LA CARICA BATTERICA NELLA PLACCA E NELLA

SALIVA:

se soggetto ha una carica elevata di batteri cariogeni nella placca, questi possono essere rilasciati nella saliva

dove aumentano rischio di sviluppare carie.

ELEVATE CARICHE BATTERICHE SONO CORRELATE AD UN AUMENTATO RISCHIO DI

CARIE anche se rischio latente di sviluppare carie non significa necessariamente di eliminare la carie perché

à

bisogna analizzare nell’insieme tanti fattori esame test-salivare che permette di analizzare vari parametri

di rischio come flusso salivare, pH della saliva, carica microbica della saliva

à sono stati sviluppati test molto rapidi che permettono quantificazione di streptococco mutans e

lattobacilli nella saliva per stabilire un rischio di carie nel soggetto.

Terreno selettivo per S. mutans: MITIS-SALIVARIUS-BACITRACINA-AGAR: permette la crescita di

S.mitis, S. salivarius e di alcuni enterococchi. L’aggiunta di bacitracina e di alcuni sali (che danno il colore

blu) rende il terreno selettivo per gli streptococchi del gruppo mutans; questo e terreni selettivi simili,

costituiscono le basi per i kits commerciali da usare come test da eseguirsi accanto al riunito per la ricerca di

S. mutans

Batteri orali isolati dalla saliva su Mitis-

salivarius agar. Le colonie ruvide sono S.

mutans

ESEMPIO DI KIT COMMERCIALE (CRT

- Caries Risk Test-bacteria)

Determina il numero di S. mutans e di

Lactobacilli presenti nella saliva mediante un

terreno agarizzato selettivo.

- lato con il terreno chiaro (Rogosa

agar): determinazione dei Lactobacilli

presenti nella saliva

- lato con il terreno scuro (Mitis saliva-

rius agar con bacitracina): determina-

zione di S. mutans presente nella sa-

liva o nella placca.

Non va’ utilizzato durante una terapia antibiotica.

È necessario lasciar trascorrere almeno 14 giorni dalla conclusione della terapia prima di effettuare il test.

Non vanno utilizzati collutori antibatterici nelle 12 ore antecedenti il test.

Il test viene eseguito ambulatorialmente dall’odontoiatra, dall´igienista dentale o dall´assistente alla poltrona.

1. Stimolare la salivazione del paziente facendogli masticare la pasticca di paraffina presente nella

confezione (stacca i batteri dai denti).

2. Raccogliere la saliva in un apposito misurino.

3. Estrarre dalla provetta il terreno di Agar.

4. Applicare una pasticca di NaHCO alla base della provetta (quando viene in contatto con la saliva sviluppa

3

CO che facilita la crescita).

2

5. Staccare con attenzione la pellicola protettiva del terreno senza toccare il terreno di coltura

6. Utilizzando la saliva precedentemente raccolta, umettare entrambi i lati del terreno di Agar, senza

strisciarli, con l’ausilio di una pipetta.

7. Eliminare gli eventuali eccessi di saliva.

8. Inserire l’asta del terreno di Agar nella provetta e chiudere bene.

9. Con una penna ad inchiostro indelebile, contrassegnare la fiala con il nome del paziente e la data.

10. Inserire la provetta in posizione verticale in un incubatore, per 48 ore a 37 °C.

11. Prelevare la provetta dall’incubatore e valutare la presenza delle colonie di Lactobacilli e S. mutans

confrontando il terreno di Agar con la Model Chart allegata.

Numeri CFU superiori a 10 alla quinta di S. mutans e/o lactobacilli per 1 mm di saliva indica ALTO rischio

di carie

ACTINOMYCES

- Corti bastoncelli GRAM+, pleiomorfi. Le singole cellule sono di forma bastoncellare, ma quando

crescono su terreni solidi danno origine a colonie con filamenti intrecciati simili alle colonie di fun-

ghi;

- Fermentano il glucosio con produzione di acido lattico, acetico e succinico.

- Rappresentano una larga proporzione dei batteri della placca soprattutto sulle superfici approssi-

mali e del solco gengivale anche in condizioni di salute

- A. naeslundii e A. viscossus sono stati associati alla carie delle radici anche se non da tutti gli studi

NUOVI CARIOGENI:

- Scardowia wiggsiae: Anaerobio Gram+; isolato ad alta frequenza dalle lesioni cariose di bambini in

presenza o meno di S. mutans

- Bifidobacterium dentium Gram positive and anaerobic bacteria. They are known to mainly reside

in the gastrointestinal tract and for also being present in the oral cavity. B. dentium is also responsi-

ble for approximately 8% of the bacteria cultured from dental caries.

- Slackia exigua

- Gemella spp

- Granulicatella spp

- Candida albicans: è UN FUNGO. La cariogenicità di questo fungo è stata dimostrata nei ratti. L’asso-

ciazione tra fungo e carie è stata dimostrata anche nell’uomo. Il fungo può essere trasmesso ai

bambini dalle loro madri

CHE COSA SA FARE UN BATTERIO CARIOGENO?

COME ENTRA A FAR PARTE DEL BIOFILM ORALE?

1. ADERIRE TENACEMENTE ALLA SUPERFICIE DEI DENTI:

se batterio si sposta o si attacca e si stacca allora l’acido non viene più prodotto in quel punto e non

c’è concetto somma.

Può essere fatto con due modalità:

- Meccanismi SACCAROSIO-INDIPENDENTI: grazie a presenza di adesine multiple.

Glicoproteine della saliva formano pellicola e poi ci sono molecole adesine sulla superficie dei bat-

teri complementari a recettori della pellicola dello smalto.

Entrano in gioco in una fase iniziale di aderenza alla pellicola dello smalto es: l’antigene I/II di S. mu-

tans, la proteina SpA di S. sobrinus

- Meccanismi SACCAROSIO-DIPENDENTI: capacità di produrre polisaccaridi extracellulari. Batterio

produce degli enzimi che sono delle GLICOSILTRANSFERASI enzimi ancorati alla parete o rilasciati

à

dalla cellula batterica nell’ambiente extracellulare.

Questi enzimi attaccano il saccarosio formato da glucosio-fruttosio e tagliano il legame.

Poi prendono residuo di glucosio e lo polimerizzano a formare delle file lunghissime poli-

à

o mero glucano.

Oppure prendono fruttosio e lo polimerizzano a formare fruttano.

o Glucano e fruttano si depositano sulla superficie del batterio dove formano una matrice

o extracellulare che avvolge interconnette batteri tra di loro.

Essendo zucchero funzionano come una colla caramello è appiccicoso come una colla

à

che batterio usa per aderire anche sulla superficie liscia della dente che è una zona solita-

mente difficile da colonizzare.

Rapida formazione ed accumulo di una placca altamente coesiva ed aderente anche in presenza un numero

relativamente basso di cellule di S. mutans!!!!!

2. CAPACITA’ DI PRODURRE POLISACCARIDI INTRACELLULARI:

- S. mutans ed altri batteri cariogeni possono produrre anche polisaccaridi intracellulari (PI) che pos-

sono essere immaganizzati ed utilizzati nei periodi di "affamamento" che, nella cavità orale, si alter-

nano a periodi di disponibilità di nutrienti.

- La produzione di PI può essere considerato un fattore di virulenza di S. mutans: mutanti privi del

«sistema di stoccaggio» dei IPS risultano meno cariogeni dei ceppi parentali nei modelli animali.

3. PRODURRE UN ELEVATO NUMERO DI BATTERIOCINE (MUTACINE)

Streptococco mutans produce almeno 5 divers mutacin. Alcune ad ampio e altre a ristretto spettro.

Servono al batterio per farsi spazio nella placca e uccidere i competitori.

Molti studi hanno suggerito che attiivtà di mutacine può essere correlata alla sua prevalenza e al

suo stabilirsi con successo nel biofilm dentale.

4. TRASPORTARE ED INTERNALIZZARE RAPIDAMENTE GLI ZUCCHERI RISPETTO AD ALTRI BATTERI

COMPETITORI DELLA PLACCA

Questo avviene perché Molti batteri cariogeni hanno almeno TRE diversi sistemi di trasporto degli

zuccheri molto versatili e che permettono di sopravvivere in condizioni alterne di disponibilità e di

scarsezza di zuccheri (intervalli tra i pasti)

1) SISTEMA DELLE FOSFOTRANSFERASI MEDIATO DAL FO-

SFOENOLPIRUVATO (PEP-PTS):

2) SISTEMA DI TRASPORTO METABOLICO MULTIPLO DEGLI

ZUCCHERI

3) PERMEASI ATP-DIPENDENTI (espresso anche a bassi valori

di pH)

CONVERTIRE RAPIDAMENTE GLI ZUCCHERI IN ACIDI (BAT-

5. TERI ACIDOGENICI)

Una volta entrati nella cellula gli zuccheri entrano nella VIA

GLICOLITICA con cui sono convertiti in acidi organici che

vengono escreti dalla cellula con produzione di energia: MS

producono acido alla più alta velocità;

I lattobacilli creano le condidizioni di pH più basso

MANTENERE ELEVATE ATTIVITÀ METABO-

6.

LICHE ANCHE IN CONDIZIONI AMBIENTALI

ESTREME COME BASSI VALORI DI PH (BATTERI

ACIDURICI) E TOLLERARE AMBIENTI ALTAMENTE ACIDI PER PERIODI PROLUNGATI

La sopravvivenza in ambiente acido dipende dalla capacità del germe di mantenere valori

di pH intracellulari fisiologici nonostante i valori di pH acido extracellulare. Questo è otte-

nuto dai batteri cariogeni (MS, lattobacilli) in due modi:

mediante pompe ad efflusso associate alla membrana che accoppiano a tale processo la

o produzione di ATP (1)

mediante efflusso degli acidi organici, prodotti finali delle vie metaboliche (2)

o

SUCCESIONE MICROBICA DELLA LESIONE CARIOSA

Man mano che si approfondisce si ha una complessiva riduzione del pH che comporta una successione dai

batteri acidurici con i batteri cariogeni primari Streptococchi fino agli altamente acidurici con i lattobacilli.

È l’acido lattico prodotto dalla

fermentazione degli zuccheri che

comporta la dissoluzione dei

tessuti del dente e quindi l’inizio

della dissoluzione del dente.

Questo impatto dell’acido lattico

sulla superficie viene in qualche

modo neutralizzato. Veillonella

lo converte in acido acetico e

acido proprionico. Ma questo

acido lattico può sempre essere

neutralizzato a partire da

composti come urea o

uroarginina in grado di attaccare

l’arginina. E tutti questi enzimi

deamminano l’urea o l’Arg con

3+

produzione di NH . In presenza

di batteri come S. sanguis, S.

cordonis etc… , gli S. possono

essere cariogeni esattamente

come non lo sono. La lesione

cariosa è complessa e ai batteri

acidurici/acidogenici al

peggiorare della lesione vanno associati batteri che sono generatori di

alcali e sono alla base dello stato di salute. Alcuni studiosi hanno

analizzato la capacità argininolitica in gruppi di bambini con carie e

senza carie. Ne hanno dedotto che l’attività argininolitica può essere un

possibile marker per lo stato di salute e i protocolli di valutazione del

rischio di carie.

INTERAZIONE PATOGENETICA

Interazione tra S. mutans e Candida albicans . Ratti coinfettati con

entrabe le specie presentano una più alta probabilità di lesione cariosa

rispetto a quelli infettati con una sola di queste specie. Nell’uomo un indizio che ci fa formare quest’ipotesi è

che sono strettamente correlate: il batterio è strettamente aderente alle ife del fungo e si intercettano anche

canali di flusso che si intercalano tra queste 2 specie. Il fungo produce dei mediatori chimici come segnali

intercellulari e il farnesolo induce l’attivazione del gene per le glicosiltransferasi che si depositano anche

sulle ife del funo e questo rende il fungo

capace di produrre i glucani extracellulari che

gli permettono di aderire saldamente alla

superficie del dente per l’adesione delle

glicosiltrnsferasi sulla superficie delle ife. Per

esempio, lo S. mutans produce acido lattico

per i propri scopi, quindi crea delle condizioni

di microaerofilia che a basso O2 possono

crescere ulteriormente. (vedi ricerca su slides).

Ci sono molti esempi di ointerazioni

patogenetiche inter-KINGDOM tra candida

albicans e S. mutans.

CARIE E BATTERI CARIOGENI PARTE

II

Associazione tra S. mutans e bambini è molto

forte: 9 bambini su 10 hanno elevate concentrazioni di S. mutans e sono il 30-50% della flora batterica della

placca. Rispetto agli adulti il tasso di colonixzzazione è piuttosto elevatoe e questi bambini sono

maggiormente a rischio di sviluppo della carie.

QUANDO MS COLONIZZANO LA CAVITA’ ORALE DEL BAMBINO?

L’opinione prevalente è che MS richiedono una superficie non desquamante per colonizzare e moltiplicarsi.

A partire dagli anni 2000-2001 in realtà queste specie sono presenti anche prima dell’eruzione dei denti

decidui lungo la linea mediana della lingua che è un ottimo punto di ritenzione di specie batteriche

patogene. Solo facendo studi longitudinali lungo

il tempo si può capire l’indice clinico

sul rischio cariogeno: DMF (decayed

missed filled, somma di denti cariati +

mancanti a causa di carie + otturati).

Quindi, identificare precocemente i

bambini che hanno queste

problematiche, permette di prevenire la carie. MS si trasmettono per trasmissione

verticale al bambino da parte di chi se

ne prende cura (madre, padre, nonni/e

etc…). Analisi molecolari ne hanno

dimostrata la trasmissione, ma esiste

anche una trasmissione orizzontale tra

membri di un gruppo di pari (per

esempio tra fratelli, tra sposi o anche tra

bambini di una classe). Ovviamente

perché si abbia il mezzo, il veicolo della

trasmissione è difficile che si possa

avere il contatto con la placca e ci sono

molti fattori che facilitano la

trasmissione come fattori batterici o

fattori dell’ospite (madri con cariche

elevate trasmettono i batteri con

carichi più elevati e quindi madri con

6

10 MS CFU/mL di saliva hanno una

3

probabilità superiore del 50% a madri che hanno una carica di 10 CFU/mL di saliva). Misure

preventive tese a ridurre il livello salivare di MS nelle madri possono ridurre o ritardare la colonizzazione nei

loro bambini magari con uso di probiotici orali (un po’ come l’uso dell’enterogermina nel caso della

ricolonizzazione della flora batterica intestinale). È anche importante la frequenza dell’inoculo e qui le

misure sono tese a evitare attività che comportino lo scambio di saliva. Nella carie, però, non ci sono

ancora evidenze scientifiche che dimostrino la reale efficacia dei probiotici orali.

Vedi anche ricerca su apparecchi ortodontici removibili slide 64. La rimozione meccacnica della

plascca medianteprocedure di igiene

orale e la riduzione nella quantità e

frequenza di assunzioni di saccarosio

possono quasi completamente

prevenire le carie.

INTERVENTI SULL’OSPITE

DENTE

Si può intervenire con la

fluoroprofilassi per via topica e/o

sistemica con acqua potabile, sale da

tavola, nel latte, nei dentifrici etc…

Ha vari effetti protettivi con

onserimento nei cristalli di

idrossiapatite con formazione di

fluoroapatite che conferisce resistenza

alla demolizione dello smalto.

Interviene nel porcesso di

rimineralizzazione e ha anche una

molteplici effetti antibatterici. IL

FLUORO INIBISCE LA ENOLASI

che catalizza la trasformazione da 3PG in PEP e inibendo la glicolisi si inibiscno si la produzione di

acido lattico che la produzione di polisaccaridi intracellulari. Interferisce anche con la eprmeabilità della

membrana batterica agli ioni. Ha tante attività antibateriche. Gli MS sono molto sensibili anche a bassi livelli

del FLUORO.

Occorre poi implememntare misure di IGIENE ORALE domiciliare o professionale e proteggere le aree

a rischio di carie per ritenzione tramite misure preventive come la SIGILLATURA DEI SOLCHI.

INTERVENTI SULLA DIETA

Anche la DIETAè fondamentale e occorre già agire sulla dieta paterna con elementi atti a rinforzare la

struttura dei tessuti duri del dente. Nel periodo postnatale prediligere l’allattamento al seno e poi usare

possibilmente dolcificanti inerti (mannitolo, xilitolo, sorbitolo) che

non sono fermentabili. La masticazione stimola la produzione di

saliva (fatttore protettivo) e non comporta l’abbassamento del pH.

INTERVENTI SUI BATTERI

La clorexidina è un bis-biguanide ed è un antimicrobico ad ampio

spettro e ad alte concentrazioni è un battericida e studi hanno

dimostrato che è efficace nel ridurre la carie nei soggetti ad alto

rischio. Per la presenza del guanido può dare effetti collaterali come

pigmentazioni e annerimenti (anche se oggi esiste un sistema che non

permette questo, è il sistema ADS, anti-discloration system).

VACCINAZIONE

Sebbene l’eziologia della carie sia SOLO parzialmente specifica S.

mutans è strettamente associato allo sviluppo di carie tanto da pensare

di utilizzarlo per procedure di immunizzazione attiva. Si possono

avere possibili danni tissutali della risposta immune contro antigeni strettococciche come per esempio nella

febbre reumatica. Si sono quindi impiegati degli antigeni selezionati di S. mutans in glicosiltransferasi: non è

stata dimostrata nessun efficacia protettiva nei primati e nell’uomo. Ma è proponibile una

vaccinazione di massa? I rischi non sono sufficienti a permettere una vaccinazione di massa. Forse in

soggetti selezionati sarebbe utile (pz affetti da S. di Down o soggetti psichici etc…).

Una possibile somministrazione potrebbe essere per via sistemica, per via orale e mucosale.

MICROBIOLOGIA DEL PARODONTO E DELLE MALATTIE PARODONTALI

Esiste una risposta infiammatoria dell’ospite per cui il criterio può essere diverso e la

classificazione è completamente rivista. La distribuzione delle lesioni può essere localizzata o

generalizzata. La progressione della malattia a decorso rapido, acuta.

Una caratteristica della malattia parodontale è

che si ha il progressivo scollamento della

gengiva con formazione di uno spazio detto

tasca parodontale e i tessuti alla base

dell’epitelio gengivale si ritirano. I batteri imn

questo ambiente devono avere certe

caratteristiche e i parametri clinici di danno

tissutale sono:

1. Sanguinamento al sondaggio

(vasodilatazione è una carrateristica del processo

infiammatorio, osso alveolare è danneggiato e si

riassorbe);

2. Profondità di tasca;

3. Riassorbimento osseo.

Abbiamo molteplici fattori che influenzano come (1) la componente

batterica, un criterio necessario ma non sufficiente per lo svilupparis

della malattia parodontale. La (2) presenza del fluido crevicolare,

essudato di origine plasmatica. Si ha una bassa tensione dell’O2 e si

ha un accumulo di batteri anaerobi stretti e il numero di batteri non è

3 6

molto elevato (10 -10 batteri con AMPISSIMA VARIETA’).

Sempre nel parodonto sano abbiamo una serie di proteine e

glicoproteine che fungono da substrato per molti batteri parodontali

che sfruttano anche il Fe dell’Eme dell’emoglobina dei GR. Le due

caratteristiche peculiari: alta concentrazione di proteine e di fattori

umorali del sistema immunitario.

I principali batteri di questa zona sono il genere streptococcus e actinomyces.

Si stabiliscono numerose interazioni sia positive che negative tra le diverse popolazioni

microbiche, utile a mantenere l’equilibrio microbiologico. Si stabilisce l’OMEOSTASI DEL

PARODONTO.

Cosa fa saltare questo equilibrio?

La placca gengivale per effetto di scarsa igiene orale e questo attiva dei processi infiammatori

perché è la risposta tissutale allo stimolo lesivo e stimolando l’infiammazione, questa comporta un

aumento del flusso del fluido crevicolare che comporta anche un aumento del possibile substrato dei

batteri parodontali. Sono batteri asacarolitici, ma

PROTEOLITICI. Si ha un aumento del

pH e il metabolismo proteico porta al

rilascio di metaboliti azotati che fanno

superare il valore di neutralità e

contemporaneamente diminuisce il

potenziale REDOX. Queste condizioni

ambientali selezionano il tipo di patogeni

e hanno caratteristiche diverse dai batteri

cariogeni.

DISBIOSI NELLA MALATTIA

PARODONTALE

L’accumulo eccessivo di placca con

conseguente infiammazione e aumento

del fluido crevicolare favorisce la

crescita delle specie proteolitiche.

Nell’uomo sono stati fatti studi a partire

dalla fine degli anni ’70 e in quegli anni si è analizzato sul piano microbiologico un campione di

popolazioni di microflora che differiva dai siti sani e non esiste un singolo agente eziologico, ma si

tratta si un’associazione. Ci sono m.o. isolati più frequentemente su soggetti parodontali, ma anche

nel soggetto sano a bassa carica, ma pur sempre presenti si incontrano. L’eziologia microbica è

mista.

I BATTERI PARODONTOPATOGENI Ci sono anche molte altre specie come GRAM – e P.

micra, E. nodatum. Di specie batteriche più

frequentemente associate almeno quelli più comuni

sono da ricordare.

CRITERI PER DEFINIRE UNA SPECIE

BATTERICA PARODONTOPATOGENA

(postulati di Socransky)

• Il batterio deve essere isolato più

frequentemente nei siti malati che in quelli sani;

• La specie deve confermare in animali germ-free la sua patogenicità;

• L’eradicazione della specie deve essere accompagnata dall’arresto della progressione della

patologia;

• In pz. affetti da parodontite si deve avere una risposta sistemica a questi antigeni del batterio

in esame.

La presenza dei batteri non è condizione sufficiente per avere malattia parodontale.

Il complesso rosso è fortemente associato a

parodontite cronica e include m.o. che

compaiono al sondaggio di tasche profonde e

qui ritroviamo moltissime specie che sono

associate anche al complesso arancione. C’è

una succesione microbica nell’evolversi della

malattia con colonizzazione di batteri del

complesso arancione che precede la succesiva

colonizzazione del complesso rosso che trova

le condizioni ambientali favorevoli.

MECCANISMI DI DANNO TISSUTALI

NELLA MALATTIA PARODONTALE

Questi danni possono essere sia diretti che

indiretti. Gli indiretti sono

legati agli effetti

indesiderati della risposta

infiammatoria/immunitaria

dell’ospite. Quelli diretti

sono legati al batterio e al

loro prodotto.

DANNI DIRETTI

I batteri subgengivali e loro

antigeni portano a una

risposta infiammatoria e

una risposta immunitaria.

La risposta immunitaria

può essere cellulo-mediata

o umorale. Il danno tissutale è legato alla risposta infiammatoria con le prostaglandine che portano

a riassorbiemento dell’osso alveolare, am anche il TNF-alpha possono portare a rilascio della

collagenasi e quindi indurre sempre riassorbimento osseo. Gli stesi batteri per effetto diretto

possono produrre tossine per approvigionarsi di nutrienti. I batteri portano anche fattori

superficiali che stimolano il riassorbimento come LPS, acidi teicoci, proteine superficiali.

Abbiamo anche i metaboliti dei batteri istolesivi come NH , composti solforati volatili, acido

3

butirrico, propionico etc…

PROPRIETA’ DEI BATTERI PARODONTOPATOGENI

• Adesione ai tessuti dell’ospite: per la presenza di

adesine.

• Colonizzare e moltiplicarsi in un sito suscettibile:

molti batteri parodontali producono batteriocine e

molti enzimi digestivi come proteasi, glicosidasi.

• Evadere i meccanismi difensivi dell’ospite: per

esempio Aggregatibacter produce una potente leucotossina.

• Promuovere il danno tissutale.

• Invadere le cellule: si nascondono tra le cellule.

INTERAZIONI TRA PATOGENI PARODONTALI SINERGICHE

E’ stato dimostrato che P. gingivalis si attacca con

fimbrie al T. denticola che lo usa nella tasca parodontale.

Il T. denticola lo usa come navetta per ragguiungere le

porzioni più in ipossia. Ma c’è anche un’interazione

trofica tra queste 2 specie.

AGGREGATIBACTER ACTNOMYCETEMCOMITANS

Il nome gli è stato dato per la sua capacità di coaggregare con altri

batteri dal cavo orale. È un anaerobio facoltativo (eccezione), è

immobile, asporigeno e cresce per la presenza del 10 % di CO2. Ha

colonie che assumono la tipica morofologia a stella su agar sangue.

A oggi si conoscono sierotipi diversi sulla base sierologica e alcuni

sierotipi sono 6 (a-f).

AZIONE PATOGENA

Può far parte della flora normale, è stato isolato dalla flora di molti animali e mammiferi. In

particolare, dalla cavità orale ai soggetti portatori c’è una probabilità di trasmissione da genitori

portatori ai loro bambini. Può comportarsi anche da patogeno opportunista in osteomielite,

endocardite e ascessi cerebrali. Il batterio in vivo è stato anche isolato dalle placche aterosclerotiche

e quindi in definitiva nell’insorgenza dell’infarto. La malattia parodontale è a eziologia mista ed

esiste un’ecccezione per cui si tratta di un agente batterico orale associato ad alcune forme di

malattia parodontale (parodontite aggressiva localizzata o PGL, parodontite giovanile localizzata.

PGL

Insorge durante l’adolescenza, è localizzata perché colpisce i premolari o gli incisivi e in corso di

PGL si ha un rapido riassorbimento osseo che può comportare alla perdita di denti nell’arco di 1-2

anni. Nei siti malati di questi pz si può raggungere il 70% della microflora. Ci sono dei fattori

predisponenti si hanno PMN con ridotta capacità di rispondere a stimoli chemiotattici. Il sierotipo b

è quello più frequentemente isolato in PGL. I pz con PGL hanno alti titoli anticorpali per antigeni di

A.a. .

FATTORI DI VIRULENZA

Inanzitutto, è un batterio GRAM – e quindi avrà LPS che provoca necrosi cutanea, aggregazione

piastrinica, attiva i macrofagi e li stimola a produrre IL-

1, IL-10 e TNF-alpha. Ha un fattore inibente la

chemiotassi e un fattore immunosoppressivo.

Inibiscono la chemiotassi dei PMN e la produzione di

proteine e Ig da parte di linfociti T e B. l’

actinobacillina (batteriocina) è una proteina che

agisce alterando la permeabilità della membrana

plasmatica di altre cellule batteriche. Produce anche

esotossine caratteristica rara nei batteri orali.

Questo batterio produce anche la CDT (cytoletal distending toxin, genotossina) che si lega a un

recettore di membrana, penetra dentro al cellula e va fino al nucleo per attaccarsi al DNA. È un

endonucleasi che taglia il DNA a doppia elica e la cellula alla fine muore e causa una varietà di

cellule tumorali. Il batterio ha anche una spiccata capacità adesiva dove forma

dei biofilm. Ma per aderire possiede anche una varietà di

fimbrie e poi in comune con altri patogeni parodontali ha la

capacità di invadere cellule epiteliali passando da cellula a

cellula tramite il dominio basolaterale delle cellule,

all’interno delle qulai è protetto dall’attività degli antibiotici.

TRATTAMENTO FARMACOLOGICO

Comporta la somministrazione di chemioantibiotici

localmente e/o per via sistemica come tetraciclina

(doxiciclina) e metrondazolo che si basa sulla produzione di

radicali anionici che si complessano con le macromolecole

cellulari. Si possono usare anche tatraciclina associato a metronidazolo per ceppi resistenti (è

importante eseguirel’antibiogramma prima di scegliere la terapia antibiotica)

PORPHYROMONAS GINGIVALIS

Appartiene alla famiglia della Bacteriodaceae a bastoncello (cocco-bacillo) GRAM –

anaerobio obbligato, immobile, asporigeno. Su agar sangue forma colonie lisce, lucide,

convesse con progressiva pigmentazione nera (vedi figura a fianco). Dalla sua

fermentazione produce l’indolo, l’ammoniaca, acidi grassi volatili (acido butirrico e

acetico, cause di alitosi). Molti di questi prodotti possono essere causa di danni diretti.

AZIONE PATOGENA

La sua presenza nel biofilm è sintomo di elevato rischio della malattia con

miglioramento della sintomatologia e si rileva raramente nei siti sani e nei bambini. Non sembra

che si trasmetta per trasmissione verticale, ma tra adulti (perché il batterio deve stabilirsi nel

microbiota di un organismo già formato e quindi non quello di un bambino).

FATTORI DI VIRULENZA

LPS è sempre una molecola chiave per questi GRAM-. Può produrre effetti infiammatori, biologici

anche a distanza dal sito in cui è stato prodotto. Ha delle peculiarità strutturali: il core manca di

eptosio e KDO e lipide A che è poco fosforilato e acetilato. È, inoltre, più efficace nell’indurre la

produzione di mediatori infiammatori. Contribuisce al danno tissutale indiretto.

Ha sia delle fimbrie major che minor e gli servono per aderire alla superficie del dente. Queste

fimbrie sono espresse a 34 °C e poi la temperatura diminuisce notevolemente e nei siti malati le T

medie sono più alte a 39 °C e l’espressione delle fimbrie viene ridotta.

È un colonizzatore secondario e può aderire a molti colonizzatori primari che offrono siti per

l’adesione e modificano l’ambiente in senso favorevole per il germe.

FATTORI COINVOLTI NELL’APPROVIGIONAMENTO DI SOSTANZE NUTRITIZIE E

NEL DANNO TISSUTALE Le gingipaine hanno un ruolo

nella distruzione tissutale durante

la malattia parodontale.

Degradano una vasta gamma di

proteine dell’ospite e inducono la

produzione da parte delle cellule

delle cellule dell’ospite come

enzimi quali metallo-proteasi

della matrice che contribuiscono

al danno tissutale (sono

responsabili della particolari

pigmentazioni nerastre sulle

piastre di agar sangue in coltura).

GENERE ENTEROCOCCUS

Sono cocchi GRAM + e disposti singolarmente a catene, anaerobi

asporigeni facoltativi (in origine erano inclusi nel genere Streptococcus). Si

trovano nel tratto genitale femminile, a livello enterico e nella cavità orale

in cui giungono per introduzione di cibi contaminati e si può avere una

bassa carica di enterococchi nella cavità orale. Hanno una resistenza

elevata e vivono in ambienti estremi, resistono all’essicamento e possono

replicarsi in un range tra 10 °C e 45°C. Sono noti per la loro eccezionale

resistenza e possono contaminare l’ambiente ospedaliero ed essere

trasmessi da pz a pz o per mano degli operatori sanitari. Possono provocare batteriemie, endocarditi,

meningiti e sono resistenti ai farmaci. Tra le specie, la più importante è E. faecium che facilmente

acquisisce resistenza.

COINVOLGIMENTO NELLE INFEZIONI ENDODONTICHE

Sono infezioni in cui i batteri hanno accesso all’endodonto e per vari

motivi che prevedano perdita di smalto, cemento per carie, fratture: tutto

questo rappresenta un possibile ingresso della specie patogena ad

ambienti come le radici. Possono essere alla base delle pulpiti o

progredire all’apice della radice e dare un ascesso periradicolare. Si

diffonde fino all’osso alveolare. In questi casi si rende necessario un

trattamento canalare o endodontico e questo cocnsiste nel ripulire tutte le

radici e viene sostituito con materiale inerte e sigillante una volta che

camera pulpare e canale sono detersi. Questo trattamento spesso fallisce

e questo non viene adeguatamente sterilizzato e possono permanere dei

batteri che, una volta sigillato, continuano a proliferare.

Abbiamo infezioni:

• primarie: nelle fasi precoci abbaimo anaerobi facoltativi soprattutto Streptococchi e la fonte

energetica restano i carboidrati e gli anaerobi facoltativi rallentano la loro crescita e per

induzione dell’infiammazione e delle proteine plasmatiche, si ha la prelvalenza successiva di

anaerobi proteolitici obbligati. Mettiamo che la procedura a seguito di trattamento

endodontico;

• secondarie: è frequentemente associato a fallimenti dela terapia edodontica e la prevalenza

va dal 24 al 76% a seconda della rilevazione. E. faecalis è prevalente perché pu essre

presenten a bassse concentrazioni nelle infezioni endododntiche primarie e in virtù della sua

elevata resistenza ai farmaci, presumibilmente sopravvive e oltre a resistere, resiste anche

alla’zione dei medicamenti irriganti

per la sua capacità di formare biofilm.

Quindi, il trattamento enedodontico

può fallire e Enterococcus può

replicarsi facilemente.

VIRUS

Si possono suddividere in 2 gruppi: (vedi figura)

Si possono avere casi di infezione tra pz e casi di

infezioni dell’operatore. Il primo gruppo è dato

da: • Picornaviridae: sono dei piccoli virus a

RNA con una struttura semplice e un

genoma a RNA a singolo filamento

(sRNA). Il capside proteico è icosaedrico ed

è formato da 20 facce triangolari equilatere,

12 vertici e 30 spigoli. Si hanno proteine

pentamenrcihe sui vertici ed esameriche

sugli spigoli. Sono virus nudi, privi di envelope. Abbiamo 6 generi di cui i rpimi tre

importanti per l’uomo: EPATOVIRUS (virus dell’eptatite A), RHINOVIRUS (virus dell

raffreddore con immunità tipo-specifica),

ENTEROVIRUS (tra cui il virus della

Poliomelite e l’enterovirus NON POLIO

A,B,C,D) ;

• HERPESVIRIDAE: Sono grandi virus a DNA lineare e a doppio

filamento, capside icosaedrico e sono rivestiti da involucro

pericapsidico. Infettano sia l’uomo che gli animali. Infettano sia uomo

che animali. All’interno c’è il nucleoide, il capside icosaedrico, il

tegumento nello spazio tra caspide e pericapside e nucleoide che

contiene proteine e genoman virale.

Si numerano da 1 a 8 e questo nome ufficiale è affiancato da un nome comune

con H. simplex di tipo 1 e 2, il virus varicella Zooster, il virus EPV, il

citomegalovirus e i nuovi Herpes virus scoperti più di recente. Quindi fino a

oggi abbiamo 8 Herpes virus che infettano l’uomo. Veniamo spesso in contatto con

questi virus anche in maniera

asintomatica. Gli Herpes virus

tendono a persistere nell’ospite e

quando abbiamo acquisito questi

virus con infezione primaria,

rimangono latenti nelle cellule

gangliari del gangli

trigeminali per il 50% e

con minor frequenza

cervicali, sacrali e

vagali. Durante la

latenza il virus non si

replica, ma sfrutta il

meccanismo cellulare

per la produzione di

alcune proteine che

serve per mantenere un certo pool di virus latentizzati. Il virus in latenza non si replica

e quindi di norma NON si trasmette anche durante la latenza quando le lesioni orali

sono assenti. Chi è affetto da Herpes ricorrenti ha un virus che si può riattivare e inizia

a replicarsi come stress, stati febbrili, fasi mestruali e si periferizza sempre per via

assonica tornando alla periferia per replicarsi al livello periferico nelle cellule epiteliali

della periferia. Possiamo essere infettati sempre in maniera asintomatica e con indagine

sierologica con la presenza di anticorpi, si può verificarne la presenza. Altro virus è il

VIRUS ERPETICO UMANO 3 O VARICELLA ZOOSTER

a distanza di anni per calo dell’immunità

si può avere riattivazione del virus con

Herpes zooster. Il vaccino protegge

sempre anche dal fuoco di Sant’Antonio

e in soggetti vaccinati c’è un effetto di

protezione.

Si ha moltiplicazione del virus della varicella nei

linfonodi locali e poi si porta nel torrente ematico con

viremia e sintomi prodromici che lasciano presagire

qualcosa. Col passare di 1-2 giorni si ha l’esantema

vescicoloso generalizzato. Nell’arco di 10 giorni si ha

guarigione spontanea. L’Herpes

zooster è la riattivazione nei gangli nervosi cranici o spinali e ripercorrendo

come lo Zooster (è sempre un virus neurotropo) si riporta alla cute e porta a un

esantema vescicoloso localizzato.

VIRUS EPV (o Epstein-Barr)

Nei bambini l’infezione è quasi sempre asintomatica o altrimenti si ha nella

mononucleosi infettiva o “malattia del bacio” con infezione delle cellule

epiteliali dell’orofaringe (è associata storicamente ai college americani in cui fu

osservata e studiata con attenzione). In alcune aree geografiche è associato al

carcinoma nasofaringeo (soprattutto nella parte asiatica) e linfoma di Burkitt

(molto presente in Africa equatoriale): il virus è un cofattore dello sviluppo di

questi tumori e contribuisce allo sviluppo dello stesso.

PAPILLOMAVIRIDAE

Sono piccoli virus ubiquitari costituiti da:

• Genoma: DNA a doppio filamento circolare (circa 8000 paia di basi)

• Capside icosaedrico

• Nudi (privi di involucro)

• Presentano un particolare tropismo per le cellule epiteliali della

cute e delle membrane mucose di cui inducono proliferazione;

• Presentano una capacità oncogenica in vitro (posseggono geni

capaci di trasformare ed immortalizzare cellule in coltura) ed in vivo;

Inizialmente associati allo sviluppo di verruche negli ultimi 20 anni hanno

assunto una notevole importanza in quanto sono stati associati ad un vasto

numero di malattie sia benigne che maligne che vanno dalla semplice verruca al cancro della

cervice uterina.

1. Sono stati identificati oltre 100 tipi di HPV, identificati con numeri dotati, di diverso

potere patogeno.

2. Tali tipi sono tipi genetici e non sierologici (come nella maggior parte degli altri gruppi

di virus) cioè variano nella sequenza di basi del loro DNA (almeno del 10%

nell’ambito della stessa specie, del 30-40% tra specie e specie nell’ambito di un genere).

Abbiamo in base al genotipo e alla possibile cancerogenicità tipi a:

Basso rischio: HPV1,2,4,41 associati a lesioni benigne (verruche delle mani e della pianta dei

piedi);

Medio rischio: HPV6, HPV11 producono lesioni mucosali che progrediscono con scarsa frequenza

verso la comparsa di formazioni tumorali; causano lesioni benigne come le verruche anogenitali (o

condilomi acuminati, una malattia contratta per via sessuale) o i papillomi laringei (i più frequenti

tumori epiteliali benigni della laringe);

Alto rischio: HPV16, HPV18 inducono la comparsa di lesioni ad elevato rischio di progredire in

tumori come il carcinoma della cervice uterina per il quale oggi esiste un vaccino.

REPLICAZIONE

Questi virus hanno una particolare modalità di replicazione:

1. Il virus nell’infezione naturale penetra negli strati profondi;

2. Si ha la fase di penetrazione e scapsidamento che libera il genoma virale;

3. L’espressione di geni precoci porta alla produzione di proteine che stimolano la pro-

liferazione cellulare di cellule infettate con aumento delle cellule contenenti il ge-

noma virale;

4. Man mano che le cellule infette migrano negli strati superiori vengono espressi altri

geni (E1,E2,E4,E5) CHE CONTROLLANO LA SINTESI DEL DNA VIRALE;

5. Negli strati

superficiali si ha la

sintesi delle pro-

teine strutturali e il

successivo assem-

blaggio di virioni

maturi infettivi che

vengono rilasciati

dallo strato cor-

neo.

Abbiamo anche

virus presenti nella

cavità orale

provenienti da latri

distretti: HIV, virus

delle epatiti

(B,C,D).

DIAGNOSI MICROBIOLOGICA:

Serve per:

- Identificare l’agente patogeno (microrganismo) responsabile di una malattia infettiva

- Suggerire un appropriato trattamento terapeutico

Può essere:

- DIRETTA: si ricerca il microrganismo o sue proteine o altre componenti (antigene) del suo

genoma. Dove si ricerca? In campioni provenienti dalla sua sede di replicazione

- INDIRETTA: per ricercare gli anticorpi specifici presenti all’interno del sangue (siero o pla-

sma) che l’individuo ha prodotto in risposta al microrganismo.

L’ITER DIAGNOSTICO: DAL PAZIENTE ALLA DIAGNOSI EZIOLOGICA

PRIMO STEP DELLA DIAGNOSI DI LABORATORIO QUANDO FACCIAMO DIAGNOSI

RACCOLTA DEL CAMPIONE CLINICO:

DIRETTA è LA 1)

1. IL CAMPIONE DEVE ESSERE RAPPRESENTATIVO DEL PROCESSO INFETTIVO;

2. DEVE ESSERE RACCOLTO NEL MOMENTO OPPORTUNO DURANTE LA FASE ACUTA DELLA

MALATTIA (quando mi aspetto che sia presente il microrganismo)

3. SI DEVE PRELEVARE UNA QUANTITA’ DI MATERIALE SUFFICIENTE;

4. SI DEVONO IMPIEGARE DISPOSITIVI DI RACCOLTA, CONTENITORI PER CAMPIONI E TERRENI

DI TRASPORTO IDONEI;

5. ETICHETTARE ADEGUATAMENTE I CAMPIONI;

6. SE POSSIBILE EFFETTUARE I PRELIEVI PRIMA DELLA SOMMINISTRAZIONE DI ANTIBIOTICI;

7. COMPLETARELERICHESTED’ESAMECONUNNUMEROSUFFICIENTEDI NOTIZIE, FORMULANDO

ANCHE UNA DIAGNOSI PRESUNTIVA;

8. CONTATTARE IL LABORATORIO SE SONO RICHIESTI ESAMI PARTICOLARI

9. SE IL PAZIENTE È PARTE ATTIVA DEL PRELIEVO (ES: URINA, ESPETTORATO) VA ADEGUATA-

MENTE ISTRUITO;

10. RIDURRE AL MINIMO IL TEMPO TRA LA RACCOLTA DEL CAMPIONE E L’INOCULO NEL TER-

RENO DI COLTURA;

PRELIEVO DEL CAMPIONE:

PROVENIENZA DEI CAMPIONI CLINICI:

I campioni prelevati per la diagnosi batteriologica possono provenire da zone che sono solitamente

sterili (MONOMICRIBICI) (es. sangue, midollo, liquor, vie aree inferiori sono campioni che in

individuo sano sono sterili quindi se ci trovo batterio significa che è responsabile dell’infezione a

meno che non ci siano state contaminazioni) oppure da zone che possiedono una popolazione

microbica residente (POLIMICROBICI) (tratto basso intestinale: feci sono piene di batteri della

à

nostra flora residente, vie aree superiori quindi anche la cavità orale, tratto urogenitale) sappiamo

che ci sono dei microrganismi di base non patogeni

PRELIEVO DI CAMPIONI CLINICI DAL DISTRETTO ORALE:

Nella batteriologia clinica odontoiatrica il prelievo dei campioni clinici è una fase particolarmente

delicata che, se non correttamente eseguita, può dar luogo ad errori, specialmente se il metodo di

analisi prescelto è quello colturale

PRINCIPALI TIPI DI CAMPIONI CLINICI ORALI

TAMPONI MUCOSALI

Sono i più semplici da prelevare;

Possono essere effettuati utilizzando dei semplici tamponi sterili per comuni indagine

batteriologiche

CAMPIONI DI SALIVA

Si ottengono facilmente;

la saliva contiene un mix di tutti i batteri presenti nel cavo orale ed è quindi utile se si vuole avere

un’idea generale dello stato di colonizzazione di un soggetto;

“saliva stimolata”: prevede di far masticare al paziente gomme alla paraffina prima di effettuare il

prelievo della saliva in maniera da dislocare i batteri dalla superficie dei denti ed arricchire il loro

numero nel campione;

si raccoglie la saliva in una provetta sterile

PLACCA SOPRAGENGIVALE

Si utilizza una curette od una spatolina per raschiare il biofilm presente sulla superficie del dente;

si trasferisce in una provetta sterile contenente un terreno di trasporto o una soluzione fisiologica

PLACCA SOTTOGENGIVALE

- Il prelievo può essere effettuato con una curette, ma ciò può essere difficoltoso in caso di ta-

sche parodontali profonde; la curette infatti non può essere fisicamente inserita in tasche più

profonde di 6 mm; ha il vantaggio che rimuove i batteri della placca

- Più spesso si usano conetti di carta bibula sterile (perio paper) che devono essere inserite nelle

tasche parodontali più significative, generalmente le più profonde di ogni quadrante, per un

tempo minimo di un minuto.

- I coni assorbono per capillarità il liquido crevicolare contenente i batteri fluttuanti (potrebbe

non essere rappresentativo di tutti i batteri della placca).

- Prima del prelievo è opportuno isolare il campo con rotolini di cotone, asciugare la saliva e ri-

muovere la placca sopragengivale per evitare contaminazioni con batteri pro-

venienti da questi siti.

2)Il campione una volta prelevato deve essere TRASPORTATO

AL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA.

Se si ricercano germi non labili il campione può essere trasportato al laboratorio

come tale nell’apposito contenitore;

Nel caso si voglia isolare germi labili (facilmente inattivati da agenti fisici e chimici come

essiccamento, sbalzi di temperatura, sbalzi di pH, ossigeno) è necessario utilizzare dei terreni di

trasporto

- Possono essere sia SOLIDI che LIQUIDI;

- Di solito contengono soluzioni tampone e/o proteine (es: siero fetale) che non sostengono

la crescita dei batteri (inattivano le proteasi), ma mantengono la loro vitalità e prevengono

l’essiccamento

3)L’ARRIVO IN LABORATORIO: L’ACCETTAZIONE DEL CAMPIONE

Il nome ed i dati anagrafici del paziente vengono registrati in un sistema computerizzato, insieme al

tipo di campione, la clinica, il medico richiedente, l’ora del prelievo ed il tipo di microrganismo/i

che si deve ricercare (germi comuni o specifiche richieste)

4)VERIFICA DELL’IDONEITA’ DEL CAMPIONE:

5)SCELTA DEL METODO DI DIAGNOSI:

DIAGNOSI DIRETTA DI INFEZIONE BATTERICA:

ESAME MICROSCOPICO DIRETTO

L’esame microscopico in alcuni casi è veramente importante considerando anche che è un esame

rapidissimo che si svolge in pochi min

A FRESCO: motilità, presenza di capsula, etc

-ESAME DI PREPARATI COLORATI: Gram, Ziehl-Neelsen

-ESAME

Si può fare due tipi di diagnosi diretta: esame colturale o test rapidi

ESAME COLTURALE

: si avvale dell’ausilio di terreni di coltura diversi

1) TERRENI LIQUIDI: usati per arricchire il campione, cioè favorire la crescita delle specie che si vuole

isolare se presenti in basso numero

2) TERRENI SOLIDI: usati per osservare le colonie (strutture visibili ad occhio nudo che sono l’insieme

di tante cellule batteriche) e per l’isolamento in coltura pura. Si presuppone che colonia derivi da

singola cellula batterica e che si abbia una coltura pura

3) TERRENI COMPLESSI (RICCHI) ricchi di substrati organici usati come nutrienti (estratti di lievito, di

organo); usati per l’isolamento di germi esigenti o presentati in campioni clinici di norma sterili.

Classificazione sulla base della funzione: I SEGUENTI TRE TERRENI sono usati in laboratorio

per isolamento di germi patogeni da campioni polimicrobici

4) TERRENI SELETTIVI: sono terreni che contengono sostanze che inibiscono la crescita dei batteri

che non vogliamo isolare (selezione negativa). Sono usati per isolare specifici microrganismi da

campioni clinici che possono contenere germi della flora normale.

Si usa con campione polimicrobico (contiene tante specie diverse tra cui quella patogena) à

ES DI CAMPIONI POLIMICROBICI: FECI, TAMPONE FARINGEO, TAMPONE CUTANEO ecc.

se faccio campione di cute infetta prelievo patogeno responsabile dell’infezione ma anche quelli

normalmente presenti. Per isolare faccio semina su un terreno selettivo. Si mette ad incubare a 37

gradi celsius. Ottengo batteri che voglio isolare.

ESEMPI DI TERRENI SELETTIVI:

- AGAR SALE MANNITE: contiene il 7.5% di NaCl che inibisce la maggior parte dei Gram-; terreno se-

lettivo per l’isolamento degli Stafilococchi;

- AGAR McCONKEY: contiene sali biliari che inibiscono la maggior parte dei Gram+; terreno selettivo

per l’isolamento degli enterobatteri (GRAM NEGATIVI)

- THAYER MARTIN: terreno selettivo per l’isolamento delle neisserie patogene. Contiene antibiotici

ed antifungini verso cui le neisserie patogene non sono sensibili

5) TERRENI DISCRIMINATIVI: sono terreni di coltura che permettono di discriminare tra specie batte-

riche diverse sulla base del colore delle colonie nel terreno ci sono degli indicatori che permet-

à

tono di rilevare eventuali reazioni biochimiche avvenute.

AGAR SALE MANNITE: contiene la MANNITE come unica fonte di carbonio; permette di discrimi-

nare gli Stafilococchi patogeni (S. aureus) nell’ambito degli Stafilococchi; La fermentazione della

mannite porta a produzione di sostanze acide. Terreno selettivo perché crescono solo stafilococ-

chi, ma discriminativo perché posso discriminare i diversi stafilococchi.

Colonie acidificanti (gialle): la fermentazione del mannitolo produce acidi che fanno virare il colore

dell’indicatore di pH verso la forma acida. ES: S. aureus

Colonie incolori: il germe non fermenta il mannitolo; le colonie rimangono del colore del terreno

ES: S. epidermidis

AGAR McCONKEY: contiene il LATTOSIO come unica fonte di carbonio; permette di discriminare gli

enterobatteri patogeni (S. typhi) nell’ambito degli enterobatteri.

Colonie acidificanti (rosse): la fermentazione del lattosio produce acidi che fanno virare il colore

dell’indicatore verso la forma acida. ES: E. coli

Colonie incolori: il germe non fermenta il lattosio; le colonie rimangono del colore del terreno ES:

S. typhi

6)TERRENI DI ARRICCHIMENTO O SELETTIVI: sono terreni selettivi liquidi. La presenza

di particolari sostanze o di particolari condizioni fisiche favorisce la crescita in numero delle specie

da arricchire, mentre allunga la fase di latenza delle specie competitrici.

ESEMPIO: TERRENO AL SELENIO PER ISOLAMENTO DELLE SALMONELLE PATOGENE DELLE FECI

Tifo causato da salmonella tifi che deve essere

ricercata in campione di feci dove ci sono

tanti altri batteri: allora io arricchisco cam-

pione in modo da bloccare batteri normal-

mente presenti e favorire crescita della sal-

monella.

Se ASPETTO TROPPO ANCHE GLI ALTRI BAT-

TERI CRESCONO.

COLTIVAZIONE DEI GERMI ANAEROBI:

Varie procedure a seconda della sensibilità all’O2:

- 1). Chiusura ermetica delle provette o aggiunta di olio di vasellina;

- 2). Aggiunta al terreno di agenti riducenti (es: TIOGLICOLLATO) che riducono l’ossigeno ad

acqua;

- 3). Giara per anaerobiosi

All’interno del contenitore, accanto alle piastre, viene sistemata una busta contenente

composti per lo sviluppo di H2 (boroioduro di sodio) e di CO2 (acido citrico e sodio bicarbo-

nato).

I composti vengono attivati mediante l’aggiunta di 10 ml di acqua. Nella busta è presente

anche un catalizzatore che permetta la combinazione dell’O2 contenuto nel recipiente con

l’H2 liberato e la formazione di H2O

- 4). CABINA ANAEROBICA

- L’atmosfera all’interno della cabina contiene: 85% N2; 10% H2; 5% CO2

INCUBAZIONE dei terreni di coltura inoculati con i campioni clinici A 37 GRADI PER TUTTA LA

NOTTE e poi si procede con IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA

A) OSSERVAZIONE DELLA MORFOLOGIA DELLE COLONIE:

COLORE, FORMA, MARGINI, EMOLISI, ACIDIFICAZIONE, ODORE

B) TESTI PRIMARI DI IDENTIFICAZIONE

Si effettuano direttamente sulle colonie sospette senza necessità ulteriore incubazione

TEST DELLA CATALASI

incubazione

Mette in evidenza la produzione di catalasi mediante la formazione di bolle (O ) in seguito

2

all’aggiunta di H O sulla coltura.

2 2

Utile per differenziare Streptococchi da Stafilococchi.

TEST DELLA COAGULASI

Mette in evidenza la produzione di coagulasi mediante la formazione di coaguli in seguito

all’aggiunta della coltura a plasma citratato di coniglio.

Utile per differenziare S. aureus dagli altri Stafilococchi

Una volta identificata la specie è fondamentale il test di sensibilità agli antibiotici per vedere

se patogeno è suscettibile al farmaco che si intende somministrare

Antibiogramma: Indagine di laboratorio per saggiare la suscettibilità di un microrganismo ai

farmaci antibatterici; si può eseguire solo se abbiamo coltivato ed isolato il germe in coltura pura

Raramente effettuato in odontoiatria; usato soprattutto in caso di pazienti con infezioni odontogene

refrattarie alla terapia empirica.

Metodo più usato per eseguire questo test: sistemi automatizzati o manuali con diffusione in

agar (metodo di Kirby Bauer)

- Il ceppo da testare viene strisciato su tutta la superficie di una piastra di agar sterile in

modo da ottenere una crescita batterica consistente ed uniforme (come patina)

- Una volta che lo abbiamo distribuito si aggiunge dei giltri di carta a forma di disco conte-

nenti concentrazioni note di diversi agenti antimicrobici vengono posti sulla piastra. Incu-

bazione di 18 ore a 35°C per consentire la crescita batterica. Antibiotico diffonde in ma-

niera radiale.

- Viene misurato il diametro degli aloni di inibizione osservati sulla piastra intorno a determi-

nati ceppi batterici (in mm) significa che batterio non è resistente a all’antibiotico (se al

à

posto dell’alone si vede crescita batterica significa che è resistente) ed i valori ottenuti pa-

ragonati a quelli standard per il ceppo batterico in esame, in modo da stabilire se è sensi-

bile o meno ad un dato antibiotico (Sensibile, Intermedio, Resistente).

Piu il diametro è lungo e piu il ceppo è sensibile

Attualmente ci sono sistemi automatizzati che PERMETTONO DI SVELARE

CONTEMPORANEAMENTE IL PROFILO METABOLICO E LA SUSCETTIBILITA’ AI

FARMACI DI UN ISOLATO CLINICO es: IL SISTEMA VITEK

6)REFERTAZIONE DEI RISULTATI (VEDI SLIDE 30)

ABBIAMO VISTO BATTERI.

DIAGNOSI DIRETTA DI INFEZIONE VIRALE

ORA VEDIAMO

Virus sono parassiti intracellulari obbligati, quindi dovrò coltivarli su delle cellule, molti virus

quando infettano le cellule le danneggiano, quindi posso vedere l’effetto citopatico. Non tutti i virus

danneggiano le cellule.

L’ISOLAMENTO VIRALE A FINI DIAGNOSTICI SI ESEGUE IN COLTURE DI CELLULE

(colture primarie; linee cellulari)

IDENTIFICAZIONE PRESUNTIVA MEDIANTE OSSERVAZIONE DELL’EFFETTO

CITOPATICO (non dato da tutti i virus) (ECP):

- VIRUS CHE DETERMINANO AGGREGAZIONE A GRAPPOLO DELLE CELLULE (Adenovirus)

- FORMAZIONE DI SINCIZI (virus respiratorio

sinciziale)

- NECROSI E LISI CELLULARE (picornavirus,

echovirus 3)

- EMOADSORBIMENTO (influenza virus A)

- TRASFORMAZIONE (virus oncogenico es.

HTLV-1)

Sebbene sia possibile identificare molti virus dal

loro ECP, questo non ha quasi mai valore

diagnostico assoluto ed è quindi sempre necessario

procedere ad una IDENTIFICAZIONE

(DIAGNOSI DI CERTEZZA). Alcuni virus inoltre

non danno un effetto citopatico evidente es: virus

influenzale

à

QUINDI SERIE DI TEST per confermare il

sospetto diagnostico rilevando l’espressione degli

antigeni

virali specifici nelle cellule infettate es:

• immunoflourescenza diretta (IF) o indiretta (IFI)

• test di neutralizzazione

IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA:

Le cellule infettate vengono incubate con un anticorpo specifico coniugato con un fluorocromo

Il fluorocromo colpito da una determinata lunghezza d’onda (ultravioletto), emette fluorescenza

L’emissione della fluorescenza, osservata ad un microscopio a fluorescenza, indica l’avvenuta

reazione Ag-Ac e quindi la presenza del virus

TEST DI NEUTRALIZZAZIONE

DIAGNOSI DIRETTA DI INFEZIONE MEDIANTE RILEVAZIONE DI

MACROMOLECOLE MICROBICHE: metodi non colturali

RICERCA DI ANTIGENI:

RICERCA DI POLISACCARIDI CAPSULARI MEDIANTE TEST DI AGGLUTINAZIONE

AL LATTICE:

Numerosi test in uso impiegano particelle di lattice ricoperte di anticorpi specifici per rilevare

materiale capsulare di alcuni microrg. quali Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae,

Haemophilus influenzae, Cryptococcus neoformans nel liquor per una diagnosi rapida di meningite

batterica.

Es. sospetto di meningite

Si vanno a ricercare in questo esempio polisaccaridi capsulari. Unisco campione dove mi aspetto di

trovare questi batteri a degli anticorpi legati a particelle di lattice.

Se c’è corrispondenza tra gli anticorpi e gli antigeni si forma un reticolo ben visibile

Con questo test rapido vedo subito che c’è nel liquor il meningococco. Non ho isolato batterio

ma ho visto che c’è

Pozzetti diversi con stesso campione ma anticorpi diversi. RICERCA DI ANTIGENI

MEDIANTE IMPIEGO DI

ANTICORPI SPECIFICI

FLUORESCENTI O

CONIUGATI CON ENZIMI :

TEST DI

IMMUNOFLUORESCENZA

DIRETTA

Impiega anticorpi monoclonali

(Mabs) fluorescenti contro Ag

genere-specifici o Ag specie- specifici.

Dopo opportuni lavaggi la fluorescenza può essere

visualizzata in un microscopio a luce ultravioletta.

Se l’anticorpo è legato all’antigene, il fluorocromo che

è legato emette fluorescenza visibile al microscopio

ELISA

TEST PER IL RILIEVO DI ANTIGENI BATTERICI

1) Piastre commerciali con l’anticorpo specifico legato

2a) Si aggiunge il campione contenente 2b) Si

aggiunge il controllo che l’antigene (batteri) non

contiene l’antigene

3) Si rileva il legame Antigene-Anticorpo

aggiungendo un secondo anticorpo specifico

legato ad un enzima (es: perossidasi o fosfatasi

alcalina) che sviluppa colore con l’aggiunta di

un substrato

RICERCA DI ACIDI NULCEICI BATTERICI O VIRALI:

METODI MOLECOLARI:

voglio vedere se nel dna che ho estratto c’è particolare frammento presente nel batterio specifico.

Una volta che ho estratto il dna a doppio filamento, si denatura e i filamenti si dissociano.

Poi posso farlo associare a delle sonde note

Ho da una parte sonda: frammento di DNA noto che so a quale batterica corrisponde;

dall’altra parte ho il DNA estratto.

DNA

Si fa denaturazione del DNA.

à

Aggiungo la sonda nota se è complementare si lega. La formazione del doppio filamento tra

DNA target e sonda la posso rilevare con vari sistemi come fluorescenza, reazione colorimetrica

enzimatica ecc..

In questo modo posso avere la certezza che nel campione clinico c’è DNA di quel microrganismo.

Una cosa che si può fare in piu è amplificare il dna che viene estratto in modo da rendere piu

à

sensibili questi metodi molecolari e la reazione è la PCR. TECNICA ALTAMENTE

SENSIBILE. Bastano poche copie di genoma per poterne poi avere tante

à

Real time si può usare anche per identificare delle mutazioni importante vederle perché

potrebbero dare resistenza al farmaco.

Si può contemporaneamente vedere batterio ma anche resistenza al farmaco

I metodi molecolari sono più sensibili e rapidi però non danno indice della vitalità (vengono positivi

anche quando microrganismo è morto), mentre nel caso di un test colturale crescono solo i

microrganismi che sono vivi

à Approcci molecolari non sostituiscono quelli molecolari (se non quando microrganismo non può

crescere in coltura)à li affiancano

Altro limite è che non si può ottenere info su sensibilità ad un ampio spettro di farmaci

DIAGNOSI INDIRETTA DI INFEZIONE

SIERODIAGNOSI

Dimostrazione che è in atto una risposta immune all’agente infettivo

presenza IgM indice di infezione recente

- rivelabili dopo 7-10 giorni dall’infezione

- breve permanenza (2-3 mesi)

Presenza solo IgG indice di infezione contratta in passato

- rivelabili dopo 2-4 settimane dall’infezione

- permangono per anni (in alcuni casi per tutta la vita)

SIERODIAGNOSI o diagnosi indiretta

Dal momento dell’infezione il sistema immunitario come risposta umorale anticorpale produce

prima le igM che raggiugnono livelli non elevatissimi che vanno a scomparire e poi le IgG che

rimangono piu a lungo.

E’ importante anche in un altro caso valutare le IgG e le IgM.

- Madre HIV positiva. Si può trasmettere durante gestazione o al momento del parto.

- Come faccio a sapere se il neonato di madre HIV positiva è infetto da HIV.

- Trovo le IgG nel neonato anti-HIV à

questo mi dice pochissimo perché

potrebbero essere le IgG della ma-

dre che attraversano la placenta.

- E’ importante ricercare le IgM in-

à

dice di risposta in atto ma soprat-

tutto non attraversano la placenta.

Vuol dire che le ha prodotte il feto

perché è venuto a contatto con HIV.

COME SI RICERCANO GLI

à

ANTICORPI METODO ELISA

- è una tecnica fra le più usate: semplice, sensibile, veloce (2 ore alla risposta), economica,

reagenti stabili.

- Può essere resa quantitativa con una curva di taratura

Metto nei pozzetti il siero del paziente e se gli anticorpi sono presenti questi si legano.

à

Anticorpo secondario coniugato con un enzima si lega all’anticorpo primario e quando si mette il

substrato, l’enzima da origine ad una reazione colorimetrica.

Dove si vede il colore vuol dire che l’anticorpo si è legato

CASI IN CUI LA MICROBIOLOGIA DIAGNOSTICA PUÒ DARE UN

CONTRIBUTO SIGNIFICATIVO IN CAMPO ODONTOIATRICO

Quando c’è una chiara relazione causa-effetto tra presenza di un agente infettivo e manifestazione

di una patologia es:

- parodontite giovanile

- parodontite refrattaria alla terapia

- lesioni sifilitiche acute

- stomatiti fungine o virali

- ascessi peridentali e periapicali

- lesioni croniche granulomatose (tubercolari, fungine, luetiche)

Per stabilire un indice di rischio di sviluppare una certa patologia ad eziologia infettiva e motivare il

paziente alle misure profilattiche o di igiene professionali es:

- valutare lo stato/grado di colonizzazione da parte di batteri cariogeni

- valutare lo stato/grado di colonizzazione da parte di batteri associati con la malattia paro-

dontale

STREPTOCOCCHI

Sono cocchi GRAM +. Molte specie non sono patogene, mentre altre sono patogene come S.

pyogenes, S. agalactiae e S. pneumoniae. Si classificano in base al tipo di emolisi che producono

sul terreno di AGAR sangue, terreno solido contenente GR. Gli streptococchi si classificano in base

al tipo di emolisi:

• Alpha-emolitici determinano un’emolisi incompleta caratterizzata da un alone verde per

effetto di Hb ridotta (esempio è lo S. pneumoniae o pneumococco);

• I beta-emolitici determinano un’emolisi incompleta e se vengono completamente lisati de-

teminano l’emolisi incompleta o beta-emolisi;

• I gamma-emolitici non determinano emolisi.

Possono essere classificati sulla base della classificazione di Lancefeld con circa 20 gruppi

sierologici identificato con le lettere dell’alfabeto (A-H,K-V). Questa classificazione si basa sulla

presenza del carboidrato C della parete. S.pyogenes (aggiungere)

La proteina M è un aproteina

fibrillare e in questa proteina

esistono circa 100 sierotipi.

È capsulato. È un patogeno

perché è in grado di aderire e

invadere e produrre tante

tossine ed enzimi che

vengono rilasciati all’esterno

e questo è legato anche ad

altri fattori extracellulari che

rilascia all’esterno. Tra i

fattori di virulenza sulla

superficie abbiamo la

capsula, poi l’acido

lipoteicoico (LTA) cje si

trova nelle fimbrie di

superficie con un ruolo din

adesione alla superficie delle

cellule dell’ospite. Poi abbiamo anche il carboidrato C che rappresenta i 2/3 della parete ed è cross-

reattivo con una glicoproteina presente nelle valvole cardiache. Proteina F con funzione di adesina e

di invasina. La proteina M è una proteina fibrillare in parte intremembrana ed è un dimero con la

prozione più esterna NH2-amminoterminale ed è quella che stimola gli anticorpi anti-proteina M e

sono antiprotettivi. La porzione ammino-terminale è responsabile dell’effetto antifagocitario della

proteina.

La proteina M può essere di classe I e di classe II e solo i primi provocano la febbre pneumatica.

Abbiamo anche ESOENZIMI responsabili dell’emolisi su AGAR-sangue (anche se ossigeno-

sensibile) e ha un grande potere immunogeno: si vanno, infatti, a valutare le permanenze della

Streptolisina O che corrella fortemente con le malattie poststreptococciche.

Altra citolisina la Streptolisina S che è ossigeno stabile, la vera responsabile dell’emolisi con

alterazione dei fosfolipidi di membrana. Può anche essere leucotossica con effetti negativi sulla

membrana del fagolisosoma.

Ialuronidasi favorisce l’ingresso del patogeno nell’ospite.

Abbiamo anche esotossine pirogeniche

streptococciche che agiscono come

superantigeni. Se ne riconoscono 4 e

determinano un’attivazione policlonale di

linfociti T e sono, inoltre, resposnsabili

dell’eritema della scarlattina. La reazione

di Dick serve per valutare l’eventuale

sensibilizzazione a queste tossine: se si

forma una reazione eritemato-indurativa,

non c’è stata precedente immunizzazione

nel pz.

PATOGENICITA’

Si trasmette da in divisuo portatore a

indivisuo sano suscettibile. Si

distinguono malattie SUPPURATIVE

(quando è in corso un’infezione da

S.pyogenes) e NON SUPPURATIVE

(che si verificano quando l’infezione da

S. pyogenes si è risolta) e danno malattie poststreptococciche come febbre reumatica e glomerulo

nefrite acuta.

FARINGOTONSILLITE O ANGINA

STREPTOCOCCICA

Si hanno infiammazioni locali orofaringee con placche

biancastre tipiche e rigonfiamento dei linfonodi regionali. Il

decorso è di 7-14 gg e la trasmissione avviene per via

AEROGENA. In alcuni casi il pz. Affetto da angina

streptococcica può presentare un esantema caratteristico detto

SCARLATTINA (e solo se la faringite è determinata da ceppi

piogenici). La terapia è generalmente con penicillina per

evitare le malattie poststreptococciche. La scarlattina si

verifica in individui che si sono già sensibilizzati contro le

SPE (se il ceppo produce tossine diverse) l’area risparmiata è

quella intorno alla bocca con segni tipici di papule diffuse generalizzate e

tipica lingua a lampone.

ERISIPELA

Tra le malattie streptococciche INVASIVE è un’infezione dei tessuti

cutanei e sottocutanei con chiazze rilevate color rosso fuoco che si localizza

in genere agli arti e spesso può interessare anche il circolo ematico.

FASCITE NECROSANTE E SHOCK TOSSICO

Si ha necrosi dei tessuti cutanei e sottocutanei fino ad arrivare ai muscoli e da qui può seguire uno

shock tossico e in particolare può venire nel caso di

fascite o erisipela nel caso di malattia streptococcica

invasiva. La massiccia liberazione di citochine da parte

dei linfociti T e dei macrofagi attivati porta a gravi

effetti sistemici quali vasodilatazione, sepsi con MOF,

ipotensione e shock. (tipica della febbre puerperale che

portava a shock settico legato alla scarsa igiene degli

operatori sanitari).


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131

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38.67 MB

AUTORE

Davo96

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5 mesi fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea magistrale in odontoiatria e protesi dentaria (5 anni)
SSD:
Università: Pisa - Unipi
A.A.: 2018-2019

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Davo96 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Microbiologia e igiene e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Pisa - Unipi o del prof Batoni Giovanna.

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