Microbiologia e Immunologia

IMMUNOFLUORESCENZA:

- Coltura cell di cell infette, presentano a liv citoplasmatico o a liv della Membrana proteine viraliriconosciute da Ac

marcati con un Fluorocromo o con un Enzima (es. Perossidasi)

CORPI INCLUSI: alterazioni osservabili in alcune linee cellulari infettate con determinati virus

-classificazione in base alla localizzazione

a) endocitoplasmatici

b) endonucleari

-classificazione in base alle caratteristiche chimiche:

A) Acidofili= copri inclusi legati alla presenza di proteine virali (INFATTI spesso sono la sede di assemblaggio di

Proteine e Capsidi virali)

B) Basofili= corpi inclusi legati alla presenza di Ac. nucleici

-classificazione in base al numero:

a-Corpi inclusi singoli

b- Corpi inclusi doppi

c- Corpi inclusi a gruppi

-alcuni sono “patognomici”= caratteristici di det specie viraliutili x la diagnostica

es. Ipotesi di Cane affetto dal Virus rabbiaesame Istopatologicopresenza di Corpi inclusi del Negri (= corpi inclusi

acidofili endocitoplasmatici paranucleari nei Neuroni dell’Ippocampo/Corno di Ammone)

RICORDA! Non sempre in caso di Rabbia si riscontrano Corpi inclusi ben organizzati, COSI l’esame Istopatologico è

stato sostituito dall’Esame di Immunofluorescenza (evidenzia l’antigene disseminato sulla cell infettata)

TITOLAZIONE VIRALAE: è importante per determinare la quantità necessaria di Virus x

- Patogenesi di una det malattia

- Epidemiologia (modalità di trasmissione di una det malattia)

- Quantificare livello di rischio nei diversi liquidi biologici x identificare i tessuti bersaglio

- Conoscere la quantità fissa di una sospensione viralex Test di siero-neutralizzazione

- Definire la Soglia di immunizzazione efficacie x un vaccino (quantità min di virus perché il Vaccino corrispondente sia

efficace)

METODI DI TITOLAZIONE VIRALE:

Metodi fisici non molto precisi (INFATTI NON contano solo Virus vivi e infettanti, MA anche Capsidi vuoti/Ac.

nucleici difettivi tendenza a sovrastima delle quantità di Virus presente)

a) Conta diretta delle particelle virali al TEM= il meno utilizzato; conta particelle virali maggiori (facilmente visibili a

M.E)

1. Sparare 1 nanoL si Sospensione in un apposito retino da M.E

2. Applicare la colorazione negativa

3. Miscelare n particelle di lattice (con dimensioni > delle particelle virali)

4. Identificare 1 campo della goccia, facendo rapporto tra n Particelle lattice/n Particelle virali

5. Estendere il rapporto effettuato a tutta la sup

b) Metodo dell’emoagglutinazione= sfrutta un legame esistente tra det virus e alcuni recettori presenti sulla sup dei

g.r di alcune specie animali

-Se Virus emoagglutinante --- g.r emoagglutinabili (contengono il recettore) formazione Agglomerati/Agglutinati se

vengono fatti sedimentare in un pozzetto di una Micro-piastra (con fondo a U)virus emoagglutinina i g.r

formazione Reticolo (colorazione uniforme rosata)

-Se Virus NON emoagglutinante ---g.r virus NON emoagglutinina i g.r tenderanno a concentrarsi sul fondo del

pozzetto formazione Bottone a margini netti

RICORDA!

N Particelle virali in eccesso formazione Aggregati di g.r

N Particelle virali = N Particelle eritrocitarie (Diluizione di equilibrio) possibile formazione Aggregati di g.r

N Particelle virali < N Particelle eritrocitarie NO formazione Aggregati di g.r

NB: NON è considerato un Test specifico, perché:

- i g.r possono essere agglutinati da differenti virus

- uno stesso virus può agglutinare g.r di diverse specie (es. Virus influenzali)

MA è specifica l’inibizione (da parte di anticorpi specifici) di un particolare tipo di Emoagglutine viraliTest sierologico

di inibizione dell’Emoagglutinazione

- Se Sieronegativo (pur contenete anticorpi)incapace di legare un Virus emoagglutinante(in una sospensione di g.r

agglutinabili) Virus emoagglutina i g.r

- Se Sieropositivo capace di legare un Virus emoagglutinante(in una sospensione di g.r agglutinabili)Virus non

emoagglutina i g.r

Questo test può divenire quantitativo, se si diminuisce scalarmente il sieropositivo

c) Amplificazione genica quantitativa= misura il n copie presenti in un determinato tessuto biologico; metodo molto

rapido e utilizzato

Metodi biologici precisi (INFATTI si basano sull’infettività delle particelle virali)

a) Metodo delle placche= molto utilizzato; tipico per Batteriofagi

1. seminare un monostrato cellulare con una det diluizione di virus

2. ricoprire con un terreno semisolido (in cui viene aggiunto dell’Aragosio)funge da tappoimpedisce ai vironi

neoformati di infettare a distanza altre cellule attraverso correnti del liquido colturale

3. (dopo alcuni Cicli replicativi) si assiste all’interessamento in senso centrifugo delle cell infetteformaz di placche di

lisi “fenestrature”

4. (dopo alcuni gg) colorazione con Colorante vitale rosso neutro x evidenziare la presenza delle Fenestrature

(Placcheincolori; Monostratocolorato)

5. Conteggio del N delle Placche di Lisi (espresso in UFP/ml)

NB: le dimensioni delle Placche di lisi variano in base al tipo di Virus (che presentano velocità di replicazione

differente) scopo patognomonico

NB: Se si necessita di identificare una Placca di lisi che presenta una morfologia particolare= forare il Tappo di

Agaraspirare la quantità di particelle virali prendibili (in quanto geneticamente uniformi)

b) Metodo della diluizione limite= molto utilizzato

1. Diluizione in base 10 del Virus

2. Inoculazione su differenti Piastre (min 4) di unità biologica (>pt Colture cellulari permissive; Uova embrionarie;

Animali sensibili)

3. Controllo delle repliche biologiche nelle quali si è riscontrato un Effetto citopaticovalutazione per ogni diluizione il

n di unità biologiche che hanno risposto all’infezione (es. Morte dell’embrione; ecc…)

4. Determinare quale diluizione abbia provocato l’Effetto citolitico del 50% delle unità inoculate

NB: si considera il 50% perché nella curva Dose/Risposta la relazione tra Dose virus—Effetto provocato ha

andamento sinusoide significa: a liv del 50% minime variazione della Dose di virus causano grandi effetti in termini

di % (= zona di grande accuratezza di misurazione)

es. con Piastra miniaturizzate da microtitolazione per colture cellulari di cellule permissive(comprende 96 pozzetti)

In altodiluizioni in base 10

NB: ad ogni diluizione è aggiunta una replica 8 repliche x ogni diluizione

1. Diluizione virus

2. Travasare diluizioni nei 96 pozzetti

3. Aggiungere cellule (ottenute dalla Tripsinizzazione) nei 96 pozzetti sedimentazione + crescita delle cellule

4. (dopo alcuni gg) Fissare + colorare il monostrato cellulare (che sarà presente solo nei pozzetti in cui il virus non ha

infettati le celldove si ha effetto citopatico)

NB: le Particelle virali in una sospensione NON sono mai distribuite omogeneamenteINFATTI a liv della Diluizione

limite (es. 10^-7) alcuni pozzetti risultino infetti e altri no

x aumentare il n dei Pozzetti e quindi anche il Valore statistico applicare Principio dei Valori cumulativi:

alla Diluizione 10^-8 1 pozzetto su 8 con effetti citopatici QUINDI questo pozzetto presenterebbe effetti citopatici

anche con un Virus 10 volte più conc (10^-7)allora nella colonna CPE (del tot cumulativo) si aggiunge alla diluizione

10^-7 anche il pozzetto risultato positivo alla 10^-8

Lo sesso principio è applicato ai pozzetti che NON presentano effetto citopatico, nella colonna noCPE (del tot NON

cumulativo)

5. determinato il Valore cumulativo determinare le % Pozzetti infetti/% Pozzetti NON infetti = il 50% è a cavallo tra

10^-7 e 1’^-8 ( alla diluizione 10^-7= 67%; alla diluizione 10^-8=9%)

−50) −9)

6. applicare Formula della distanza %: (67 / (67 = 0,29% Titolo virale= 10^7,29 se diluisco il virus di

10^7,29 ottengo una Dose citopatica di 50 (quantità di virus capace di infettare il 50% dei pozzetti inoculati)

TASSONOMIA DEI VIRUS: 4000 virus differenti (considerando stipiti e sottostipiti30000)

(Inizialmente) classificazione in 5 Livelli gerarchici

- Ordine (Virales)

- Famiglia( Viridae)

- Sottofamiglia (Virinae)

- Genere (Virus)

- Specie (XXX Virus)

(Odiernamente) classificazione in 15 Step gerarchici aggiornata regolarmente dalla ICTV (International Committe

on Taxonomy of Virus) con Tecniche di Sequenziamento massivo raccolta di info genetiche nelle diverse Nicchie

ecologicheGenbank, centro di info biotecnologiche gestito da HIH americano)

- Reame (4; -viria)

- Regno (9; -viriae)

- Pylum (16; -viricola)

- Classe (36; -viricetes)

- Ordine (55; -virales)

- Famiglia (168; -viridae)

- Genere (1421; -virus)

- Specie (6590) lo step gerarchico più imp dal punto di vista tassonomico

- Sottospecie

- Tipo: Morfologico; Antigenico (Sierotipo)

- Linea genetica: Genotipo (similarità >30%); Subgenotipo (similarità > 15%)

- Ceppo= virus isolato in una nicchia ecologica (NON caratterizzato)

- Prototipo = primo virus isolato (quello meglio caratterizzato) x una particolare specie

- Stipite= virus caratterizzato al meglio delle possibilità (in laboratorio)

MODELLI NON UFFICIALI DI CLASSIFICAZIONE: modelli più utilizzati a scopo diagnostico dal Medico veterinario

-uniscono virus anche molto diversi tra loro

-classificazione

a) Virus enterici= Picornaviridae (gen Enterovirus), Caliciviridae, Astroviridae, Reoviridae (genere Reovirus e

Rotavirus), Parvoviridae, Adenoviridae

b) Virus respiratori= Picornaviridae (gen Rhinovirus), Caliciviridae, Coronaviridae, Paramixoviridae, Orthomyxoviridae,

Adenoviridae

c) Arbovirus (virus trasmessi dagli artropodi)= Togaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae, Bunyaviridae, Reoviridae,

Asfarviridae

d) Virus oncogeni= Retroviridae, Hepadnaviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae

NOMENCLATURA DEI VIRUS:

(Inizialmente) associata a: proprietà clinico-patogene; tropismo di organo; caratteristiche

ecologiche/epidemiologiche MA non considerava la variazione degli effetti, la diffusione/spostamento del virus

Criteri iniziali:

- dimensioni (Ultrafiltrazione; Microscopia elettronica)

- morfologia (Microscopia elettronica)

- stabilità al calore/estremi di pH/solventi dei lipidi/detergenti

- proprietà di antigeni (Metodi sierologici)

Criteri odierni:

- caratteristiche dell’Ac nucleico= tipologia (RNA/DNA)*; mono-/bi-catenario; segmentato/intero; polarità +/-

- strategia replicativa= Trascrizione/Traduzione

- struttura del virus

- sequenziamento nucleotidico (parziale)

* Osservando la digestione specifica: DNA virusè digerito con DNAasi; RNA virusdigerito con Ribonucleasi

Linguaggio formale:

es. Famiglia: Picornav