Microbiologia e Immunologia

Microbi e microrganismi

Caratteristiche

Dimensioni: < 100 micron, visibili solo al microscopio (eccezione: protozoi visibili anche ad occhio nudo). Organizzazione semplice: monotissutali; per lo più monocellulari (alcuni pluricellulari es. alghe; alcuni acellulari es. virus*).

*NB: Anche se non tutti i virus sono microbi. Resistenti a condizioni ambientali estreme + altissima capacità di colonizzazione. Infatti, si trovano in tutte le nicchie ecologiche.

Funzioni

Le loro caratteristiche biochimiche sono responsabili dei principali cambiamenti che avvengono nella biosfera, es. fotosintesi clorofilliana + fotosintesi microbica presenza di O₂ sulla Terra, attività di decomposizione microbica presenza di CO₂ per la crescita di organismi vegetali, microbi unica fonte significativa di N.

Applicati nelle biotecnologie (es. DNA ricombinante per ingegneria genetica/vaccini). Attività: Ciclo bio-chimico; fertilità suolo; microbiologia del rumine; produzione e conservazione alimentare; microbiologia industriale; decomposizione sostanza utili; tossinfezioni; malattie; bioterrorismo.

Teoria evolutiva

Varie ipotesi:

• A) Progenote (cellula primitiva) - 3 domini: archeobatteri; eucarioti; procarioti
• B) Procarioti fotosintetici - cianobatteri fotosintetici, batteri aerobi
• Eucarioti unicellulari

3 Categorie

• 1) Eucarioti: Cellule con vero nucleo; contenenti acidi nucleici, proteine, carboidrati, lipidi; metabolismo cellulare normale; con organelli.
  • Protozoi
  • Funghi
  • Alghe
• 2) Procarioti: Dimensioni minori; cellule prive di un vero e proprio nucleo. DNA (singolo cromosoma cellulare associato a diverse proteine (non istoniche)) non circondato da membrana nucleare; contenenti acidi nucleici, proteine, carboidrati, lipidi; metabolismo cellulare normale; privi di organelli; con parete cellulare costituita da peptidoglicani; duplicazione per scissione binaria.
  • Batteri/Bacteria: bassa resistenza agli antibiotici; comprendono eventuali specie patogene
  • Archeobatteri/Archea: alta resistenza agli antibiotici; sistema enzimatico per sintesi proteica e ac nucleici (simile a quello eucariotico); termofili; producono metano; non patogeni per animali e piante
• 3) Virus e Prioni: Acellulari

Biofilm

Insieme di cellule batteriche sessili associate fra loro insieme ai loro prodotti intracellulari, formazione a colonna/fungo circondate da canali chiusi (replicazione) glicocalice; colonizzano superfici biotiche (tessuti) e abiotiche (protesi).

Tassonomia

Scienza che studia la classificazione degli esseri viventi e dei microrganismi suddivisione degli organismi in gruppi (in base a somiglianze, relazioni evolutive, ecc... ma i criteri variano continuamente grazie ai nuovi metodi di indagine/diagnostici).

Classificazione:

• Ordinamento in categorie tassonomiche tradizionali/Taxa: impostate in un ambito gerarchico dal dominio alla specie.
• Ordinamento gerarchico

NB: Per i batteri si hanno criteri di classificazione più complessi; infatti Nomenclatura: assegnazione nome scientifico utilizzando la nomenclatura binomiale di Linneo (I nome= corsivo maiuscolo Genere; II nome=corsivo minuscolo Specie).

Identificazione: processo che permette di determinare l’appartenenza di un organismo a una specifica taxa.

Tassonomia molecolare

Permette l'analisi genetica:

• Studio delle proteine
• Studio delle dimensioni del cromosoma: se 2 batteri presentano cromosomi delle medesime dimensioni, è probabile che siano geneticamente vicini
• Studio della composizione chimica del DNA: es. osservazione rapporto tra le basi attraverso il contenuto di Guanina e Citosina (es. per Stafilococchi e Micrococchi grossa somiglianza fenotipica, ma grossa differenza di contenuto di C-G)
• Studio dell’omologia: tramite l’ibridazione degli ac nucleici (DNA + DNA) osservazione del grado di similarità omologia tra 2 microrganismi, infatti 2 DNA omologhi possono ibridizzare

Classificazione batterica su base genetica

Basata su 3 principi fondamentali:

• Omologia del DNA: che l’isolato testato appartiene alla stessa specie, il valore di ibridazione 70% indica ceppo tipo
• Caratteri fenotipici
• Contenuto di G-C (in moli) per verificare l’appartenenza di 2 o più ceppi alla medesima specie: utilizzo geni ribosomiali (16S rDNA, gene con porzioni molto ben preservate simili in tutti i batteri + porzioni variabili differenti anche tra batteri molto vicini geneticamente) ottenute sequenze, che vengono comparate a sequenze di batteri già conosciuti su un database online libero.

- Se il grado di somiglianza è 97% i ceppi appartengono alla medesima specie.
- Se il grado di somiglianza è < 95% i ceppi non appartengono alla medesima specie, ma al medesimo genere.

RICORDA! Ad oggi non è corretto parlare di classificazione batterica ufficiale, in quanto la tassonomia è continuamente discussa dagli scienziati.

Classificazione secondo Bergey's Manual (1923)

• I) Eubatteri Gram – con parete cellulare
  • Ia. Spirochte
  • Ib. Gram – aerobi microaerofili, mobili, elicoidali-vibroidi
  • Ic. Bacilli Gram – anaerobi facoltativi
• II) Eubatteri Gram + con parete cellulare
  • IIa. Cocchi Gram +
  • IIb. Bacilli e Cocchi Gram + sporigeni
  • IIc. Micobatteri
• III) Eubatteri privi di parete cellulare
  • IIIa. Micoplasmi e Ureoplasmi
• IV) Archeobatteri

Identificazione di una specie batterica

Sulla base di:

• Caratteristiche morfologiche: forma, dimensioni, motilità, capsula, morfologia delle colonie, fermentazione, presenza di determinate strutture
• Colorabilità
• Prove biochimiche (infatti batteri di specie differenti molto simili morfologicamente possono reagire diversamente alla prove biochimiche)
• Sierologia: sfruttando test di agglutinazione
• Sensibilità agli antibiotici
• Sensibilità ai fagi
• Tecniche biomolecolari
• Spettrometria di massa

Specie batterica

Ceppi batterici con caratteristiche genotipiche/fenotipiche identiche, strettamente correlati e in grado di generare discendenza fertile.

Ceppo batterico

Progenie della subcoltura di una singola colonia pura (popolazione costituita da cellule geneticamente identiche); identificato da numero/lettera/nome; può essere scelto arbitrariamente all’interno di una specie per rappresentarla (sebbene non tutte le colonie pure di un medesimo ceppo presentano caratteristiche identiche); NB: il mantenimento di una forma stabile di ceppo è utile per la ricerca, attività produttiva, aziende, ecc.

Genere (per procarioti)

Insieme di specie con caratteristiche colturali e biochimiche comuni.

Biotipo/Biovar

Insieme di specie con caratteristiche biochimiche differenti.

Sierotipo/Sierovar

Insieme di specie con caratteristiche antigeniche superficiali differenti.

Fagotipo

Insieme di specie interessate da una differente uccisione da parte di fagi.

Classificazione metabolica dei procarioti

In base alla fonte di C e di energia utilizzata:

• Se fonte di C = Composti organici - Eterotrofi
• Se fonte di C = CO₂ - Autotrofi
• Se fonte di energia = Fonti chimiche - Chemio-
• Se fonte di energia = Luce - Foto-

Esempi:

• a) Fotoautotrofi: Alghe verdi/blu; batteri fotosintetici Luce; CO₂
• b) Fotoeterotrofi: Batteri rossi non solfurei fotosintetici Luce; Componenti organici (proteine, lipidi, per lo più carboidrati)
• c) Chemioautotrofi: Solfo-ferro-ammonio-batteri; batteri metano produttori Composti inorganici; CO₂
• d) Chemioeterotrofi: Protozoi; funghi; per lo più batteri Composti organici (sia con fonte di energia che di carbonio)

NB: i batteri necessitano anche di N, Fe, Ra (spesso fungono da coenzimi) sono le sostanze da controllare in un buon terreno da coltura.

Classificazione dei batteri in base alle T ottimali di crescita

• a) Psicrofili = T basse = 0-15°C (batteri associati alla scarsa salubrità degli alimenti)
• b) Mesofili = T ottimale = 25-40°C (i più comuni in ambito veterinario)
• c) Termofili = T ottimale = 60-80°C (per lo più batteri sporiferi)
• d) Ipertermofili/Termofili ex = T elevatissime (batteri che abitano acque calde vulcaniche)

Classificazione dei batteri in base all’utilizzo dell’O₂ atmosferico

• a) Aerobi obbligati stretti = necessitano di O₂, NON hanno la possibilità di utilizzare processi fermentativi
• b) Aerobi facoltativi = aerobi, ma in grado di crescere anche in assenza di O₂ (utilizzando processi fermentativi o respirazione anaerobica) (es. Eterobatteri E. coli)
• c) Anaerobi obbligati stretti = non possono utilizzare l’O₂ in quanto tossico
• d) Anaerobi aerotolleranti = sopportano la presenza di O₂, ma utilizzano processi fermentativi (es. Streptococchi)
• e) Microaerofili = in grado di crescere senza O₂, e se presente a basse concentrazioni crescono meglio (es. Campylobacter)

Classificazione dei batteri in base al comportamento in relazione alle concentrazioni saline

• a) Alofili = NON sopportano concentrazioni saline molto elevate
• b) Alofili estremi = riescono a sopportare concentrazioni saline elevate (es. Batteri colonizzanti il Mar Morto)
• c) Alofili facoltativi = alcuni sopportano concentrazioni saline >10%; altri (es. Stafilococchi) sono coltivabili in terreni con concentrazione salina = 4-6%

Coltivazione dei batteri in laboratorio

In un terreno liquido (in provetta):

• Aerobi obbligati: tendono a stare superficialmente
• Aerobi facoltativi: tendono a stare soprattutto superficialmente, ma si depositano anche
• Anaerobi obbligati: tendono a depositarsi sul fondo
• Anaerobi aerotolleranti: tendono a disporsi lungo i bordi
• Microaerofili: tendono a trovarsi leggermente al di sotto della superficie

Batterio

Caratteristiche

Dimensioni: spessore= 0,2-1,5; lunghezza=1-10 (50 volte inferiori rispetto agli eucarioti; variabili in base alle condizioni ambientali). Architettura:

• I. Appendici: più superficiali Flagelli; Pili
• II. Strutture di superficie: Capsula; Parete cellulare; Membrana cellulare
• III. Citoplasma: Nucleoide/Cromosoma (DNA); Granuli di riserva

Forma variabile:

• x Cocchi sferica
• x Bacilli bastoncellare, dritta
• Spirilli ricurva

• a) Batteri pleomorfi: cambiano forma in base alle condizioni ambientali (infatti sono di difficile identificazione)
• b) Batteri filamentosi: come sottili filamenti
• I) Batteri sferici: (es. Cocchi, anche se talvolta sono ovalari/schiacciati/allungati) dimensioni = 0,5-1 in fase di accoppiamento con disposizione variabile
• II) Batteri bastoncellari: (es. Bacilli) dimensioni = 1-10 NB: minor caratteristica di raggruppamento morfologico utile; possono essere:
  • Dritti-sottili e allungati: Bacilli (es. Bacillus Clostridium)
  • Piccoli e tozzi: Enterobacteraceae
• Ricurvi:
  • La maggior parte si trovano a singoli bacilli
  • Dopo la divisione, appaiati a coppie di 2 Diplobacilli
  • Tendenza a formare delle catenelle Streptobacilli
  • Corti + ovoidali (molto simili ai Cocchi) Cocco-bacilli
• III) Batteri a spirale:
  • Vibrioni: 1 sola curva (es. Vibrio cholerae)
  • Spirilli: 2-4 curve; motilità sfruttando flagelli (es. Spirillum volutans)
  • Spirochete: a cavatappi; molto lunghi e flessibili; motilità sfruttando filamenti assiali (es. Leptospire)
• IV) Batteri con altre forme: quasi rettangolari, piatte, triangolari, filamentose

Crescita ottimale con un pH= 6.5-7,5. Struttura semplice.

Componenti fondamentali (sempre presenti)

1. Parete (non sempre necessaria): struttura semirigida che determina la forma della cellula.
   • Funzioni: ancoraggio delle appendici, protegge membrana citoplasmatica, protezione fisica da lisi osmotica (quando la pressione osmotica interna > pressione osmotica esterna), capacità di indurre malattia, sito di attacco di determinati antibiotici (es. Penicillina)
   • Composizione chimica particolare utile per la diagnostica (es. distinzione tra Gram + e -)
     • Costituita da: Peptidoglicani + Polimeri complessi
     • Eccezione!: in determinati batteri ha una composizione differente (es. Micobatteri): alta concentrazione di cere + ac micolici conferiscono maggiore resistenza vs agenti chimico-fisici/digestivi + necessaria differente colorazione (Zieh-Neelsen)
2. Membrana citoplasmatica: doppio strato lipidico fondamentale per la vita cellulare
   • Composizione: Fosfolipidi (circa 30%) + Proteine (circa 60%) + Polisaccaridi e altre molecole (circa 10%)
   • Funzioni: corrisponde al reale confine tra interno ed esterno della cellula. Trasporto molecolare:
     • Trasporto passivo= NO utilizzo ATP per diffusione di piccole molecole; fenomeni osmotici; diffusione tramite proteine trasportatrici; secrezione di enzimi extracellulari che demoliscono le grosse molecole
     • Trasporto attivo= utilizzo di ATP per trasporto di molecole (soprattutto dall'esterno all'interno), barriera selettiva alle sostanze ionizzate/molecole > del Glicerolo
     Selettività dipende da
     • Dimensione delle molecole (se > dei pori delle proteine di membrana NON passano)
     • Liposolubilità (sostanze liposolubili passano facilmente)
   • Respirazione/Fotosintesi (NB: solitamente a carico di mitocondri e cloroplasti), regola riproduzione sintesi parete cellulare (attraverso proteine trasportatrici), motilità flagellare + chemiotassi
   • Struttura: bilaminare; “mosaico fluido” di proteine incluse in un duplice strato di fosfolipidi
     • Spessore: 5-10 nm
     • È sottoposta a elevata pressione osmotica endocellulare addossata alla parete cellulare
     • Forma "Mesosomi" (ampie e irregolari invaginazioni; soprattutto per Gram +) aumentano superficie della membrana plasmatica + partecipano a sintesi della parete cellulare + intervengono nella duplicazione (partire da un Mesosoma si accresce verso l'interno formando il setto trasverso, che porta alla divisione cellulare)
     • NB: la differenza nella formazione/separazione del setto trasverso porta a differenti forme e disposizioni dei batteri
3. Citoplasma: rappresenta la maggior parte della massa cellulare
   • Componenti: H₂O (70%-/5%) + Proteine (15-25%) + Ioni organici + Metaboliti intermedi
   • Alta densità di ribosomi (infatti osservazione al microscopio elettronico aspetto granulare) elevata sintesi proteica
     • Ribosomi: rRNA (65%) + Proteine (35%); 2 Subunità (30S + 50S Cost di Sedimentazione 80S)
   • Ribosomi procariotici: cost di sedimentazione=80S; ribosomi eucariotici: cost di sedimentazione=70S; grazie a questo la cellula batterica può essere uccisa/distrutta dall'antibiotico, senza che la cellula eucariota ospite sia intaccata
   • Presenza di Granuli di riserva (Amido; Glicogeno; Lipidi; Polifosfati) + Plasmidi (piccole molecole di DNA extracromosomiali; composte da 5-100 geni non indispensabili; con replicazione autonoma essendo trasferibili da una cellula batterica all'altra veicolano geni codificanti per la resistenza agli antibiotici/tolleranza a sostanze tossiche/produzione di tossine/sintesi enzimatica)
   • Assenza di Sistemi con membrane interne: Mitocondri; Cloroplasti; Apparato del Golgi; Centrioli; Citoscheletro
4. Nucleoide/Area nucleare: area in cui si concentra il materiale genetico (Cromosoma batterico= 1 molecola circolare/talvolta lineare di DNA a doppio filamento)
   • Corrisponde a circa il 10% del volume cellulare
   • Localizzazione: solitamente centrale
   • Talvolta ve ne sono di più (in seguito a duplicazione DNA non seguita da separazione del materiale citoplasmatico)

Componenti non fondamentali (non sempre presenti) (in base al ciclo biologico/specie microbica)

5. Spore (per Gram +; es. Bacillus, Clostridium; Sarcine; Actinomiceti): Se carenza di C,N,P produzione Endospore (particolari cell inattive NO attività metabolica; NO contengono ATP)
   • Sopravvivono nell'ambiente esterno a condizioni estreme (rimanendo inattive)
   • Localizzazione: (varia in base a specie e genere) a livello della porzione terminale; a livello della porzione subterminale; a livello centrale
   • Processo costitutivo: replicazione cromosoma batterio, formazione evaginazione della membrana citoplasmatica, formazione setto sporale, separazione di una copia del cromosoma (insieme ad una piccola parte di citoplasma) inspessimento del setto sporale, che diviene una membrana a doppio strato cell figlia “Prespora” completa internamente alla cellula madre, fase di sintesi di strati superficiali: Sintesi corteccia (tra i 2 strati iniziali) + Sintesi tuniche (conferiscono resistenza ad ambiente esterno), maturazione completa dell'Endospora, lisi parete cell madre, espulsione Endospora
   • NB: 1 Cellula vegetativa forma 1 Endospora, germinazione forma 1 cellula vegetativa QUINDI NON è una forma di riproduzione, in quanto NON aumenta il numero di cellule neoformate
   • Nucleo: DNA + poco RNA + Ribosomi + Enzimi + altre molecole (Ac. dipicolinico; Ioni Ca⁺)
   • Modificazioni positive per il batterio (es. pochi minuti a 70-80°C) “Terminazione” (passaggio stato inattivo a stato riproduttivo/vitale/vegetativo) = rottura della tunica da parte degli enzimi dell'endospora, entrata H₂O + espulsione Ac dipicolinico, neosintesi di DNA