Microbiologia - approfondimenti

LETTURE+SAGGIO:+

IPOTESI+1:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* ! ! ! !

2* ! ! ! ! !

L’analisi+ evidenzia+ l’assenza+ di+ m.o.+ all’interno+ del+ farmaco+ saggiato.+ L’analisi+ è+ da+ considerarsi+ valida+ poiché+ anche+ il+ test+

terreno+++MCO+riferimento+ha+dato+esito+positivo.+Ciò+significa+che+il+terreno+è+stato+preparato+in+maniera+corretta.++

IPOTESI+2:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* !

! ! !

2* ! ! ! ! !

L’analisi+evidenzia+la+presenza+di+probabili+m.o.+aerobi+(crescita+sul+bordo)+e+di+funghi+(crescita+di+una+sola+prova).+Visto+l’esito+

positivo+ di+ una+ sola+ delle+ due+ prove,+ l’intero+ test+ viene+ ripetuto,+ per+ verificarne+ la+ validità.+ Una+ successiva+ analisi+ potrebbe+

confermare+la+presenza+dei+m.o.,+o+portare+alla+luce+un’eventuale+contaminazione+avvenuta+nella+prima+prova.+

IPOTESI+3:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* ! ! ! !

2* ! ! ! ! !

L’analisi+evidenzia+la+presenza+di+m.o.+anaerobi.+L’analisi+è+da+considerarsi+valida,+poiché+entrambe+le+prove+hanno+dato+esito+

positivo+e+il+test+ha+confermato+la+validità+del+terreno.+

IPOTESI+4:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* ! ! !

!

2* ! !

! !

!

L’ultima+ipotesi+mette+in+luce+i+vari+casi+che+si+possono+verificare:+il+test+MCO+aerobio+ha+dato+esito+positivo,+ma+la+crescita+di+

batteri+al+di+fuori+del+disco+fa+pensare+ad+una+contaminazione+del+terreno+(il+test+va+ripetuto).+Il+test+MCO+anaerobio+presenta+

una+prova+nulla+ed+una+con+crescita+lungo+i+bordi+del+filtro+(il+test+va+ripetuto).+IL+test+MCO+fungo+presenta+un+test+nullo+ed+uno+

positivo+(il+test+va+ripetuto).+In+un+caso+poco+realistico+come+il+seguente,+l’utente+deve+provvedere+a+rifare+nuovamente+tutti+i+

test.+N.B.+La+contaminazione+del+terreno+comporta+un+esito+falso/positivo+(il+test+va+comunque+ripetuto).+

ASSENZA*DI*TOSSICITA’*

Valuta!la!presenza!di!sostanze!tossiche!all’interno!del!lotto.!Si!inietta!la!soluzione!in!esame,!sciolta!in!

soluzione!salina,!in!un!numero!dispari!di!topolini.!Il!tempo!dell’inoculo!deve!essere!lento!15Q30”.!La!

tossicità!del!farmaco!è!stabilita!se!almeno!uno!dei!topolini!muore!dopo!24!ore.!

SAGGIO*DI*INNIETTABILITA’*

Attualmente!poco!utilizzato,!serve!per!vedere!se!il!farmaco!è!iniettabile.!!

! 61!

Il!prodotto!viene!somministrato!ad!un!porcellino!d’India!sulla!schiena.!Se!l’animale!presenta!rossore!

nella! zona! di! inoculo,! danno! locale! o! cambiamento! di! comportamento! allora! il! farmaco! non! è!

iniettabile.!!

ASSENZA*DI*ATTIVITA’*PIROGENA*

Il! seguente! test! permette! di! verificare! l’attività! pirogena! del! farmaco.! Una! sostanza! ha! attività!

pirogena! quando! una! volta! iniettata! all’interno! del! corpo! provoca! una! aumento! della! temperatura!

corporea.! Le! sostanze! con! queste! determinate! caratteristiche! sono! quelle! legate! ai! lipopolisaccaride!

dei!Gram!Q!.!Con!questa!prova!!si!mette!in!evidenza!la!presenza!di!batteri!Gram!–!(endotossina!–!Lipide!

A).!Il!saggio!era!fatto!sui!conigli;!se!si!verificava!un!aumento!di!temperatura!la!presenza!dei!LPS!era!

confermata.!

Oggi!giorno!tale!procedura!non!è!più!utilizzata!ma!viene!utilizzato!il!LAL!Test! !

(vedi!pag.!26!–!effetto!pirogeno)

TITOLAZIONE*MICROBIOLOGICA*DI*UN*ANTIBIOTICO*

L’industria!farmaceutica!che!deve!preparare!confezioni!di!antibiotico!da!vendere,!una!volta!comprate!

la!materia!prima!in!bidoni,!deve!definirne!la!potenza!(attività).!

Nei!flaconi!o!capsule!non!deve!esserci!una!quantità!di!farmaco!superiore!o!inferiore!al!5%!di!quanto!

dichiarato!(se!la!quantità!è!superiore,!il!rischio!è!che!la!terapia!risulti!sbagliata,!se!è!inferiore!si!tratta!

di!frode).!

Metodo+per+valutare+la+potenza+o+attività+

Protocollo:! si! confronta! la! polvere! con! uno! standard! (esistono! delle! polveri! internazionali! standard!

dello!stesso!farmaco!con!potenza!pari!al!100%!del!peso).!

Effettuare! 3! diluizioni! ipotetiche! del! prodotto! da! saggiare! come! se! valesse! 100%! e! 3! diluizioni! note!

dello!standard.!

Eseguire!un!antibiogramma:!misurare!gli!aloni!d’inibizione!dello!standard!e!del!prodotto!da!saggiare.!

!

!!!!ESEMPIO:!standard!12!mm!polvere!ignota!10!mm!

Fare!la!proporzione!12:100%!=!10:X!X=!83%!!

!!!!La!polvere!ignota!ha!una!potenza!dell’83%!(significa!che!in!100!mg!di!polvere!solo!83!mg!sono!di!!!

!!!!principio!attivo)!

!!!Se!nei!flaconi!o!nelle!capsule!devo!mettere!400!mg!di!principio!attivo!(dose)!farò!un’altra!!!!

!!!proporzione:!! 400mg:83%!=!X:100%!x=482mg!!

!!!Devo!pesare!e!mettere!più!antibiotico!nel!flacone!o!capsula!per!compensare!la!potenza!più!bassa.!

!

Prima!di!commercializzare!il!prodotto!bisogna!verificare nuovamente la potenza.

Ripetere! l’antibiogramma! come! in! precedenza,! ma! in! questo! caso! bisogna! ottenere! esatta!

corrispondenza!con!lo!standard!a!tutte!le!concentrazioni!considerate!(bisogna!ottenere!ALONI!uguali)

Il!prodotto!non!esce!dall’industria!senza!la!VERIFICA.

SCADENZA*DI*UN*ANTIBIOTICO*

Sulle!scatole!contenenti!antibiotico!c’è!una!scadenza!variabile!legata!alla!stabilità!dei!vari!antibiotici!

(2Q3Q5!anni!ad!es.)!Quanto!tempo!dura!un!antibiotico?!In!laboratorio!ad!intervalli!regolari!(6Q12!mesi,!

2! –! 3! –! 4! anni)! si! fanno! le! stesse! prove! di! titolazione.! Quando! l’attività! scende! al! di! sotto! del! 5%,!

l’antibiotico!non!esplica!più!la!sua!attività.!

TITOLAZIONI*SOSTANZE*A*BASSA*CONCENTRAZIONE*

Saggio! che! si! effettua! quando! certe! sostanze! non! possono! essere! titolate! con! i! metodi! precedenti!

perché!a!concentrazioni!troppo!basse.!Ad!es.!aminoacidi!e!vitamine.!

.!Come!quantificare!la!VitB12 (cobalamina)!contenuta!nell’olio!di!fegato!di!

SAGGIO+DELLA+VITAMINA+B12 !

merluzzo.!Si!parte!dall’organo!con!pesi!e!volumi!diversi!a!seconda!del!merluzzo!(merluzzo!piccolo!=!

fegato! piccolo;! merluzzo! grande! =! fegato! grande)! e! parallelamente! si! fanno! delle! diluizioni! dalla!

soluzione!madre!nota!di!VitB12!

Per! confrontare! il! prodotto! da! saggiare! (estratto! di! fegato! di! merluzzo)! con! uno! standard! noto! di!

VitB12!(che!si!prepara!chimicamente!mediante!cromatografia).!!

! 62!

Dallo!standard!si!ottengono!almeno!due!diluizioni!a!concentrazione!nota:!0.1!µg/ml!e!0.01!µg/ml.!

Per!legge!devo!avere!nell’olio!di!fegato!di!merluzzo!3Q5!µg!di!VitB12/grammo!di!estratto!di!fegato.!

Se!nell’estratto!c’è!una!quantità!inferiore!=!Frode,!una!quantità!superiore!=!Pericoloso.!

Immagino! che! nel! mio! estratto! ci! siano! 3Q5! di! VitB12! e! faccio! diluizioni! ipotetiche! fino! a!

µg!

raggiungere!0.1!µg!e!0.01!µg/ml.!

Il!saggio!è!come!un!antibiogramma!ma!qui!si!leggono!gli!aloni!di!crescita.!

Allestimento+della+prova:+

1. Si!prepara!il!terreno!agar!(1%di!una!soluzione!dicloruro!di!trifenitetrazolio!al!2%p/v!in!acqua!(colorante!

che!colora!in!viola!i!batteri!cresciuti)!e!la!sospensione!batterica!(0.25!ml!ogni!10!ml!di!terreno)!

2. Il!ceppo!test!è!auxotrofo!per!la!VitB12,!non!cresce!senza!di!essa.!In!Italia!si!usa!Escherichia!coli!113/3,!che!

va!mantenuto!su!terreni!particolari!indicati!da!F.U!in!modo!che!rimanga!auxotrofo.!

3. Si!versa!il!terreno!seminato!in!piastra!Petri!in!uno!strato!di!2.5Q3!mm!di!spessore.!

4. Dopo! solidificazione! le! soluzioni! dello! standard! e! del! campione! si! dispongono! sulla! superficie! dell’agar!

(cilindretti!di!porcellana!o!dischetti!di!carta!da!filtro!sterilizzati)!oppure!praticare!pozzetti!sullo!spessore!

dell’agar!in!cui!deporre!le!soluzioni.!

5. 8!repliche!per!lo!standard!e!8!per!ciascun!campione!da!titolare.!

6. Metodo!dei!4!punti!in!cui!si!valuta!l’alone!di!crescita!stimolato!da!2!concentrazioni!o!punti!dello!standard!

=! S1! (0.1! g! di! cianocobalamina)! e! S2! (0.01! di! cianocobalamina)! e! 2! concentrazioni! o! punti! del!

µ µg!

campione!=!C1!(0.1!µg!di!estratto!di!fegato)!e!S2!(0.01!µg!di!estratto!di!fegato).!

Ogni!punto!dovrà!essere!rappresentato!da!4+ repliche.!I!punti!S1QS2!C1QC2!dovranno!essere!disposti!

sulla!piastra!a!quadrato!e!in!modo!alternato!(S1QC1QS2QC2).!La!piastra!così!allestita!è!incubata!per!18Q

24!h!a!37°C.!!

Lettura+ dei+ risultati:! misurare! i! diametri! degli! aloni! di! crescita! confrontandoli! con! lo! standard! a!

concentrazione!nota.!

Es.! S1! =! 15! mm! mentre! il! suo! corrispondente! C1! =! 21! mm:! significa! che! il! campione! contiene! più!

VitB12! (15:! 0.1! g/ml! =! 21:! X;! X! =! (21! x! 0.1/15)! =! 0.14! quindi! bisogna! fare! le! dovute!

µ µg/ml!

proporzioni!per!ottenere!le!giuste!quantità).!

!

!

!

!

++

+

+

+

+

+

+

+

+

! 63!

#1#APPROFONDIMENTO#ESOTOSSINE#ED#ENDOTOSSINE!

PROCESSO' PATOGENETICO:" esposizione," invasione," adesione" e" colonizzazione," moltiplicazione," infezione" e"

malattia."

Adesione:" può" essere" transiente" o" permanente" è" permessa" da" strutture" di" adesioni" quali" flagelli,"

fimbrie,"

biofilm"e"sostanze"quali"adesine."

Colonizzazione:"risultante"dei"meccanismi"di"virulenza"che"hanno"permesso"al"batterio"di"aderire"e"resistere"

all’immunità"innata"e"adattiva."

Patogenicità:" capacità" di" dare" malattia" in" condizioni" normali." Il" MCO" è" patogeno" se" è" capace" di" invadere" e"

causare"danni"all’ospite."Dipende"da"fattori"di"virulenza ,"carica"virulenta"e"stato"di"salute"dell’uomo."

*

Virulenza:" esprime" la" patogenicità" del" microrganismo" e" dipende" dall’infettività:" essere" in" grado" di" resistere"

alle"normali"difese"dell’ospite"e"gravità:"danni"causati"all’ospite."

Infezione:"superamento"delle"barriere"anatomiche"dell’uomo"

Malattia:"raggiungimento"del"MCO"ai"tessuti"e"organi"bersaglio"

Classificazione'dei'patogeni'in:"veri"e"opportunisti"