Microbiologia - approfondimenti

15.$ SAGGI%DI%SICUREZZA%MICROBIOLOGICA!

I! prodotti! farmaceutici,! prima! di! entrare! in! commercio,! devono! rispondere! a! precisi! limiti! di!

contaminazione! microbica.! Tale! valutazione! viene! effettuata! sui! singoli! lotti! produttivi! I! saggi!

effettuati!servono!per:!!

Controllare!la!sterilità!del!campione!! Controllare!l’assenza!di!tossicità!!

• •

Controllare!l’assenza!di!attività!pirogena! Verificare!che!il!farmaco!sia!iniettabile.!

• •

CONTROLLO*DI*STERILITÀ*

!È! effettuato! principalmente! per! tutti! quei! prodotti! che! devono! essere! sterili:! farmaci! iniettabili! e!

destinati! ad! uso! ospedaliero.! L’analisi! è! eseguita! nei! laboratori! in! condizioni! di! asepsi,! evitando!

qualunque!contaminazione.!Durante!le!varie!procedure!il!prodotto!non!deve!subire!l’azione!di!agenti!

sterilizzanti!causa!l’invalidità!del!test.!Il!numero!di!campioni!da!prelevare!varia!a!seconda!del!numero!

di! lotti! e! a! seconda! della! quantità! di! sostanza! contenuta! all’interno! dei! flaconi.! Si! definisce! lotto! un!

insieme!omogeneo!di!recipienti!che!hanno!subito!una!stessa!preparazione.!Il!prelievo!per!il!controllo!

della!sterilità!viene!effettuato!a!caso:!

! !

LOTTI* NUMERO*CAMPIONI*

*<100* Min.4!–!10%!del!lotto! QUANTITA’*CAMPIONE* PRELIEVO*

100<x<500* 10!lotti! 1*mL* Tutto!il!Campione!

>500* 2%!0!Max.!20!lotti! 20*mL* 10%!del!contenuto!

L’analisi!si!divide!in!due!tipologie:!metodo+liquido!e!metodo+solido.!In!entrambi!i!casi,!come!in!tutti!i!

saggi!biologici,!le!prove!sono!effettuate!in!doppio.!

METODO*LIQUIDO*

Come!terreno!di!analisi!per!la!ricerca!di!funghi!e!batteri!viene!utilizzato!un!terreno!liquido!(brodo).!A!

seconda!della!tipologia!di!batterio!ricercato,!dividiamo!i!terreni!in:!

! ! MCO* TERRENO* MCO*RIFERIMENTO**

AEROBI* Nutrient!broth! Stafilococco!aureus!

! ANAEROBI* Tioglicolato!di!sodio! Clostridium!sphenoides!

! FUNGHI* Sobouiaud! Candida!albicans!

!

*:!Serve!come!prova!in!bianco!per!vedere!se!il!terreno!è!buono.!Sapendo!che!quei!m.o.!crescono!su!quel!terreno,!la!mancata!

crescita!starebbe!ad!indicare!che!il!terreno!non!è!preparato!in!maniera!adeguata.!

! \* PROCESSO* ACCORGIMENTI*

Il!numero!delle!provette!varia!a!seconda!dei!campioni.!Per!un!singolo!

PREPARAZIONE*PROVETTE:*Addizionare!5!mL!di! •

1* terreno.!10!mL!batteri!anaerobi! campione!sono!allestite!6!provette !

:!1+1:!aerobi,!1+1:anaerobi!e!1+1:!funghi

PREPARAZIONE*PROVETTE*PROVA:*Addizionare!5!

2* Allestite!3!provette!contenenti!i!terreni!+!MCO!riferimento!

•

mL!di!terreno.!10!mL!batteri!anaerobi! Le!polveri!sono!disciolte!prima!dell’introduzione!

• I!liquidi!sono!immessi!nel!terreno!direttamente!

INTRODUZIONE*CEPPO:!La!quantità!di!campione! •

3* varia!a!seconda!del!campione!in!esame! I!liquidi!oleosi!sono!disciolti!con!solventi!appropriati!

• Se!contengono!conservanti!o!antibiotici,!bisogna!bloccarne!l’attività!

•

PROVA*DI*FERTILITA’:!il!ceppo!di!riferimento!è!

4* Se!il!terreno!è!buono!si!procede!con!l’incubazione.!

•

cresciuto!nel!terreno.! Provetta!con!solo!terreno!per!verificare!la!sterilità!del!terreno;!se!limpida!il!

•

5* PROVA*DI*STERILITA’*DEL*TERRENO! campione!non!presenta!tracce!di!MCO!

48!h.!a!30037°C!per!i!batteri!

•

6* INCUBAZIONE:*Le!provette!sono!messe!ad! 1!settimana!a!25030°C!per!i!funghi!

•

!

incubare.

! 59!

+

LETTURE+SAGGIO: RICERCA+MCO+

IPOTESI+1:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* ! ! ! !

2* ! ! ! ! !

L’analisi+evidenzia+l’assenza+di+m.o.+all’interno+del+farmaco+saggiato.+L’analisi+è+da+considerarsi+NON+valida+poiché+anche+il+test+

terreno+++MCO+riferimento+ha+dato+esito+negativo.+Ciò+significa+che+il+terreno+è+stato+preparato+in+maniera+errata.+Ripetere+la+

procedura+di+analisi.+

IPOTESI+2:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* ! ! ! !

2* ! ! ! ! !

L’analisi+evidenzia+la+presenza+di+probabili+m.o.+aerobi+e+di+funghi.+Visto+l’esito+positivo+di+una+sola+delle+due+prove,+l’intero+test+

viene+ripetuto,+per+verificarne+la+validità.+Una+successiva+analisi+potrebbe+confermare+la+presenza+dei+m.o.,+o+portare+alla+luce+

un’eventuale+contaminazione+avvenuta+nella+prima+prova.+

IPOTESI+3:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* ! ! ! !

2* ! ! ! ! !

L’analisi+evidenzia+la+presenza+di+m.o.+anaerobi.+L’analisi+è+da+considerarsi+valida,+poiché+entrambe+le+prove+hanno+dato+esito+

positivo+e+il+test+ha+confermato+la+validità+del+terreno.+

IPOTESI+4:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* ! ! !

!

2* ! ! ! !

!

L’analisi+ evidenzia+ la+ presenza+ di+ tutti+ i+ m.o.+ all’interno+ del+ farmaco+ saggiato.+ L’analisi+ è+ da+ considerarsi+ NON+ valida+ poiché+

anche+ il+ test+ terreno+ ha+ dato+ esito+ positivo.+ Ciò+ significa+ che+ il+ terreno+ è+ stato+ preparato+ in+ maniera+ errata.+ Ripetere+ la+

procedura+di+analisi.+

+

*l’esito+riportato+riassume+in+generale+l’andamento+di+tutti+e+tre+i+terreni+++MCO+riferimento+

METODO*SOLIDO*

Procedimento!introduttivo!analogo!a!quello!liquido.!I!terreni!utilizzati!sono!agarizzati.!!

\* PROCESSO* ACCORGIMENTI*

Il!passaggio!del!liquido!attraverso!il!filtro,!permette!a!quest’ultimo!di!

FILTRAZIONE*CAMPIONE:*Il!campione!liquido! •

1* viene!filtrato!tramite!filtro!a!caffettiera! trattenere!sulla!sua!superficie!gli!eventuali!m.o.!presenti!

PREPARAZIONE*INOCULO:*il!filtro!è!tagliato!in!3!

2* Ogni!singolo!pezzo!è!appoggiato!con!pinze!sterili!sul!terreno!

•

parti!

! 60!

48!h.!a!30037°C!per!i!batteri!

•

3* INCUBAZIONE:*Le!provette!sono!messe!ad! 1!settimana!a!25030°C!per!i!funghi!

•

!

incubare.

+

LETTURE+SAGGIO:+

IPOTESI+1:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* ! ! ! !

2* ! ! ! ! !

L’analisi+ evidenzia+ l’assenza+ di+ m.o.+ all’interno+ del+ farmaco+ saggiato.+ L’analisi+ è+ da+ considerarsi+ valida+ poiché+ anche+ il+ test+

terreno+++MCO+riferimento+ha+dato+esito+positivo.+Ciò+significa+che+il+terreno+è+stato+preparato+in+maniera+corretta.++

IPOTESI+2:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* !

! ! !

2* ! ! ! ! !

L’analisi+evidenzia+la+presenza+di+probabili+m.o.+aerobi+(crescita+sul+bordo)+e+di+funghi+(crescita+di+una+sola+prova).+Visto+l’esito+

positivo+ di+ una+ sola+ delle+ due+ prove,+ l’intero+ test+ viene+ ripetuto,+ per+ verificarne+ la+ validità.+ Una+ successiva+ analisi+ potrebbe+

confermare+la+presenza+dei+m.o.,+o+portare+alla+luce+un’eventuale+contaminazione+avvenuta+nella+prima+prova.+

IPOTESI+3:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* ! ! ! !

2* ! ! ! ! !

L’analisi+evidenzia+la+presenza+di+m.o.+anaerobi.+L’analisi+è+da+considerarsi+valida,+poiché+entrambe+le+prove+hanno+dato+esito+

positivo+e+il+test+ha+confermato+la+validità+del+terreno.+

IPOTESI+4:+ TERRENO*+*MCO*

PROVE* TERRENO* MCO*AEROBIO* MCO*ANAEROBIO* MCO*FUNGO*

RIFERIMENTO**

1* ! ! !

!

2* ! !

! !

!

L’ultima+ipotesi+mette+in+luce+i+vari+casi+che+si+possono+verificare:+il+test+MCO+aerobio+ha+dato+esito+positivo,+ma+la+crescita+di+

batteri+al+di+fuori+del+disco+fa+pensare+ad+una+contaminazione+del+terreno+(il+test+va+ripetuto).+Il+test+MCO+anaerobio+presenta+

una+prova+nulla+ed+una+con+crescita+lungo+i+bordi+del+filtro+(il+test+va+ripetuto).+IL+test+MCO+fungo+presenta+un+test+nullo+ed+uno+

positivo+(il+test+va+ripetuto).+In+un+caso+poco+realistico+come+il+seguente,+l’utente+deve+provvedere+a+rifare+nuovamente+tutti+i+

test.+N.B.+La+contaminazione+del+terreno+comporta+un+esito+falso/positivo+(il+test+va+comunque+ripetuto).+

ASSENZA*DI*TOSSICITA’*

Valuta!la!presenza!di!sostanze!tossiche!all’interno!del!lotto.!Si!inietta!la!soluzione!in!esame,!sciolta!in!

soluzione!salina,!in!un!numero!dispari!di!topolini.!Il!tempo!dell’inoculo!deve!essere!lento!15Q30”.!La!

tossicità!del!farmaco!è!stabilita!se!almeno!uno!dei!topolini!muore!dopo!24!ore.!

SAGGIO*DI*INNIETTABILITA’*

Attualmente!poco!utilizzato,!serve!per!vedere!se!il!farmaco!è!iniettabile.!!

! 61!

Il!prodotto!viene!somministrato!ad!un!porcellino!d’India!sulla!schiena.!Se!l’animale!presenta!rossore!

nella! zona! di! inoculo,! danno! locale! o! cambiamento! di! comportamento! allora! il! farmaco! non! è!

iniettabile.!!

ASSENZA*DI*ATTIVITA’*PIROGENA*

Il! seguente! test! permette! di! verificare! l’attività! pirogena! del! farmaco.! Una! sostanza! ha! attività!

pirogena! quando! una! volta! iniettata! all’interno! del! corpo! provoca! una! aumento! della! temperatura!

corporea.! Le! sostanze! con! queste! determinate! caratteristiche! sono! quelle! legate! ai! lipopolisaccaride!

dei!Gram!Q!.!Con!questa!prova!!si!mette!in!evidenza!la!presenza!di!batteri!Gram!–!(endotossina!–!Lipide!

A).!Il!saggio!era!fatto!sui!conigli;!se!si!verificava!un!aumento!di!temperatura!la!presenza!dei!LPS!era!

confermata.!

Oggi!giorno!tale!procedura!non!è!più!utilizzata!ma!viene!utilizzato!il!LAL!Test! !

(vedi!pag.!26!–!effetto!pirogeno)

TITOLAZIONE*MICROBIOLOGICA*DI*UN*ANTIBIOTICO*

L’industria!farmaceutica!che!deve!preparare!confezioni!di!antibiotico!da!vendere,!una!volta!comprate!

la!materia!prima!in!bidoni,!deve!definirne!la!potenza!(attività).!

Nei!flaconi!o!capsule!non!deve!esserci!una!quantità!di!farmaco!superiore!o!inferiore!al!5%!di!quanto!

dichiarato!(se!la!quantità!è!superiore,!il!rischio!è!che!la!terapia!risulti!sbagliata,!se!è!inferiore!si!tratta!

di!frode).!

Metodo+per+valutare+la+potenza+o+attività+

Protocollo:! si! confronta! la! polvere! con! uno! standard! (esistono! delle! polveri! internazionali! standard!

dello!stesso!farmaco!con!potenza!pari!al!100%!del!peso).!

Effettuare! 3! diluizioni! ipotetiche! del! prodotto! da! saggiare! come! se! valesse! 100%! e! 3! diluizioni! note!

dello!standard.!

Eseguire!un!antibiogramma:!misurare!gli!aloni!d’inibizione!dello!standard!e!del!prodotto!da!saggiare.!

!

!!!!ESEMPIO:!standard!12!mm!polvere!ignota!10!mm!

Fare!la!proporzione!12:100%!=!10:X!X=!83%!!

!!!!La!polvere!ignota!ha!una!potenza!dell’83%!(significa!che!in!100!mg!di!polvere!solo!83!mg!sono!di!!!

!!!!principio!attivo)!

!!!Se!nei!flaconi!o!nelle!capsule!devo!mettere!400!mg!di!principio!attivo!(dose)!farò!un’altra!!!!

!!!proporzione:!! 400mg:83%!=!X:100%!x=482mg!!

!!!Devo!pesare!e!mettere!più!antibiotico!nel!flacone!o!capsula!per!compensare!la!potenza!più!bassa.!

!

Prima!di!commercializzare!il!prodotto!bisogna!verificare nuovamente la potenza.

Ripetere! l’antibiogramma! come! in! precedenza,! ma! in! questo! caso! bisogna! ottenere! esatta!

corrispondenza!con!lo!standard!a!tutte!le!concentrazioni!conside