Appunti di Microbiologia

Microbiologia

Introduzione

La microbiologia è quella branca della biologia deputata allo studio dei microrganismi. I microrganismi sono organismi unicellulari; in particolare durante il corso ci occuperemo di batteri, protozoi (alghe) e miceti (funghi e muffe). La microbiologia, dalla recente scoperta dei virus, si occupa anche dello studio di questi ultimi, nonostante essi siano parassiti endocellulari e non propriamente cellule: sono molecole non dotate di vita, incapaci di riprodursi se non dopo aver infettato un’altra cellula.

Lo studio del funzionamento e dei meccanismi di riproduzione del mondo microbico è utile sotto diversi punti di vista, settori di interesse della microbiologia sono:

• Agricoltura, generazione dello ione ammonio importante per le piante, nel rumine delle mucche
• Energia e ambiente, biorisanamento, biocombustibili
• Alimentazione, tutti i cibi fermentati e lievitati, conservazione del cibo, additivi alimentari
• Biotecnologie, manipolazione genetica per creare organismi geneticamente modificati es. insulina e vaccini
• Malattie, comprensione del processo infettivo, identificazione di nuove malattie, trattamento cura e prevenzione, problema in paesi in via di sviluppo
• Bioterrorismo, spore di antrace contenute nelle lettere nel 2000

La cellula è un organismo vivente, il più semplice in assoluto, che trae nutrimento dall’ambiente in cui si trova, ambiente in cui rilascia sostanze di scarto. Se l’ambiente è favorevole si può replicare e, nel corso del tempo, può andare incontro a meccanismi evolutivi in grado di avvantaggiarla nella sopravvivenza. Alcune cellule hanno la capacità di spostarsi, di dare origine a diverse strutture cellulari (ad es. spore) e di comunicare tra di loro in modo da adeguarsi agli stimoli e alle variazioni dell’ambiente esterno.

Le comunità microbiche, insieme di microrganismi, sono ovunque e interagiscono con tutti gli ecosistemi. L’87% dei microrganismi conosciuti è benefico o almeno innocuo per l’uomo. I microrganismi opportunisti (10% del totale) normalmente non danno particolari problemi all’individuo sano, risiedono in stato di latenza; certi disturbi possono però portare i microrganismi opportunisti a recare danno all’uomo. Solo il 3% (molte varietà) dei microrganismi conosciuti sono patogeni: contraendo codesti microrganismi si manifesterà la patologia.

Storia della microbiologia

Negli ultimi cento anni i progressi nel campo della microbiologia sono stati enormi ma la sua nascita può essere fatta risalire alla fine del 1600 con l’invenzione del primo microscopio (Hoocke 1664). Verso la fine del secolo Antonie van Leeuwenhoek osserva così i primi animacula. È alla fine dell’ottocento però che si inizia a comprendere come i microrganismi funzionano e, di conseguenza, come possono essere combattuti.

Edward Jenner nota, durante un’epidemia di vaiolo, che le mungitrici che avevano contratto il vaiolo bovino non erano soggette a vaiolo umano: iniettò del vaiolo bovino in un bambino di otto anni e osservò che non contraeva vaiolo umano. Fu però Pasteur a comprendere appieno il principio alla base dell’evento osservato da Jenner; Pasteur inventò il vaccino dell’antrace, del colera e della rabbia rendendo inattivi i bacilli dei vaccini e iniettandoli negli esseri umani.

Il "golden age" della microbiologia 1850-1900

• 1857 microbiologia della fermentazione lattica
• 1860 lieviti nella fermentazione alcolica
• 1864 teoria della generazione spontanea e pastorizzazione (riscaldare il liquido in modo da uccidere i microrganismi e fermare la fermentazione)
• 1877 sterilizzazione sotto pressione

Robert Koch fu lo scienziato che scoprì che ad un determinato batterio è riconducibile una particolare patologia; coltivò e osservò campioni di materiale prelevato da soggetti malati e da soggetti sani e si rese conto che l’agente patogeno era presente solo nel campione dei soggetti malati. Inoculando le colonie batteriche coltivate in laboratorio nel corpo di un animale sano fu quindi possibile osservare lo sviluppo della patologia anche nel soggetto sano.

I postulati di Koch

1. Il presunto agente responsabile della malattia in esame deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia e deve essere assente nei sani
2. Deve essere possibile isolare il microrganismo dall'ospite malato e farlo crescere in coltura pura
3. Ogni volta che una coltura pura del microrganismo viene inoculata in un ospite sano, si riproduce la malattia
4. Il microrganismo deve poter essere isolato nuovamente dall'ospite infettato sperimentalmente

Koch e il concetto di coltura pura portano alla scoperta dell’agente eziologico della tubercolosi (1892), premiato col Nobel nel 1905.

Classificazione degli organismi viventi

Gli organismi viventi sono divisibili in cinque gruppi: batteri, protisti, animali, funghi e piante. Recentemente una nuova tassonomia basata sull’analisi delle sequenze di RNA divide gli organismi viventi in tre gruppi fondamentali: batteri, archaea e eukarya. I microrganismi sono sia eucarioti che procarioti. I microrganismi eucarioti sono le alghe, i protozoi e i miceti. I microrganismi procarioti sono i batteri.

Caratteristiche delle cellule procariote

Vi sono numerose differenze tra cellula eucariota e cellula procariota:

• La cellula procariota non ha né nucleo né membrana nucleare
• La cellula procariota non ha gli organelli caratteristici della cellula eucariota (ribosomi, mitocondri, reticolo endoplasmatico, apparato di Golgi)
• Nella cellula procariota il DNA si trova libero nel citoplasma, in una struttura detta nucleoide, ed è molto più piccolo rispetto a quello della cellula eucariota
• I ribosomi della cellula procariota sono diversi rispetto a quelli della cellula eucariota, sia come dimensioni (tra 10^-6 e 10^-8) che come indice di sedimentazione
• La membrana cellulare della cellula procariota, pur essendo simile, non presenta steroli

Morfologia batterica

I batteri (cellule procariote) sono diversi tra loro. In base alla morfologia possono essere suddivisi in cocchi (circolari), bacilli o bastoncelli (forma allungata), coccobacilli (circolari ma più allungati), vibrioni (ricurvi), spirilli (ondulati), spirochete (elicoidali). In alcuni casi i batteri possono essere rinvenibili in singole unità (raramente), uniti in coppie (diplococchi) o aggregati in lunghe catene (streptococchi) nel caso in cui la divisione tra i vari batteri non sia stata completa. Se invece la ripartizione avviene su assi diversi i batteri possono formare tetradi dalle cui divisioni si formeranno grappoli come quelli distintivi delle colonie di stafilococchi. Anche i bacilli sono rinvenibili singolarmente o sotto forma di diplobacilli o di catenelle di bacilli.

I batteri possono anche essere divisi in base all’aspetto assunto dalle loro colonie una volta coltivati sulle lastre di Petri: puntiformi, circolari, filamentose o di diversi colori.

Strutture batteriche

Le strutture batteriche si dividono in essenziali, presenti in tutti i batteri, e in accessorie, presenti solo in alcuni batteri. Sono strutture batteriche essenziali il citoplasma, il nucleoide, i ribosomi, la membrana citoplasmatica, il lisosoma e la parete. Sono accessorie capsula, pile, appendici filiformi (fimbrie, cilia o flagelli) e plasmidi.

Citoplasma

Citoplasma: costituito prevalentemente da acqua, contiene proteine e sostanze nutrienti utili alla sopravvivenza della cellula e molecole necessarie, sede di processi biosintetici.

Nucleoide

Nucleoide: è il materiale genetico batterico in cui è addensato il materiale cromosomale, costituito da un’unica molecola di DNA, circolare e a doppia elica; si trova disperso nel citoplasma (non è contenuto in un nucleo e quindi non sono rinvenibili né nucleoli né membrana nucleare).

Plasmidi

Plasmidi: sono strutture accessorie; sono frammenti di materiale genetico extracromosomiale: non è il vero DNA batterico, ma è un DNA circolare di ridotte dimensioni che codifica pochissimi geni (da 50 a 100) e può essere trasmesso da un batterio all’altro. Conferiscono caratteristiche aggiuntive ai batteri. I plasmidi sono un elemento caratteristico dei batteri essendo il mezzo attraverso il quale i batteri si scambiano i geni che ne aumentano la sopravvivenza (es. fattori di resistenza agli antibiotici). Si replicano autonomamente e possono essere trasmessi da un batterio ad un altro.

Ribosomi

Ribosomi: servono per la sintesi delle proteine, ovvero della traduzione dell’RNA messaggero. Sono diversi da quelli presenti nelle cellule eucariote e sono detti 70S (sedimentano ad una velocità di 70 Svedberg); sono composti da due subunità, una 30S e una 50S, che si complessano nel momento in cui deve avvenire la traduzione dell’RNA. È bene ricordare che i ribosomi batterici differiscono da quelli delle cellule eucariotiche perché ciò permette di usarli come target di alcuni farmaci, che sono in grado di inibirli (inibendo così la replicazione batterica) senza inibire la funzionalità della cellula eucariotica.

Membrana citoplasmatica

Membrana citoplasmatica: simile a quella eucariotica, è formata da un doppio strato di fosfolipidi con le teste idrofile rivolte verso l’esterno e le code idrofobiche rivolte verso l’interno. La grossa differenza tra la membrana citoplasmatica batterica e quella eucariota è l’assenza di steroli, in quanto i batteri non sono in grado di sintetizzarli. Presenta proteine periferiche, proteine integrali di membrana e glicoproteine; le proteine transmembrana permettono il trasporto di ioni e nutrienti come nelle cellule eucariote: si può avere un trasporto semplice caratterizzato dal solo passaggio di ioni, oppure attraverso una modificazione della sostanza trasportata oppure ancora un trasporto permesso dal dispendio di ATP. Il trasporto può essere sia unidirezionale che bidirezionale. La membrana citoplasmatica è cruciale per la conservazione dell’energia (forza proton-motrice); permette infatti la conservazione della differenza di potenziale, all’origine della forza motrice, sito di ancoraggio, barriera di permeabilità. Una caratteristica propria della membrana citoplasmatica della cellula procariote è la presenza di mesosomi, invaginazioni che “mimano” la funzione respiratoria che nelle cellule eucariote avviene nei mitocondri.

Parete cellulare

Parete cellulare: è una delle strutture più caratteristiche della cellula batterica (no nelle cellule eucariote umane), a cui conferisce forma e rigidità; impedisce la lisi osmotica. È costituita da una molecola, il peptidoglicano, composta da zuccheri (N-acetilglucosamina e acido N-acetilmuramico) e peptidi. La parete cellulare dei batteri permette di classificarli in due gruppi: Gram+ e Gram negativi (il nome dipende dalla colorazione). I primi presentano una struttura molto compatta, mentre i secondi sono caratterizzati da lacune nella parete e un sottile strato di peptidoglicano. Gli zuccheri si legano formando lunghe strutture lineari che a loro volta sono legate tra loro, formando una fitta rete, da legami peptidici, ossia da proteine. Il peptidoglicano è uno zucchero formato da un legame peptidico che unisce N-acetilglucosamina e di acido N-acetilmuramico, detto legame di transpeptidazione e avviene a carico dell’enzima transpeptidasi. Le penicilline (gli antibiotici) agiscono sul legame di transpeptidazione (parete batterica), lisandolo, allo scopo di demolire i batteri e renderne impossibile la replicazione. La parete batterica si trova esternamente rispetto alla membrana citoplasmatica.

Batteri Gram+ e Gram-

La parete dei Gram+ è costituita da molti strati di peptidoglicano; è quindi una parete spessa e compatta su cui si trovano proteine, che possono essere semplicemente associate alla superficie esterna (acidi teicoici) oppure attraversarla da parte a parte (acidi lipoteicoici). Gli acidi teicoici hanno la funzione di attrarre cationi e possono fungere da antigeni di superficie; gli acidi lipoteicoici, invece, ancorano la parete cellulare alla membrana citoplasmatica.

I batteri Gram- presentano una struttura completamente differente; nonostante vi sia comunque uno strato di peptidoglicano, questo è molto più sottile rispetto a quello dei Gram+ ed è separato dall’ambiente esterno da una struttura (comunque facente parte della parete cellulare) detta membrana esterna (fosfolipidi e dal lipopolisaccaride). Nel caso dei Gram- la parete non è ancorata alla membrana citoplasmatica da proteine; vi sono infatti degli spazi tra la membrana citoplasmatica e lo strato di peptidoglicano e tra quest’ultimo e la membrana esterna. Tali spazi rispondono al nome di periplasma. La membrana esterna è costituita da un doppio foglietto che presenta uno strato di fosfolipidi rivolto verso l’interno e uno di lipopolisaccaridi (struttura caratteristica ed esclusiva dei Gram-) rivolto verso l’esterno. La membrana esterna presenta anche proteine che permettono il passaggio di nutrienti tra la cellula e l’esterno.

I tre componenti del lipopolisaccaride

1. Lipide A: forma lo strato del foglietto fosfolipidico della membrana esterna; è la parte tossica del lipopolisaccaride, quella che conferisce al polisaccaride la funzione di endotossina: nell’organismo umano dà sintomi generalizzati di malessere quali febbre e brividi.
2. Core polisaccaridico: catena di zuccheri uguale in tutti i batteri
3. POLISACCARIDE O: verso l’esterno, diversa in base alle diverse specie del batterio.

Colorazione di Gram

I batteri Gram+ e Gram- (tra cui va annoverata l’Escherichia Coli) sono riconoscibili attraverso la colorazione di Gram; è una colorazione differenziale in quanto differenzia due famiglie di batteri diversi usando coloranti diversi. Sia i Gram+ (alcool resistenti) che i Gram- sono sensibili al colorante cristal violetto che viene fissato usando una soluzione detta mordente; la soluzione di decolorazione (solitamente un alcool) usata successivamente farà perdere colore ai Gram- e lascerà intatta la colorazione dei Gram+ perché lo spessissimo strato di peptidoglicano impedisce l’ingresso dell’etanolo nel batterio. I Gram- vengono poi colorati di rosa utilizzando il colorante safranina.

Oltre ai Gram+ e ai Gram- esistono batteri che non presentano la parete cellulare. Sono conosciuti come micobatteri, sono una piccola parte dell’insieme dei batteri e rappresentano, ad esempio, l’agente eziologico della tubercolosi. Hanno uno spesso involucro esterno composto non da peptidoglicano ma soprattutto da cere, acidi micolici, glicolipidi e glicoproteine. Essendo la membrana molto spessa, il passaggio dei nutrienti avviene in maniera difficoltosa, rendendo lo sviluppo di questi batteri particolarmente lento. Non potendo essere clusterizzati (colorati) sfruttando il peptidoglicano, assente in questo caso, i micobatteri vengono sottoposti ad una diversa colorazione, detta di Ziehl Neelsen. La caratteristica sfruttata è l’acidoresistenza dell’involucro esterno dei micobatteri. Sono batteri difficilmente colorabili e vanno trattati a caldo, per sciogliere le cere, prima di essere colorati. Vengono poi colorati di rosa usando la fucsina e in seguito il colore viene disciolto con acido solforico; gli unici batteri a rimanere colorati saranno i micobatteri per via della resistenza all’acido.

La locomozione

Flagelli

Flagelli: strutture accessorie deputate alla locomozione; sono filamenti che si distaccano dalla parete batterica e sono anche sensori dell’ambiente esterno: grazie ai flagelli i batteri rilevano il posizionamento delle sostanze nutritive. I flagelli variano a seconda della specie batterica. Batteri con un solo flagello sono detti monotrichi, batteri con un flagello per estremità sono detti anfitrichi, batteri con un gruppo di flagelli localizzati in un punto sono detti lofotrichi, batteri con flagelli presenti su tutta la superficie sono detti peritrichi. La struttura basale del flagello è inserita all’interno della parete batterica e della membrana citoplasmatica; i flagelli sono formati da una struttura ad uncino e da un lungo filamento, detto appunto flagello. Il flagello è composto da molte molecole di una proteina la flagellina. A seconda della disposizione dei flagelli il movimento dei batteri varia: i peritrichi orientano i flagelli nella direzione opposta al posizionamento dei nutrienti e si muovono in linea retta e più lentamente rispetto agli altri, i batteri polari (con i flagelli localizzati in alcuni punti) invece si muovono più velocemente e a scatti. Se non sono attratti da nessuna sostanza i batteri si muovono in maniera casuale; orientano il proprio movimento solo quando avvertono la presenza di nutrienti.

Pili e fimbrie

Pili e fimbrie: sono strutture accessorie più piccole dei flagelli e non danno motilità al batterio. Servono al batterio per aderire nelle zone di interesse delle cellule che vogliono infettare. Particolare è il pilo F (sessuale) che è in grado di aderire a un altro batterio creando un tubo attraverso il quale il materiale genetico può passare da batterio all’altro.

Capsula

Capsula: struttura accessoria caratteristica dei batteri; è gelatinosa e si trova all’esterno della parete batterica. Si parla di capsula solo qualora sia ben strutturata e spessa; nel caso sia costituita da uno strato sottile viene indicata semplicemente come strato mucoso. È una struttura importante per i batteri in quanto rappresenta un importante fattore di virulenza e di resistenza al sistema immunitario. Impedisce infatti ai macrofagi di fagocitare i batteri capsulati che, inoltre, sono anche resistenti alla maggior parte dei farmaci, impedisce la disidratazione. Gli streptococchi sono batteri presenti nella cavità orale; grazie alla capsula possono aderire e colonizzare lo smalto dentale formando un microfilm che sarebbe difficilmente sradicabile. Quando i batteri capsulati si uniscono in colonie formano il biofilm unendo le proprie capsule in modo da aumentare la resistenza al sistema immunitario. L’unico farmaco in grado di ledere il biofilm di batteri capsulati è il furanone. I biofilm suscitano un problema sanitario quando si parla di catetere perché la permanenza del catetere può far sì che.