Appunti di Microbiologia

S R R

Str Str Con Str

streptomicina

+ - - +

Thr Thr Thr Thr

+ - - +

Leu Leu Leu Leu

Gli F’

Quando un plasmide Hfr si escinde dal cromosoma può portarsi dietro dei

frammenti cromosomici, anche un intero operone. Il plasmide che si forma è

detto plasmide F’, e quando viene trasferito viene trasferito anche l’operone

incorporato.

Essendo che il gene è integrato in F’ e che F’ è un plasmide intero, in

 grado di replicare, il gene è stabile nel ricevente e si può avere una

situazione di parziale diploidia o merodiploidia.

Questo è utile per fare i test di complementazione. Essi inizialmente sono

stati usati sui diploidi, ma possono essere usati anche sui diploidi parziali.

-

Se il procariote ha un fenotipo Trp ed io gli metto un plasmide che ha il gene

che nel procariote è mutato, il plasmide complementa la mancanza del

+

procariote, che da quel momento dimostrerà un fenotipo Trp . Dato che con

un plasmide si può trasferire un operone intero, se nell’operone del donatore

c’è un ulteriore mutazione, si osserva una complementazione di entrambe le

mutazioni se sono in geni differenti. Infatti, dato che le proteine diffondono nel

citoplasma, per attivare la via biosintetica del Trp è sufficiente che vengano

prodotte da qualche parte.

Configurazione trans = quando due mutazioni sono presenti su due diversi

cromosomi oppure la mutazione c’è su un cromosoma solo e sull’altro no. Se

queste mutazioni sono su geni differenti allora c’è complementazione, se

sono sullo stesso gene non c’è.

Configurazione cis = quando le due mutazioni sono sullo stesso

cromosoma. Se queste mutazioni sono recessive ci può essere

complementazione, se invece sono dominanti no.

Il test di complementazione in cis serve come controllo. (?)

N.B.: Nel test di complementazione non deve avvenire

ricombinazione! Infatti per verificare la mutazione è necessario

che le mutazioni siano in trans. Però può accadere che il gene

F’ si integri nel cromosoma del ricevente.

Una cellula può avere molti plasmidi, alcuni coniugativi altri non coniugativi.

Però può avvenire la ricombinazione tra un batterio coniugativo ed uno non

coniugativo, che rende il batterio non coniugativo in grado di coniugare. Può

anche succedere che uno non sappia coniugare ma abbia ORI-T e l’apparato

di coniugazione gli sia fornito da un plasmide coniugativo.

La trasduzione

I virus

I virus sono elementi genetici in grado di replicare autonomamente rispetto ai

cromosomi batterici, ma non rispetto alla cellula stessa, che è detta ospite. Al

contrario dei plasmidi, i virus posseggono una forma extracellulare.

Nella forma extracellulare, detta particella virale o virione, il virus è composto

da: Un acido nucleico.

 Un involucro fatto da proteine ed occasionalmente altra



macromolecole.

Il virione è la forma attraverso cui il genoma virale viene trasportato dalla

cellula in cui è stato prodotto ad un’altra in cui può riprodursi, dando così

inizio alla fase intracellulare, in cui avviene la replicazione del virus:

Vengono sintetizzate molte copie del virus.

 Vengono sintetizzate e assemblate le proteine del capside.



Il processo di ingresso in cellula e riproduzione è detto infezione e in questo

processo c’è una forte dipendenza del virus dai meccanismi biosintetici

dell’ospite: il virus ne riprogramma le funzioni metaboliche in vista della

produzione di nuovi virioni.

I virioni si possono trovare anche in fase intracellulare nelle fasi tardive

 dell’infezione.

I virus si dividono, a seconda della preda, in:

Virus degli animali.

 Virus dei vegetali.

 Virus batterici o batteriofagi.



Inoltre il sistema di classificazione di Baltimore prevede la classificazione in

base al tipo di acido nucleico presente nel virione:

Virus a DNA:

 dsDNA;

o ssDNA.

o

Virus a RNA:

 dsRNA;

o ssRNA.

o

Virus che usano entrambi i tipi di acido nucleico in momenti diversi del

 ciclo “vitale”:

Retrovirus: sono a RNA, ma usano un intermedio a DNA (ss o

o ds).

Epadnavirus: sono a DNA, ma usano un intermedio a RNA (ss o

o ds).

La struttura del virione

Il virione generalmente ha una dimensione di circa 20-30nm. Il genoma può

essere lineare o circolare e può essere composto da una o più molecole; le

dimensioni sono di circa 1000-5000, i più piccoli contengono solo 5 geni.

Capside = rivestimento proteico formato da delle subunità strutturali

proteiche che assemblandosi formano i capsomeri. I capsomeri

sono strutture ripetute formate da proteine in grado di auto-

assemblarsi, anche se possono essere aiutate da degli chaperon,

che però non fanno parte della struttura finale.

Nucleocapside = acido nucleico + capside.

Alcuni virioni presentano al proprio interno degli enzimi per l’infezione, come

ad esempio il lisozima, che “buca” la parete dei batteri. In realtà alcuni

contengono anche delle polimerasi, per trascrivere l’acido nucleico senza

usare quella della cellula ospite.

Alcuni all’esterno del nucleocapside presentano un involucro

pericapsidico, che consiste di un doppio strato lipidico con delle proteine.

Il nucleocapside può avere una simmetria:

• Elicoidale: sono detti virus bastoncellari e la loro lunghezza dipende

dalla lunghezza del genoma; infatti le proteine sono assemblate a

formare un’elica di proteine attorno all’acido nucleico. Es. virus del

mosaico del tabacco.

• Icosaedrica: la struttura è simile ad una sfera, è un poliedro con 20

facce e per ogni faccia ci sono 3 subunità strutturali.

A volte i virus hanno una testa icosaedrica e una coda elicoidale (es. fago

T4).

Analisi quantitativa dei virus

Placca virale = fenomeno attraverso il quale una cellula, contornata da altre

cellule in maniera confluente e in monostrato, se viene infettata da un virus

permette la produzione della progenie, che viene liberata mediante lisi della

cellula stessa. Quando la coltura cellulare è immobilizzata da agar i virus

prodotti possono infettare solamente le cellule adiacenti e così si forma una

placca di lisi che dopo colorazione delle cellule ancora vive è visibile ad

occhio nudo come una sorta di buco nella coltura cellulare.

I virus sono troppo piccoli per venire contati, così si fa una stima quantitativa

in base ai danni che vengono creati sulle singole cellule. Si definisce unità

infettiva virale la più piccola unità capace di causare un danno rilevabile in

presenza di un ospite suscettibile.

La stima della quantità dei virus è data dalla determinazione del numero

 di unità infettive per il volume del fluido.

Un metodo per quantificare i virus presenti in una soluzione è il saggio delle

placche: funziona come la conta batterica vitale, si piastra su agar il la

soluzione batterica con i virus e si contano le placche che si formano,

presupponendo che ogni placca si formi da un singolo virione, formando delle

colonie pure. Dato che l’efficienza di infezione è spesso ben lontana dal

100%, si usa esprimere il risultato come unità formanti placca (Ufp).

Il procedimento è lo stesso per determinare le unità formanti colonia e le unità

formanti placca:

Ufc o Uft n ° colonie o placche × fattore di diluizione

=

mL v olume piastrato

Certo bisogna usare una diluizione adeguata perché non si crei un

sovraffollamento di virus tali che i virioni possano andare in giro e le placche

possano essere il risultato di più di un virione. Tenendo conto del numero di

colonie piastrate e della diluizione del virus ottengo quindi il numero di ufp,

che corrisponde al numero di virioni in grado di infettare.

Un parametro importante è l’efficienza di piastramento:

Ufp

mL

Efficienz a di piastramento= × 100

Virus contati al TEM

La replicazione virale

La replicazione virale prevede 5 fasi in base alle quali si può costruire la

curva di crescita del tal virione:

1. Attacco (adsorbimento) del virione alla cellula ospite suscettibile.

2. Penetrazione (iniezione) del virione o del suo acido nucleico nella

cellula ospite.

3. Sintesi di acido nucleico prima, delle proteine e dell’eventuale involucro

poi.

4. Assemblaggio delle subunità strutturali (e dell’eventuale involucro) e

impacchettamento dell’acido nucleico nelle particelle virali.

5. Rilascio dei virioni maturi dalla cellula.

La curva di crescita della replicazione virale è detta a ciclo unico. Inizialmente

c’è un periodo di adsorbimento, in cui non c’è crescita, poi inizia un

periodo, detto eclissi, che prevede la separazione dell’acido nucleico dal

capside proteico, e intanto avviene la riprogrammazione del metabolismo

cellulare. Questa dura fino alle prime fasi dell’assemblaggio, momento in cui

si assiste ad un periodo di maturazione dei virioni. Il periodo in cui non ci

sono virioni extracellulari è detto periodo latente ed il numero di virioni che

vengono rilasciati è detto dimensione di scoppio.

Virus temperati

Alcuni virus sono solo virulenti, ma altri, detti temperati, possono scegliere

una via diversa alla lisi cellulare: la lisogenia, cioè un’espressione solo

parziale del genoma virale, che viene replicato insieme al cromosoma

batterico ad ogni ciclo cellulare. E’ una sorta di latenza che può essere

risvegliata se viene eliminato il repressore dei geni che controllano il ciclo

litico, che è codificato dal fago. Questo repressore inoltre inibisce

l’espressione di qualunque altro genoma virale simile, conferendo al batterio

una sorta d’immunità. I batteri che li contengono, detti lisogeni, producono

spontaneamente dei virioni dei virus temperati se però questo repressore

viene a mancare.

Il genoma virale viene integrato nel cromosoma batterico e viene tramandato

alla progenie. Questo stato latente del virus è detto pro-virus o profago.

Il batteriofago lambda

Il fago lambda è un fago di E. Coli e il suo genoma è una molecola lineare di

dsDNA che ad ogni 5’ ha una coda a ssDNA di 12 nucleotidi (-> estremità

protruding o coesive), che servono a circolarizzare il genoma quando è in

cellula. Esso possiede sia la via litica sia quella lisogenica: di solito sceglie la

via litica, ma a volte questo non accade.

Quando il DNA di lambda entra in cellula si circolarizza quasi subito e la RNA

polimerasi inizia a trascrivere a partire da due