Appunti di Microbiologia

Genetica

Il cromosoma

I cromosomi batterici solitamente sono circolari, con una sola origine di replicazione, caso in cui il cromosoma corrisponde con il replicone. Tipicamente un cromosoma è di 5 milioni di paia di basi e di 4500 geni. I cromosomi sono solitamente associati a delle proteine, in particolare alle topoisomerasi, che creano (girasi) o svolgono i superavvolgimenti. I cromosomi sono divisi in domini di superavvolgimento.

Alcune specie possono avere un cromosoma lineare e lo si capisce perché tagliando in n punti cromosoma circolare i frammenti sono n, mentre tagliando in n punti un cromosoma lineare i frammenti sono n+1. I geni sono organizzati in operoni = insieme di geni che vengono regolati in modo strettamente coordinato; oltre ai geni che devono essere trascritti, contengono anche dei siti di controllo, cioè delle sequenze regolatrici.

Il plasmide

Plasmide = molecola circolare di DNA grande circa 2000-5000 bp, non essenziale per la vita, dotata di un’unica origine di replicazione. Replica indipendentemente il DNA, ma per farlo:

• Può fabbricare da sé il necessario.
• Può in tutto o in parte degli apparati cellulari.

I plasmidi possono codificare funzioni che conferiscono determinate proprietà al batterio, quali:

• Resistenza ad un antibiotico.
• Produzione di antibiotici/tossine/fattori di virulenza.
• Capacità di coniugare.
• Nuove capacità metaboliche.

Sono più piccoli del DNA batterico, infatti posso estrarli interi e farli correre nel gel senza romperli.

Analisi genetica

Per l’analisi genetica occorrono:

• Mutanti
• Rimescolamento genico

L’analisi genetica è stata portata avanti su E. Coli per i batteri Gram- e su B. subtilis per i Gram+. L’analisi genetica può andare ad analizzare i geni attraverso le seguenti proprietà:

• Morfologia: Forma delle cellule. Forma e colore delle colonie.
• Capacità o meno di crescere in date condizioni ambientali: Temperatura, Luce, Terreno, Antibiotici.
• Condizioni genetiche: Presenza di fagi, Presenza di plasmidi.
• Altre proprietà: Motilità, Coniugazione, Interazione con l’ambiente.

I mutanti possono essere mutanti per:

• Resistenze
• Auxotrofia
• Metabolismo
• Condizioni ambientali

Dopo aver creato la mutazione bisogna selezionare i mutanti d’interesse, anche se non lo si può fare per tutte le mutazioni. Organizzo delle condizioni permissive per il mutante ma non per il wt. Ottengo solo colonie mutanti.

Per esempio, se il mutante ha come reporter la resistenza ad un antibiotico, metto l’antibiotico nel terreno ed ottengo solo colonie mutanti.

Tecniche di identificazione

Per l’identificazione si possono usare diverse tecniche:

1. Si può usare anche la tecnica del replica plating: applico un foglio di nitrocellulosa alla piastra primaria e lo appoggio a turno su più piastre secondarie, dove si formeranno colonie con la stessa distribuzione che nella primaria, poi faccio uno screening cercando i mutanti. Se faccio la replica su terreni diversi posso analizzare in che condizioni crescono le colonie. Posso analizzare le autotrofie! Per esempio, se ho un mutante che non cresce in un terreno dove non c’è leucina, evidentemente è un mutante leu-. Se faccio la replica plating su LB e terreno minimo: sull’LB sono in grado di crescere tutti, sul minimo solo i prototrofi. A questo punto confronto le colonie da un terreno all’altro: quelle che mancano nel minimo hanno la mutazione (es. Leu-).
2. Replica plating con griglie.
3. Arricchimento in mutanti con la tecnica della penicillina: dato che la penicillina colpisce solo le cellule in crescita, si può aggiungerla al terreno senza il fattore di crescita necessario ai mutanti, di modo che colpisca ed uccida solo le cellule parentali. A questo punto si lava via la penicillina e si pongono i mutanti (rimasti non colpiti) su un terreno contenente il fattore di crescita, di modo che si sviluppino.
4. Selezione dei revertanti: piastro su due Petri diverse delle cellule prese da una soluzione di soli mutanti. Uso su una piastra delle condizioni permissive per il mutante e nell’altra delle condizioni non permissive per il mutante: a questo punto le colonie che crescono in condizioni non permissive derivano da dei revertanti.

Ottenere i mutanti

Come posso ottenere i mutanti?

• Mutazioni spontanee.
• Induzione di mutazioni:
• Sostanze chimiche.
• Raggi γ o UV.

Ora, noi sappiamo che esistono delle mutazioni adattative, cioè delle mutazioni che rendono un batterio più adatto a vivere in un certo ambiente. Ma sono indotte dall’ambiente o sono preesistenti? Cioè, c’è la trasmissione di un carattere acquisito o la selezione di un carattere da parte dell’ambiente?

Con il test di fluttuazione si dimostra che non è l’ambiente a determinare la mutazione, ma che esso seleziona le mutazioni favorevoli pre-esistenti. Funziona come segue.

Faccio una coltura in beuta di E. Coli, poi la divido in due porzioni da circa 1000 cellule ciascuna. La prima la metto in un'unica beuta a crescere, la seconda la divido in 50 provette. A questo punto prelevo 50 aliquote dalla beuta e una da ognuna delle 50 provette, poi pongo tutte le aliquote su agar con fago T1 ed osservo le reazioni. Posso fare due ipotesi:

IPOTESI 1: Se la mutazione è pre-esistente, è comunque casuale ed indipendente dal terreno col fago T1. Può insorgere presto od essere già presente. A seconda del punto dell’esperimento in cui la mutazione insorge, potrò avere un numero diverso di gruppi resistenti: Se la mutazione insorge nelle provette piccole avrò delle piastre piene di resistenti ed altre vuote. Se deriva dalla colonia grande ci sarà una maggiore distribuzione della mutazione e le piastre conterranno circa lo stesso numero di colonie resistenti. N.B.: Che la mutazione sia tardiva o precoce, se avviene nel gruppo nella beuta tutte le piastre da essa provenienti avranno circa la stessa distribuzione.

IPOTESI 2: Se è l’ambiente a determinare la mutazione adattativa vuol dire che i mutanti compaiono in risposta al fago e quindi posso aspettarmi che il numero delle colonie resistenti sia uguale tra le provette e la beuta, perché la mutazione è dovuta al contatto col fago nell’agar.

• 1. Ipotesi: mutazione -> ambiente
• 2. Ipotesi: ambiente -> mutazione

I risultati del test di fluttuazione danno ragione alla prima ipotesi: i batteri sono resistenti al fago PRIMA di incontrarlo e il numero di mutanti dipende da quando subentra la mutazione. La funzione del fago è solo quella di selezionare i mutanti preesistenti.

Rimescolamento dell'informazione genetica

La riproduzione dei procarioti avviene per scissione binaria. L’informazione genetica passa verticalmente: si formano due cellule figlie cloni della madre e via via si formano linee pure in cui non c’è rimescolamento sessuale. L’unica variabilità genetica è data dalle mutazioni, in assenza delle quali i cloni sono tutti identici. Tuttavia i microrganismi possono passarsi del materiale genetico in modo orizzontale con dei fenomeni di tipo sessuale non finalizzati alla riproduzione. La stessa cellula che compie l’atto sessuale prende la nuova informazione genetica, non è la cellula figlia a prenderla.

Passaggi di informazione in vivo

Normalmente per fare indagini genetiche bisogna incrociare ceppi diversi (genotipo diverso) di uno stessa specie. Per farlo anche coi batteri si sono sfruttati dei processi in vivo in cui i batteri si scambiano materiale genetico. Questi fenomeni sono:

• Trasformazione: con DNA libero nell’ambiente.
• Coniugazione: è necessario il contatto cell-to-cell.
• Trasduzione: è un trasferimento di materiale genetico mediato da virus.

Non sono tutti fattibili da tutti i tipi di cellule e non è detto che avvengano solo tra cellule della stessa specie/dominio. Permettono di acquisire nuovo materiale genetico:

• Acquisizione di repliconi omologhi o non omologhi (es. un plasmide)
• Integrazione di nuove informazioni solitamente con ricombinazione omologa.

Trasformazione

Nella trasformazione del DNA libero nell’ambiente viene incorporato in una cellula ricevente, che è detta competente (cioè è in grado di trasformare). Questo fenomeno permette la ricombinazione genica tra batteri diversi. La competenza può essere:

• Costitutiva: c’è sempre.
• Acquisita in particolari momenti fisiologici, come in momenti di stress ambientale.

In generale, i passaggi sono i seguenti:

1. Viene acquisito del DNA libero a doppio filamento, solitamente non un cromosoma intero.
2. Questo DNA viene legato da delle proteine batteriche.
3. Eventualmente può venire frammentato ed ulteriormente degradato.
4. Entra un filamento, che può subire:
   • Degradazione da parte di una nucleasi.
   • Ricombinazione omologa col genoma del batterio.

Fenomeno nei Gram+ e Gram-

Per i Gram+:

• Competenza: inducibile
• Il dsDNA si lega alla membrana, inizialmente in modo reversibile, poi in modo irreversibile.
• Poi uno strand (3’->5’) del DNA viene degradato da una nucleasi (RecBCD).
• Lo strand integro viene legato da RecA.
• Nel citosol ho la ricombinazione omologa.
• Inizialmente, durante la ricombinazione, si formerà del DNA eteroduplex, poi, alla divisione cellulare, si formeranno due molecole figlie omoduplex.

Per i Gram-:

• Competenza: diversificata
• Il dsDNA entra nello spazio periplasmico e lì viene parzialmente degradato da delle proteine.
• Un filamento singolo entra nel citosol, addirittura in alcune specie sono trasportate solo determinate sequenze. N.B.: Tutto questo avviene solo per frammenti di DNA lineare, i batteri competenti sono spesso scarsamente trasformati da plasmidi.

I batteri possono venire trasformati in seguito all’infezione di un virus o di un fago con DNA virale o batterico, fenomeno chiamato transfezione. Artificialmente si può indurre la competenza mediante l’uso di elevate concentrazioni di Ca²⁺ e basse temperature, come è stato fatto, per esempio, in E. Coli. Questa permette di trasformare il batterio anche con plasmidi.

Tuttavia ora questa tecnica sta per essere soppiantata dall’elettroporazione: le cellule vengono poste in un campo elettrico pulsante, che apre dei pori nelle membrane, di modo che le molecole di DNA possano entrare nelle cellule. Se sono entrambe presenti, con questa tecnica si può anche trasferire un plasmide da una cellula ad un’altra.

Coniugazione

La coniugazione differisce dalla trasformazione perché è necessario il contatto tra un donatore e un ricevente.

C’è un contributo asimmetrico.

La coniugazione è un meccanismo codificato da un plasmide per trasferire sé stesso da una cellula all’altra, tuttavia a volte col plasmide in questione possono essere mobilizzati elementi genetici del batterio oppure altri plasmidi.

Il plasmide F

Il plasmide F è un plasmide di dsDNA lungo circa 100 kb, con un’origine, detta ORI-V, perché è un’origine vegetativa. Replica autonomamente e contiene geni:

• Per la propria replicazione
• Per costruire il pilo ed eseguire la coniugazione
• Per controllare il numero di copie (di plasmidi) da ripartire per ogni cellula figlia.

Contiene anche altri elementi, tra cui un’origine, ORI-T, che è l’origine per il trasferimento coniugativo del DNA plasmidico. Da ORI-T comincia una regione, detta regione tra, che contiene i geni che controllano la coniugazione, in particolare per la formazione del pilo e, quindi, delle coppie di coniugazione. La regione tra controlla anche la capacità del plasmide di integrarsi nel cromosoma della cellula batterica. I plasmidi che possono integrarsi sono detti episomi e quando lo fanno la loro replicazione procede sotto il controllo del cromosoma stesso.

Il plasmide F è un plasmide coniugato, cioè dirige il proprio trasferimento da una cellula all’altra.

I passaggi della coniugazione

Perché due cellule possano coniugare il plasmide deve codificare la sintesi di una struttura superficiale detta pilo sessuale, che permette l’appaiamento tra la cellula donatrice e la cellula ricevente. I pili sono leggermente diversi tra plasmidi diversi. I pili funzionano così: prendono contatto con un recettore specifico sulla cellula ricevente, poi si ritraggono, costringendo le due cellule ad entrare in contatto. Poi c’è la fusione delle membrane esterne e il DNA viene trasferito da una cellula all’altra.

Attraverso il pilo passa alla cellula ricevente un ssDNA legato a delle proteine, poi nel ricevente viene sintetizzato lo strand complementare. Il modello della replicazione a cerchio rotante può spiegare come avviene il trasferimento, che avviene con le seguenti fasi:

• Quando le cellule entrano in contatto scatta il segnale per il taglio del plasmide da parte dell’enzima TraI, codificato dall’operone tra del plasmide F. TraI è anche un’elicasi e separa i due strand.
• Appena inizia il trasferimento del DNA, comincia il meccanismo a cerchio rotante, che permette di sostituire il filamento trasferito. Anche nel ricevente viene sintetizzato il complementare.

Alla fine del processo sia il donatore sia il ricevente hanno un plasmide intero.

È un processo molto efficiente e se i geni del plasmide possono essere espressi nel ricevente, questo può diventare donatore per altre cellule.

N.B.: I plasmidi possono venir persi spontaneamente da una cellula con un processo detto...