Microbiologia

TERRENI LIQUIDI

Sono terreni semplici da preparare, sono utilizzati quando abbiamo grosse quantità di batteri in

crescita per studi sperimentali, questo tipo di terreno ha però un limite non può separare

microrganismi diversi a meno che non sia stata utilizzata una cultura pura, la progenie viene infatti

dispersa. A volte per dover isolare alcuni batteri è necessario utilizzare questi terreni per preparare

emoculture, per isolare batteri patogeni dal sangue, che viene prelevato all’incirta 20 ml e

incoculato in terreno liquido. Il tutto potrà poi esser messo in un incubatore.

TERRENI SOLIDI

Sono contenuti in piastre petri, con base e coperchio, hanno come componente principale l’agar.

Koch in un primo momento utilizzava delle patate, ma i batteri metabolizzavano questo substrato,

la gelatina invece fondeva alle temperature di incubazione. L’agar veniva utilizzato per fare delle

zuppe nelle cucine orientali, fu importato dall’Indonesia. L’agar è un estratto polisaccaridico di

un’alga marina, di solito se ne utilizza 1.5%, fonde a 80-90 C e resta liquido fino a 40-42,

temperatura alla quale solidifica, non viene metabolizzato dai batteri, non

è tossico e la sua composizione non viene alterata alla temperature di

sterilizzazione.

Nei terreni liquidi l’indice di crescita è la torpidità, nei solidi la comparsa

delle colonie batteriche.

E Il terreno solido come si semina? Si parte da una soluzione batterica,

che si preleva con l’ansa che termina con una sorta di cerchietto che

permette di prelevare circa 1 microlitro e la seminiamo sul terreno solido.

Di solito di utilizza il metodo dei 4 quadranti: il batterio viene posto in un

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punto e si eseguono degli strici nel quadrante, in seguito si cambia angolazione e si creano nuovi

strisci fino ad arrivare al quadrante D. Capovolgiamo la piastra per evitare che si formi della

condensa nell’incubatore a 37 C. Dopo 24 ore vedremo crescita batterica con comparsa di colonie,

queste sono delle masse di batteri provenienti da un solo batterio che si è depositato, a occhio

nudo vediamo dei puntini, ognuno di questi contiene all’incirca 1-10*10^6 cellule. Lo scopo del

piastramento sul terreno solido è quello di ottenere un materiale isolato, diluendo il materiale di

partenza mediante la spartizione di quattro quadranti., si ottiene una culture pura, ovvero

omogenea, costituita da un unico microrganismo.

La morfologia delle colonie batteriche è molto varia:

Questi

parametri hanno valore diagnostico, sono fondamentali per l’identificazione dei batteri a partire

dalla morfologia.

Le tappe della diagnosi batteriologica sono quindi:

• Prelevo batterii

• Potenziale colorazione

• Inoculo batterio in coltura

• Incubatrice

• Identifico il batterio a partire dalla cultura pura

TERRENI DI COLTURA SINTETICI O MINIMI O A COMPOSIZIONE DEFINITA

Molto facili da preparare e in cui tutte le componenti sono note. Utili in esperimenti come la ricerca

del microrganismo che può fissare l’azoto atmosferico, si prepara un terreno sintetico con C,P,S

ma non N, l’unico organismo capace di crescere è per forza un microrganismo capace di fissare

l’azoto.

Il terreno minimo prende in considerazione le molecole minime per la crescita di un batterio, invece

un terreno definito è anche chiamato terreno di arricchimento poiché rispetta condizioni particolari

come il pH.

TERRENI COMPLESSI

Utilizzati sia in ricerca che in diagnostica, son chiamati così poiché son costuiti da estratti di

materia organi a basso costo come derivazioni della digestione enzimatica della carne, estratti di

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lievito, sangue, sangue sopratto di montone, e non ne conosciamo la composizione. Se il terreno è

molto ricco viene chiamato brodo nutritivo.

TERRENI SELETTIVI

Permettono di selezionare la crescita di alcuni micorganismi e non di altri, nel terreno sono

presenti inibitor di crescita per alcuni organismi come i sali biliari che inibiscono la crescita della

maggior parte dei batteri gram+, mentre i batteri enterici gram- crescono bene.

TERRENI DIFFERENZIALI

Nella maggior parte dei casi i terreni sono sia selettivi che differenziali. Il secondo tipo permette

una selazione sulla base delle proprietà metaboliche. MacConkey agar è un terreno sia selettivo

che differenziale che possiede un indicatore di pH, cromogeno che vira di colore in presenza di

acidi prodotti dal metabolismo del batterio. I batteri che fermentano un particolare zucchero ad

esempio produrranno dei rifiuti acidi, l’indicatore sarà sul rosso (colore per questo batterio), mentre

i batteri che non fermentano lo stesso saccaride rimarranno bianche.

TERRENO MACCONKEY

Il Macconkey agar è sia selettivo che differenziale nel primo caso è selettivo per i batteri enterici

come eschirichia coli e salmonella, in cui sali biliari inibiscono i gram+.

MacConkey è differenziale per i batteri che producono lattosio attraverso il cromogeno.

TERRENO MSA

Un altro terreno importante è MSA (mannitol salt agar) è selettivo per la presenza per NaCl al

7.5%, permette la crescita di batteri alotolleranti come lo stafilococco aureus e permette di

differenziare i batteri che fermentano il mannitolo, nel caso lo fermentino si noterà una variazione

di colore, in caso contrario si manterrà la colorazione di partenza.

TERRENO AGAR SANGUE

Terreno sia differenziale che di arricchimento, differenzia i cocchi (stafilococchi+ streptococchi)

gram+ produttori di emolisine, tossine che causano la lisi dei globuli rossi.

I batteri che hanno emolisine beta causano la lisi completa dei globuli rossi che si trovano nell’agar

sangue, questa lisi fa sì che attorno alla colonia si formi un alone trasparente. Gli alpha causano

una lisi parziale e presentano un alone verde, i gamma non danno emolisi.

CRESCITA MICROBICA

Si intende con questo termine l’aumento del numero di batteri una popolazione batterica. Il ciclo di

eventi, ovvero ciclo cellulare, serie di eventi in cui la cellula cresce e si divide, permette

l’accrescimento della cellula batterica, ovvero l’accrescimento coordinato di tutti i costituenti

cellulari, per divisione si intende la scissione o fissione binaria, processo in cui da una cellula si

generano due cellule figlie identiche. In un bacillo come eschirichia coli il nuovo peptidoglicano che

permette la crescita viene corporato in maniera diffusa lungo il corpo batterico, si formano rotture

da parte di autolisine, che permettono la nuova deposizione, sotto di questo si sviluppa la

membrana citoplasmatica passivamente seguendo il peptidoglicano. In parallelo all’elongazione

abbiamo la replicazione del DNA che si replica restando ancorata alla membrana, i due cromosomi

figli vengono trascinati ai poli della cellula in crescita. Quando la cellula ha raggiunto circa il

doppio della sua lunghezza si forma per introflessione di parete e membrana se gram+, se gram-

anche di membrana esterna, un setto trasverso. Dopo la formazione di questo si formano due

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distinte pareti delle cellule figlie e si può avere o meno la separazione delle cellule es. alcune

cellule sono associate a due a due, a catenella…

Il tempo per completare un ciclo cellulare è una generazione, nel

caso di E.coli circa 17 minuti in condizioni ottimali, il tempo

dipende dalle condizioni del terreno di coltura.

FORMAZIONE DEL SETTO

La formazione è possibile per via della proteina FtsZ (proteina

sensibile alla temperatura) le cui copie si dispongono ad anello in

posizione mediana sulla faccia interna della membrana

citoplasmatica definendo il piano di divisione cellulare. Le proteine

polimerizzano formando un anello completo e su questo anello si

deposita il peptidoglicano, si forma un anello che si approfonda

verso l’interno, il setto verrà spaccato in due strati da una proteina

che si chiama Env-A, questi due strati costituiranno le nuovi pareti

delle cellule figlie.

Un ruolo fondamentale è svolto dai prodotti di 5 morfogeni che

sono: FtsZ, End-A, Min-C, Min-T, Min-E. I geni Min-c e Min-d formano dei prodotti che danno

origine al complesso Min C-D che si localizza in complessi alternativi ad esempio polari

escludendo il legame con FtsZ(?). Min-E si lega ai nucleotidi appena replicati e media la

localizzazione di FtsZ in posizione mediana. Avvenuto il restringimento si ha la depolimerizzazione

di FtsZ mediante idrolisi di GTP. Mre-I proteina che definisc forma del batterio formando strutture

come un citoscheletro di actino sotto la membrana contro cui genera una forza, i cocchi sono

sferici poiché mancano di questa proteina.

Nei cocchi la sintesi di nuovo peptidoglicano di parete avviene solo in una posizione precisa, a

livello del piano di divisione cellulare.

QUANDO SI HA L’INIZIO DELLA REPLICAZIONE DEL DNA NEL CICLO CELLULARE?

Eschirichia coli è stato studiato durante la crescita veloce e durante quella lenta per rispondere a

ciò

CRESCITA CELLULARE

• Crescita lenta per via di terreni poveri: I (tempo che intercorre tra due inizi di replicazione

successivi), C= 40 min in esch. per replicazione DNA, D= 20 min in esch. Per la formazione

del setto e per la divisione I=C+D= 70 min

• Crescita veloce, terreno ricco I=C+D= 30 min sempre con C=40 min e D=20 min

Questo è possibile poiché quando il batterio è a crescita lenta, una nuova duplicazione di Dna non

inizia finché non è terminata la divisione cellulare, la cellula figlia ha pertanto un solo cromosoma.

In crescita rapida invece una nuova duplicazione inizia prima che sia avvenuta la divisione così la

cellula figlia si trova ad avere un cromosoma e mezzo.

1. L’inizio della replicazione dipende da quando la cellula raggiunge una certa massa, se si

trova in terreno ricco ovviamente la raggiungerà prima, vi sono poi alcuni fattori che

influenzano l’inizio della replicazione come la concentrazione intracellulare della DNA-A

protein che si lega a OriC e permette la separazione dei due strand di DNA , grado di

metilazione di OriC, concentrazione intracellulare della guanosina tetrafosfato

indirettamente proporzionale alla velocità di crescita, questa inibisce la sintesi della DNA-A

protein.

MISURAZIONE CRESCITA BATTERICA

Si misura valutando nel tempo uno di questi due parametri: concentrazione cellulare (num cellule/

unità volume) o massa cellulare

Abbiamo due tipi di misurazioni dirette per la concentrazione cellulare:

1. Conta microscopica diretta

2. Conta vitale o in piastra

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Per la massa cellulare misuriamo la torpidità, la quantità totale di azoto o di proteine, l’attività

biochimica (consumo di O2 o produzione di CO2), misurazione del peso secco/umido delle celle o

del volume dopo centifugrazione.

1. Conta