Metodi di laboratorio

AGENTI ANTIMICROBICI FISICI E CHIMICI

Eventuali effetti dannosi dei microorganismi:

Contaminano e si riproducono su vari substrati (es. alterazioni chimico fisiche di alimenti)

Si introducono negli organismi causando patologie infettive trasmissibili

Producono sostanze dannose come le tossine

STERILIZZAZIONE:x completa eliminazione di tutti i microrganismi (cellule vegetative e spore) presenti in un

determinato ambiente

Sfruttando:

a) Mezzi fisici: calore (alte temperature), filtrazione, radiazioni, ultrasuoni;

b) Mezzi chimici

c) Mezzi chimico-fisici

DISIFEZIONE: x ridurre/ eliminare tutti i microrganismi unicellulari patogeni (allo stato vegetativo) dalle superfici

degli oggetti o superfici di lavoro

Sfruttando: Mezzi chimici

Nel dettaglio…

Mezzi fisici antimicrobici:

Premessa: l’effetto antimicrobico degli agenti fisici dipende dell’intensità dell’esposizione e dalla distanza della

sorgente

CALORE:

cs) Calore secco: mezzo di trasferimento del calore= aria; tempi e temperature maggiori (180°Cx 1h; 160°Cx2h)

- I principali metodi sono:

a. Esposizione diretta alla fiamma (Becco bunsen)

b. Incenerimento a temperature superiori a 500°C x distruzione di materiale infetto, cadaveri, rifiuti

c. Stufa a secco

- utilizzo: soprattutto x sterilizzazione di strumenti e materiali non deteriorabili e non disidratabili (es. oggetti di vetro,

porcellana e metallo, olii e polveri farmaceutiche)

cu) Calore umido: mezzo di trasferimento del calore= acqua; tempi e temperature minori (grazie al fatto che a det T

l’acqua è in grado di assorbire una quantità di calore molto più elevata rispetto all’aria; ed è in grado di liberare calore

con maggiore velocità e con una maggiore capacità di penetrazione nel materiale trattato)

I principali metodi sono:

a. Vapore fluente e bollitura (100°Cx30/60 min) x eliminazione di forme vegetative batteriche + Spore funginee +

Tossine termolabili (NB: NON ideale a lungo termine per i Metalli, poiché porta a corrosione)

b. Vapore sottopressione= utilizzando l’Autoclave= strumento simile ad un recipiente metallico a chiusura ermetica

che utilizza il vapore sotto pressione liae (rapida penetrazione del calore nei materiali trattati) per la sterilizzazione

- funzionamento: Resistenza elettrica riscalda l’acqua distillate presente sul fondo dei contenitoriproduzione

vapore > pressione (fino a 2 atm) > T (100-300 °C) vapore è prodotto dall’acqua distillata presente sul fondo di

questo recipiente (riscaldata da una resistenza elettrica) soprattutto x Terreni colturali, Vetro, Plastica apposita

NB: x Sterilizzazione ottimale: T=121° C per 15-20 minuti a p=1 atm.

- vantaggi: rapidità di penetrazione nei materiali

distruzione del microrganismo in breve tempo

facile controllo della sterilità

atossicità

- svantaggi: degradazione del materiale termolabile

corrosione dei metalli (a lungo andare) e quindi per essi è preferibile utilizzare il calore a secco

impossibilità di sterilizzare grassi e polveri di anidride

c. Tyndalizzazione: (es. x sterilizzazione terreni di coltura che contengono sostanze termolabili) è consigliata

soprattutto x conservare gli alimenti

- funzionamento: innalzamento della T a 80°C per 30 minuti (ripetute x 3 volte successive intervallate da incubazioni

a 37°C per 24 ore)

NB: primo trattamento termico eliminazione forme vegetative

prima incubazione a 37°C per 24 h germinazione delle spore che resistono alla prima ebollizione

Secondo trattamento termico eliminazione spore germinate nella prima incubazione

seconda incubazione a 37°C per 24 h

Terzo trattamento termico eliminazione spore che ancora non erano diventate delle forme vegetative

d. Pasteurizzazione/Pastorizzazione: tecnica messa a punto da Pasteur x gli alimenti, evitandone un’eccessiva

degradazione (INFATTI non si supera mai i 100°C, esattamente come la Tyndalizzazione)

- funzionamento: trattamento termico viene portato a una temperatura inferiore ai 100°C per evitare un’eccessiva

degradazione degli alimenti. In questo caso all’aumentare della temperatura diminuisce il tempo di esposizione,

addirittura con una pastorizzazione a temperatura ultra alta si espone il materiale per un secondo

NB: metodo è microbicida ma evita anche la perdita eccessiva di alcuni principi nutrizionali come le vitamine

a) 63°C per 30 minuti: pastorizzazione bassa

b) 72°C per 15 secondi: pastorizzazione alta

c) 90°C per 1 secondo: pastorizzazione UHT

FILTRAZIONE: x rimozione microrganismi e particelle microscopiche da soluzioni contenenti costituenti termolabili

(es. aria; altri gas che non permettono di ricorrere all’utilizzo dell’autoclave) (es. preparazione di alcuni terreni di

coltura; decontaminazione di soluzioni vitaminiche/di antibiotici/di sieri)

- funzionamento: utilizzo di Filtri con una determinata porosità (permettono la ritenzione di tutti i microrganismi

dotati di strutture cellulari; NB: NON trattengono i virus)

NB: x filtrazione completa dei batteri membrane con una porosità= 0,2 micron (tra 0,2 e 0,8 micron)

RADIAZIONI ELETTROMAGNATICHE: forme di energia prodotte dalla materia ed emesse nello spazio alla velocità

della luce

- tipologie:

RU) Radiazioni ultraviolette= (lungh d’onda < lungh d’onda delle radiazioni visibili) con scarsa capacità di

penetrazione (NB: onde a maggiore effetto microbicida (lunghezza d’onda di 260 nm) agiscono sugli Ac nucleici)

soprattutto x distruggere le forme vegetative di Batteri e Miceti + Virus

Radiazioni uv naturali (provengono dal Sole, MA la maggior parte sono assorbite dall’Ozono) danni minori

Radiazioni uv artificiali (provengono da Lampade a vapore di mercurio) danni maggiori

Queste ultime sono utilizzate principalmente

x disinfettare le superfici e i locali (es. sale operatorie)

x preparazione di terreni di coltura

x disinfettare le cappe biologiche sempre a fine lavoro

RI) Radiazioni ionizzanti= con alta capacità di penetrazione

Raggi X= x diagnostica medica

Raggi gamma= x sterilizzare alimenti e dispositivi medici (piastre Petri, provette…)

MO) Microonde= onde elettromagnetiche a bassa frequenza; non hanno una elevata capacità microbicida, MA

soprattutto capacità riscaldante (NB: NON riscaldano aria, carta, legno, plastica per la mancanza di acqua + sono

riflesse dal metallo)

- utilizzo: (in laboratorio) x preparazione di terreni di coltura solidi (INFATTI permettono di sciogliere l’Agar-Agar in

una soluzione acquosa)

ONDE MECCANICHE:

US) Ultrasuoni= onde meccaniche sonore con una frequenza > 20 kHz

- utilizzo: (in natura) x comunicare animale; x captazione ostacoli

(in campo medico ed industriale) x pulizia superficiale di strumenti, MA NON come sterilizzatori

NB: In laboratorio si utilizza il Sonicatore= strumento x inattivare i microorganismi in sospensioni acquose

Mezzi chimici antimicrobici: sono classificati in 3 categorie in funzione del tipo di microrganismo che vanno a

distruggere:

1. Mca ad alta attività: capaci di sterilizzare, quindi di uccidere tutti i microrganismi (comprese le Spore e i Virus) (es.

Glutaraldeide, Formaldeide, Ossido di etilene; Sistema Gas plasma)

2. Mca ad attività media: capaci di uccidere quasi tutti i Batteri e i Virus, MA NON sono efficaci sulle Spore; (vengono

utilizzate le stesse sostanze ma a concentrazioni minori)

3. Mca ad attività bassa: capaci di uccidere alcuni tipi di Batteri/ Funghi/ Virus con envelope

Classificate in altre 3 categorie:

A. Disinfettanti: azione specifica NON selettiva = agiscono su Superfici + Oggetti inanimati con effetto

decontaminante sulle Forme vegetative (e alcuni Virus) x Oggetti inanimati e Ambienti

B. Antisettici: azione batteriostatica/battericida= agiscono sulle Forme vegetative di molti patogeni (e alcuni Virus) x

Tessuti umani/animali

C. Farmaci antimicrobici: agiscono sui componenti del microrganismo e alterandone la struttura e la fisiologia

FATTORI INFLUENZANTI L’ATTIVITA’ ANTIMICROBICA/MICROBICIDA/MICROBISTATICA

1. Concentrazione/Dose dell’agente: direttamente prop all’efficacia e velocità dell’azione antimicrobica)

2. Sensibilità microbica:

- >pt dei Batteri in forma vegetativa/Funghi/Virus con envelope sono i più sensibili alla distruzione

- alcuni Batteri (es. micobatteri)/ alcuni Virus/ alcune Spore fungine sono molto resistenti

- tutti i Germi sporigeni sono i più resistenti in assoluto (INFATTI è necessario agire con la Sterilizzazione)

3. Tempo di esposizione

4. Natura del materiale su cui si effettua il trattamento

- trattamento direttamente sui microrganismipiù veloce ed efficace

- trattamento sul materiale organico che riveste i microrganismi meno rapido

FINALITA’ DELLE COLTURE MICROBICHE

studiare i microrganismi dal punto di vista fisiologico, biochimico, molecolare e genetico;

studiare le interazioni microbiche con gli altri organismi e l’ambiente circostante;

evidenziare la presenza di specie patogene da un campione animale/umano/ambientale;

valutare l’attività antimicrobica di sostanze come gli antibiotici, sia per motivi legati alla clinica che per motivi

epidemiologici

TERRENO DI COLTURA: substrato in cui è possibile far riprodurre i microrganismi

- quasi tutti i batteri di interesse medico possono essere coltivati in sistemi artificiali (in vitro)

- Classificazione basata sulla composizione:

a) Terreni Naturali/empirici= terreni giù pronti; composizione NON costante; ricchi di estratti di carne e di lievito e di

fattori di crescita da fonti naturali (siero, sangue); di norma contengono circa il 2% “Peptoni” (proteine parzialmente

digerite con Enzimi peptidici/pancreatici o con idrolisi acida)

es. Latte; Sangue diluito; Infusi di carne/di vegetali

b) Terreni Sintetici/chimicamente definiti= terreni costituiti da componenti chimiche pure, a concentrazioni definite,

disciolte in acqua distillata; composizione costante:

1 fonte di C (Glucidi es. Glucosio; Ac organici es. Citrato, Lattato);

1 fonte di N (aa, Nitrati o Sali ammoniacali);

Cationi (Na+, K+, Mg+, Ca+, Fe, Re,…);

Anioni (anione dell’Acido fosforico e solforico…)

c) Terreni Semisintetici/ complessi/ chimicamente indefiniti= terreni costituiti sia da Componenti naturali, che

Componenti a concentrazioni note; contengono proteine animali ed estratti (di lieviti, di carne, di caseina…).

NB: I terreni più utilizzati sono conservati disidratati nei barattoli; hanno un triplice vantaggio:

costi contenuti

permettono preparazione di terreni standardizzati (senza errori nelle pesate ripetitività dei risultati )

lunga conservazione

- Classificazione in bas