Medicina molecolare

Medicina molecolare e biotecnologie mediche anno 2019-2020

Appunti delle lezioni della prof. Foti, Cerrito, Bianchi. Esame orale in italiano esame con ogni docente →

• Molecular and cellular immunology Abbas
• Robbins e Cotran, pathological bases of the disease più importante →

Immunità distrettuale

Con questo termine intendiamo andare ad approfondire cosa succede nei distretti, specialmente il distretto mucosale e nei tessuti che vengono identificati come siti con un immunoprivilegio ovvero siti in cui il sistema immunitario è regolato in modo che non funzioni in maniera scorretta (es. cervello).

Meccanismi generali

Durante l’evoluzione il sistema immunitario ha sviluppato delle modalità di funzionamento che sono tipiche di alcuni distretti dell’organismo, il sistema si è sviluppato per rispondere alle esigenze dei distretti. Se andiamo ad analizzare i maggiori distretti mucosali comprendiamo che in questi distretti il sistema si è sviluppato in maniera specifica. In questi distretti si entra in contatto con dei patogeni, ma non deve sempre svilupparsi una risposta immunitaria.

• Nell’intestino non si sviluppano risposte agli antigeni che ingeriamo vi deve essere una tolleranza agli antigeni alimentari e bisogna tollerare i commensali, senza privare delle risposte contro i patogeni
• Nel sistema respiratorio si espone a molteplici agenti patogeni, bisogna saper distinguere tra particelle che non devono indurre reazioni
• Sistema cutaneo meccanismi di elevata protezione, ma anche tolleranza del microbioma della pelle.

Si associano delle strutture specifiche anatomiche:

Ciascuna struttura è a sua volta formata da cellule e molecole che hanno sviluppato una funzione specializzata nel tessuto. L’intestino è uno degli organi non linfoidi che possiede il maggior numero di linfociti, quindi sicuramente si sono sviluppati dei meccanismi importanti che spiegano la necessità di avere un così grande numero di leucociti. Le principali funzioni sono:

• Assorbimento
• Difesa

La mucosa intestinale ha delle caratteristiche anatomiche diverse:

• Morbida
• Umida
• Calda

Queste caratteristiche sono ottimali per lo sviluppo dei batteri. Tuttavia, nonostante abbiamo delle strutture specifiche in ciascun distretto possiamo generalizzare e definire una organizzazione comune. In ciascun distretto anatomico troveremo:

• Barriera esterna formata da cellule epiteliali che protegge dall’invasione
• Strato connettivale che contiene molti tipi cellulari in grado di innescare una riposta immunitaria, vi devono essere anche delle cellule che tollerano.
• Vi sono organi linfoidi secondari che possono essere locali (come nel tratto intestinale) oppure distanti (linfonodi). È importante che vi sia drenaggio linfatico.

Barriera epiteliale

Nelle mucose interne si ha un solo strato di epitelio, nella pelle invece si ha un epitelio multistratificato (epidermide). Per entrambi lo strato connettivale contiene le cellule per la risposta adattativa. Ogni sistema distrettuale contiene delle cellule specializzate.

• Cellule di Langerhans pelle →
• Cellule M intestino →
• Linfociti intraepiteliali (TCR con γδ) epiteliale → strato
• Linfociti B
• Innate lymphoid cells (ILCs)
• Linfociti effettori

La maggior parte dei linfociti effettori entrano nel sangue, ma nello specifico quelli generati a livello distrettuale ritornano nello stesso organo (homing specifico), questo non è valido per l’immunità sistemica. MALT = indica la risposta mucosale. La migrazione e la localizzazione delle cellule è controllata e tessuto specifica, è il tessuto che istruisce l’homing leucocitario. La maggior parte della immunità distrettuale deve essere finemente regolata, esistono dei meccanismi regolatori che prevengono reazioni avverse ad esempio ad agenti non patogeni. Sono dei meccanismi attivi.

Tratto gastrointestinale

Il tratto GI è uno degli organi maggiormente esposto agli antigeni esterni, la sua funzionalità deve essere multipla poiché si è sviluppato per l’assorbimento dei nutrienti, ma allo stesso tempo deve fungere da barriera, deve bilanciare un’attività attiva con una regolativa. Tutto è garantito da una struttura cellulare e d’organo che si è sviluppato per fungere più funzioni.

• L’esofago funge da barriera e facilita l’ingresso del cibo

La funzionalità aumenta in modo progressivo, questo si rispecchia con una induzione di diversi tipi cellulari.

Organizzazione del sistema immunitario nel IG

Il lume intestinale va considerata come una parte del sistema poiché i commensali presenti nel lume svolgono un’azione difensiva.

• Lume intestinale muco + batteri →
• Epitelio mucosale formato da un unico strato di cellule epiteliali
• Tessuto connettivale lamina propria che contiene le cellule effettrici e generatrici
• Vasi linfatici collegati ai linfonodi

I linfonodi mesenterici sono i linfonodi più vicini che inducono una risposta distale, vi sono anche delle strutture locali in cui avviene l’attivazione immunitaria placche del Peyer →. La struttura del tratto GI è villare e quindi si ha una superficie molto elevata.

Il sistema immunitario mucosale può essere diviso in un braccio effettore e uno induttore. Il braccio effettore è quello che identifica le cellule pronte alla risposta:

• Fagociti
• Linfociti T citotossici
• Cellule B plasmacellule →
• Cellule T helper che interagiscono con le cellule B e i linfociti T per generare i linfociti T citotossici

Il braccio induttore vede una differenza rispetto agli altri distretti, le risposte effettrici non vengono indotte solo nei linfonodi mesenterici che sono strutture organizzate. Nel tratto GI troviamo delle strutture linfoidi specializzate:

• Placche del Peyer intestino piccolo →
• Pacche simili nel retto
• ILF (follicoli linfoidi isolati)
• Criptoplacche sono delle cellule linfoidi isolate che iniziano ad aggregarsi e si pensa siano i precursori dei follicoli linfoidi →

Sono strutture linfoidi che formano aggregati si definiscono follicoli, ma se anche non si aggregano sono organi linfoidi.

Immunità innata nel GI

Le cellule dell’epitelio intestinale sono considerate cellule innate:

• Peptidi antimicrobici
• Riconoscimento dei patogeni attraversi i Toll-like receptors e i recettori NOD
• Microbioma intestinale svolge una funzione innata
• Leucociti del sistema immunitario

L’immunità innata usa 3 meccanismi di prevenzione:

• Strato ampio di muco
• Peptidi antimicrobici
• Presenza di IgA prodotte da plasmacellule nelle lamina propria (non vanno nel midollo, ma sono prodotte e si localizzano nel tratto gastrointestinale)

Nel piccolo intestino troviamo la presenza di molti peptidi antimicrobici, nel colon vi sono addirittura due strati di muco, tutti sono caratterizzate da IgA. Vi è un controllo sulla secrezione di muco a seconda del tratto GI. Le cellule epiteliali svolgono una parte attiva, sono formate da vari tipi cellulari, tutte derivano da un progenitore comune che si trova nelle cripte intestinali, nella cripta sono presenti intervallare e cellule epiteliali delle cellule staminali che sono importati poiché vanno a rigenerare il tessuto epiteliale in caso di danno.

• Cellule caliciformi localizzare nella parte più alta del villo secernono muco →
• Cellule M, si trovano in prossimità delle placche del Peyer, vi è una posizione strutturale che facilita la cattura dell’antigene
• Cellule di Paneth, si trovano vicino alla cripta producono i peptidi antimicrobici, non sono le uniche cellule in gradi di produrli, ma sono quelle deputate alla produzione in grande quantità →

Tutte queste cellule contribuiscono in maniera diversa alla formazione della mucosa, alcune di queste cellule insieme alle cellule presenti nella lamina propria sono in grado di riconoscere gli antigeni attraverso i PRR e quindi scatenare una infiammazione.

Regolazione

La regolazione avviene a diversi livelli. La proliferazione, il mantenimento di queste cellule epiteliali viene regolato da una nicchia staminale locale alla base della cripta. Le cellule epiteliali hanno una funzione secretoria, ma anche di assorbimento. La secrezione luminare è mediata dalle cellule caliciformi e di paneth che secernono mucine e peptidi antimicrobici, si forma una barriera fisica e chimica. Questo serve per mantenere una distanza tra le cellule del sistema immunitario e i microorganismi che si trovano nel lume. Possiamo descrivere una componente extracellulare e una intracellulare.

• Mucina famiglia di proteine che sono fortemente glicosilate e che vengono prodotte dalle cellule caliciformi sotto forma di aggregati, creano una barriera fisica fermando l’interazione con sostanze che possono generare danno →

Vi è uno strato di fluido subito sopra le cellule epiteliali che protegge dai flussi che vi sono nel lume, questo fluido ha a che una funzione protettiva e serve anche a permetter la diffusione delle sostanze a bassa velocità. Il complesso giunzionale apicale tiene fuse le cellule epiteliali tra di loro, questa deve facilitare l’ingresso delle sostanze da assorbire limitando le sostanze dannose tight junction →

A supporto di queste giunzioni vi sono degli anelli di actina e miosina. Le giunzioni strette a livello apicale sono formate da claudina e occludina. A livello delle giunzioni di aderenza vi sono proteine diverse: e-caderina che interagisce con proteine della cellula adiacente (β-catenina). Vi sono degli anelli di actina e miosina perifunzionali. La proteina ZO1 permette la formazione della tight junction. Il primo strato protettivo di muco è formato dalla mucina 2, poi abbiamo il fattore trifoglio (TFF), questo fattore è prodotto insieme alle mucine dalle cellule caliciformi, si sa che in assenza di TFF si perde la barriera epiteliale, si pensa abbia una funzione nella migrazione e riparazione degli epiteli. Abbiamo nello strato mucosale le IgA e i peptidi antimicrobici.

Quando siamo di fronte a un patogeno che ha superato la barriera si scatena una riposta citochinica sia da parte delle citochine primarie che secondarie, queste agiscono direttamente su dei fattori di trascrizione che attivano le mucine, i promotori di questi geni sono controllati da queste citochine. Vi è una differenza tra il muco dell’intestine e quello del colon dove si trovano 2 strati differenti. Nel piccolo intestino si ha il controllo da parte del gene mucina 2, invece la mucina che controlla lo strato dello stomaco è muc5ac che da una composizione diversa rispetto a quella ritrovata nel colon. Le cellule caliciformi producono mucina in modo costitutivo, il muco viene continuamente prodotto in modo che questa barriera sia sempre presente, in una situazione infiammatoria si ha un aumento della produzione basale in seguito ad attivazione delle citochine (IL-1, IL-4, IL-6, IL-9, IL-13, TNFα and IFNα).

Famiglia delle defensine

Sono una varietà di geni famiglia delle defensine. Si legano alla membrana batterica causando la formazione di pori che causano la morte del batterio →

• Alfa defensine (1-6, 5-6 nell’intestino piccolo)
• Beta defensine (da 1 a 4) nel colon

HBD1 localizzazioni multiple o HDB2 up-regolato durante gli stati infiammatorio HBD3 esofago e cavità orale o HBD4 antro gastrico o - Catelicidine: IL-37 viene prodotta in risposta ad un motivo CpG presenti nei DNA batterici. Sono stati caratterizzati dei peptidi specifici per alcuni patogeni:

• Alfa defensina contro la salmonella (difettiva nella malattia di Crohn)
• Criptidina 4 contro E.Coli

Questi peptidi antimicrobici sono delle molecole molto piccole (18-45 aa), hanno diverse funzioni:

• Difesa contro i patogeni
• Selezionano il microbiota resistente alla loro attività
• Proteggono le stem cells le cellule di Paneth sono nella cripta dove sono presenti anche le cellule staminali.

Le defensine sono prodotte dalle cellule di Paneth, ma anche dai neutrofili che arrivano nella zona dove vi è l’infezione, i neutrofili contengono dei granuli con i peptidi antimicrobici, soprattutto alfa defensine che sono importanti perché consentono una difesa efficace a livello intestinale. Difetti nella produzione di defensine sono stati individuati in pazienti affetti da morbo di Crohn, non si sa se il difetto nella produzione di defensine sia responsabile dell’insorgenza della malattia o sia una conseguenza con defensine esogene migliora la sintomatologia. → terapia

Le cellule di Paneth e le cellule epiteliali producono una lectina di tipo C chiamata REGIII che inibisce la crescita batterica, gli altri peptidi si inseriscono nella membrana del batterio e la distruggono, REGIII invece agisce sulla crescita batterica sulla superficie cellulare.

Riconoscimento

Il riconoscimento dei moo e delle molecole avviene principalmente tramite i Toll-like receptors e NOD-like receptors. Nell’intestino tutti i patogeni sono riconosciuti grazie ai PRR, a livello del tratto gastrointestinale è ad opera di una sotto classe di PRR che riconosce:

• Lipopolisaccaride
• Flagellina
• DNA e RNA

Vi sono 3 famiglie:

• TLR toll-like receptors →
• NLR NOD-like receptors →
• RIG-1 retinoic acid-inducible gene I →

I TLR devono permettere all’epitelio di misurare e identificare i batteri presenti, devono inoltre segnalare la presenza di danni e hanno una funzione di regolazione della barriera.

Sensing

Normalmente i recettori espressi sulla barriera (TLR) sono pochi, le cellule epiteliali sono cellule polarizzate, quindi i recettori si posizionano nella porzione baso-laterale.

• TLR2 e 4 sono poco espressi
• TLR3 è abbondante nell’intestino piccolo e nel colon
• TLR5 nel colon

Vi è un controllo dei livelli di espressione e della localizzazione di questi recettori, vi è una espressione differenziale a livello dei vari tratti, ma anche a seconda dei tipi cellulari.

• TLR2 e TLR9 sono presenti nella membrana apicale vicino alle cellule M che sono le cellule più esposte all’interazione con i moo
• TLR1, TLR6, TLR7 non sono espressi
• TLR8 è presente nelle cripte (normalmente in un epitelio intatto non è espresso, ma nelle malattie croniche intestinali sono espressi)
• TLR3,4,5 sono espressi baso lateralmente, quindi se l’epitelio è intatto i batteri non vengono visti, se vi è un danno invece il TLR viene esposto ed attivato.

Il controllo da parte di questi recettori avviene a livello spaziale

• TLR4 a seconda delle regioni è espresso a livello apicale in patologie intestinali
• TLR5 produce citochine e chemochine, questa riposta si ha solo quando la flagellina interagisce con il recettore.

L’espressione intracellulare di TLR4: TLR4 si attiva quando riconosce l’LPS unitamente al legame del lipopolisaccaride con MD2 formando un complesso che innesca la cascata del segnale. Vi sono delle citochine (IFN alfa e TNF) che aumentano la trascrizione di questi recettori, quindi se un patogeno invade la regione questo causa una riposta infiammatoria che a sua volta aumenta la produzione del recettore. IL-4 e 13 diminuiscono la risposta di questi recettori.

Vengono attivati dai regolatori negativi del TLR:

• ToLLIP (toll-interacting protein) regola TLR2 e TLR4, i pazienti con malattie croniche non sono in grado di attuare questa regolazione
• SIGIRR (single immunoglobulin IL-1R-related molecule) è un regolatore negativo del recettore per IL1, IL33R, TLR4 e TLR9, quando si creano delle mutazioni in questi geni si nota che l’individuo diventa suscettibile a infiammazione cronica intestinale.

Regolazione proliferazione epiteli

TLR hanno un ruolo di attivazione della funzione infiammatoria, ma sono attivati anche in seguito a danno. La maggior parte dei TLR sono localizzati baso lateralmente, un danno causa esposizione dei recettori, una volta attivati dai batteri si attiva una cascata che porta alla proliferazione delle cellule epiteliali, il sensing del TLR porta ad una proliferazione delle cellule staminali alla base della cripta e si ha la sovra espressione del EGFR, l’interazione con il TLR porta alla produzione di prostaglandine che inducono proliferazione. Quindi insieme all’attività infiammatoria viene attivata anche un’attività riparativa. La prostaglandina di tipo 2 va ad aumentare l’attività delle cellule staminali che quindi si attivano:

• Attivazione differenziamento
• Migrazione
• Produzione di cellule staminali

Nel tratto gastrointestinale i TLR hanno una espressione ristretta in alcuni dipartimenti ed alcuni non sono proprio espressi, questo è un vantaggio perché consente un controllo sulle risposte immunitarie. Una volta attivati i TLR si attiva la cascata che porta alla produzione di citochine. Nell’intestino la segnalazione attraverso i TLR attiva il processo di riparazione. Quando avviene un danno di una certa intensità che porta alla morte delle cellule epiteliali, come avviene ad esempio nei malati con malattie croniche intestinali, i commensali e i loro prodotti possono entrare all’interno dell’intestino, una volta entrati, siccome i TLR sono espressi sulla parte basolaterale, questi possono sentire l’ingresso dei moo. Da una parte questo porta all’attivazione della risposta infiammatoria, ma allo stesso tempo porta alla stimolazione della via delle ciclossigenasi e le cellule incominciano a produrre prostaglandina 2. Nelle cellule della cripta l’attivazione di TLR4 porta alla produzione di ligandi per il recettore del EGFR inducendo proliferazione. L’attivazione delle COXs avviene anche nella lamina propria.