Lezioni, Biochimica Clinica

Università degli Studi del Sannio

Facoltà di Scienze MM.FF.NN.

Laurea in Biotecnologie

Biochimica Clinica

Prof. Frieri

Biochimica clinica

La biochimica clinica studia i marcatori biochimici elaborati dall’organismo (enzimi, metaboliti, cellule, ecc.) allo scopo di determinare lo stato di salute utilizzando test o esami diagnostici. Il 60–70% delle diagnosi mediche è basato sui risultati elaborati nei Laboratori di patologia clinica, che attraverso competenze mediche e tecniche forniscono informazioni clinicamente utili.

Il medico di Laboratorio conduce le sue indagini prevalentemente su campioni biologici prelevati dal paziente, fornendo infine un referto in cui sono riportati i valori di riferimento, accompagnato da un commento interpretativo. Quindi un referto è il risultato di un esame di laboratorio che fornisce informazioni cliniche utili per la cura del paziente ed è valido quando corrisponde correttamente al quesito clinico.

Medicina di laboratorio

La finalità della medicina di Laboratorio è quella di fornire informazioni che, unite ad altri dati raccolti dal clinico, consentano di formulare una diagnosi con la più alta probabilità statistica, aiutando il clinico nella scelta di una decisione, sia diagnostica che terapeutica. Su questi dati vengono elaborate delle informazioni da utilizzare per scopi preventivi, diagnostici, terapeutici o di monitoraggio.

L’intero processo parte dal dato di Laboratorio e attraverso la sua trasformazione in informazione produce una nuova conoscenza al fine di facilitare le decisioni mediche ed intervenire efficacemente. Due sono le condizioni per raggiungere tale scopo: la prima è che il laboratorio elabori un risultato esatto, la seconda è che il clinico sappia interpretarlo. Quindi è indispensabile la collaborazione tra clinici e staff di laboratorio.

Un Laboratorio medico si differenzia da quelli chimici e biologici perché fornisce informazioni clinicamente utili ed efficaci che influenzano l’80% delle diagnosi mediche. Un’informazione utile ed efficace è caratterizzata da: validazione, sicurezza, appropriatezza e convenienza.

Validazione

La validazione è un processo di verifica della “validità” del risultato e del referto. In questo caso il risultato dell’esame di laboratorio non riporta semplicemente i risultati ottenuti con l’analisi chimica, fisica e biologica del campione, ma al contrario è frutto di un processo che inizia dai sintomi clinici del paziente/utente e si conclude con un referto che ha validità di consulenza specialistica. Esistono tre livelli di validazione:

• Livello analitico (misura): fase analitica in cui avviene la verifica tecnica del dato ottenuto e il controllo di qualità;
• Livello biologico (risultato): fase post-analitica in cui avviene la valutazione del dato ottenuto alla luce della variabilità intra ed inter individuale;
• Livello medico (referto): in cui si valuta il risultato in funzione della malattia del paziente.

Sicurezza

Il paziente deve essere sicuro che gli accertamenti diagnostici siano eseguiti con perizia e professionalità. La sicurezza si divide in:

• Sicurezza del risultato: qualità analitica;
• Sicurezza del processo: qualità del “total testing process”;
• Sicurezza dell’esito: appropriatezza ed efficacia.

Appropriatezza

Un test appropriato è quello in cui il risultato fornisce una risposta adeguata alla questione, grazie alla quale si può prendere una decisione ed intraprendere un’azione che porta ad un beneficio di salute per il paziente (definizione di Price).

Convenienza

Per “conveniente” si intende quella informazione comprensibile e tempestiva che sia disponibile per il paziente “giusto” nella collocazione clinica “giusta”. Quindi garantire al paziente equità di accesso e intensità di risposta in rapporto al problema clinico sia per gli utenti ambulatoriali e sia per i pazienti ospedalieri.

Fasi organizzative per informazioni utili ed efficaci

Le informazioni per essere utili ed efficaci devono essere scambiate seguendo tre fasi organizzative:

• Fase pre-analitica: selezione dell’esame, richiesta dell’esame, raccolta del campione, identificazione, trasporto e preparazione;
• Fase analitica: avviene l’analisi del campione;
• Fase post-analitica: refertazione e l’interpretazione.

La difficoltà del laboratorio di oggi non è quella di acquisire molti dati, ma quella di acquisire dati utili e di saperli interpretare in modo da renderli efficaci per il processo diagnostico/decisionale. Nel nostro paese, contrariamente a quanto avviene per i farmaci, non vi è alcuna limitazione alla prescrizione di test diagnostici o esami di laboratorio; esiste solo una forma di disincentivazione indiretta, legata alla presenza di ticket sanitari: fare test inutili è eticamente e scientificamente scorretto.

Organizzazione di un laboratorio di analisi

Il Laboratorio Clinico negli anni '50 era parte integrante della medicina e non esistevano i laboratoristi. Successivamente, con l’automazione meccanica, il laboratorio ha fatto un salto di qualità trasferendosi in locali adeguati con la presenza di personale specialistico, proveniente da diverse formazioni culturali (medici, biologi, chimici, biotecnologici) che hanno portato ad una forte settorializzazione. Nel tempo poi è nato il “sistema informatico” che ha dato origine ad attrezzature integrate e modulari, le quali restituiscono molteplici risultati, riducendo così i tempi d’attesa, i campioni e il personale (il test è eseguito con meno strumenti ad un costo ridotto).

Soluzione informatiche

• L.I.S. Sistema Informatico di Laboratorio: scambia informazioni e dati di tipo gestionale relativi al paziente;
• L.A.S. Sistema di Automazione in Laboratorio: coordina attività strumentali pre-analitiche ed analitiche senza l’intervento di operatori;
• H.I.S. Sistema Informatico Ospedaliero: la rete del sistema è organizzata in settori detti “ambulatori”.

Come effettuare un test diagnostico

La prima tecnica di laboratorio è stata la tecnica colorimetrica, ossia un esame quantitativo che, mediante una serie di reagenti e una fonte di luce, fa sviluppare una colorazione la cui intensità rivela la concentrazione del campione (ogni colore ha diverse lunghezze d’onda). La luce bianca si può scomporre nei diversi colori determinando lo spettro: la luce rossa ha le massime lunghezze d’onda e la luce viola le minime. I raggi più corti della luce viola hanno quasi il doppio dell’energia dei raggi più lunghi della luce rossa. Se un raggio di luce è assorbito da un corpo, la luce riflessa, rifratta o trasmessa assume il colore complementare alla luce assorbita. Facendo incidere una luce bianca (policromatica) su di una sostanza, questa avrà la possibilità di assorbire una parte compresa in una certa lunghezza d’onda, rinviando tutte le altre radiazioni incidenti. L’insieme delle radiazioni respinte determina il colore della sostanza. Lo spettro di assorbimento di una sostanza, quindi, sono le radiazioni che questa è capace di assorbire ed equivale all’intensità del suo colore.

Lo spettrofotometro è una macchina ottica che misura la quantità di energia luminosa emessa da una sostanza colpita da radiazioni luminose di diversa lunghezza d’onda. Oltre che determinare gli spettri di assorbimento di una sostanza ne misura anche la concentrazione. Più la sostanza è concentrata e più è capace di assorbire radiazioni e meno le trasmette. Siccome non c’è modifica del raggio luminoso, se una sostanza assorbe molto trasmette poco.

Trasmittanza: rapporto tra l’energia della luce trasmessa e la luce incidente.

Assorbanza: logaritmo decimale dell'inverso della trasmittanza.

Legge di Lambert & Beer

L’assorbanza è in relazione lineare con la concentrazione di un campione per concentrazioni sufficientemente basse secondo la legge di Lambert & Beer. La soluzione di una sostanza assorbente è confrontata con una soluzione di riferimento che ha un’assorbanza pari a 0 e una trasmittanza del 100%.

Secondo la legge di Lambert & Beer vi è l’attenuazione della luce quando passa attraverso una soluzione.

• Legge di Lambert: l’assorbanza è direttamente proporzionale allo spessore della sostanza che assorbe la radiazione;
• Legge di Beer: l’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione della soluzione che assorbe.

Se una radiazione monocromatica passa attraverso una soluzione, l’assorbanza subita dalla radiazione è direttamente proporzionale allo spessore e alla concentrazione della sostanza stessa: A = abc

• a = coefficiente di estinzione molare che corrisponde all’assorbanza di una soluzione quando lo spessore esaminato è di 1 cm (è una costante specifica per ogni sostanza);
• b = spessore di strato misurato in cm;
• c = concentrazione misurata della sostanza.

Combinando le due leggi si ottiene: Abs = I Cε

• C = concentrazione;
• ε = coefficiente di estinzione o di assorbanza molare che dipende dalla lunghezza d’onda della luce, dalla sostanza che assorbe e dal mezzo in cui è disciolta;
• I = lunghezza del cammino ottico.

Il fenomeno di assorbimento della luce da parte di una soluzione dipende esclusivamente dal numero delle molecole della sostanza disciolta. Perciò maggiore è il numero delle molecole che il raggio incontra sul suo cammino, maggiore è l’assorbimento subito dalla radiazione.

Fotometria di fiamma (in emissione o in assorbimento)

Fornendo energia all’atomo è possibile far saltare un elettrone da un livello ad un altro superiore, per cui l’atomo passa dallo stato fondamentale a quello eccitato. L’elettrone instabile tende a ritornare all’orbitale di partenza emettendo un quanto di energia radiante (fotone) con una ben determinata frequenza (v), definita dall’intervallo energetico fra i due livelli di transizione:

Legge di Planck: E = hv

L’isotopo radioattivo è un atomo con uno squilibrio tra elettroni e protoni che emette radiazioni se riceve energia poiché i suoi elettroni non riescono a saltare da un’orbita all’altra.

Qualità analitica

Il controllo di qualità costituisce un monitoraggio della precisione e dell’accuratezza dei metodi analitici. Compito del laboratorio, quindi, è di fornire risultati attendibili. Con il termine di attendibilità si indica la qualità che caratterizza in modo globale un risultato analitico. Un’analisi clinica è un procedimento metrologico che ha lo scopo di fornire una stima di una grandezza, in un campione, della quale esiste un valore vero sconosciuto. Tuttavia però esiste una criticità legata ad un’analisi clinica, causata da due variabili: analitica e biologica:

• La variabilità analitica dipende dalla precisione e dall’esattezza;
• La variabilità biologica indica una variazione dei dati analitici nello stesso individuo (interindividuale) o tra individui diversi (intraindividuale).

Queste variabilità si riferiscono ad una popolazione sana da cui si estraggono valori normali o intervalli di riferimento sui quali si confrontano i dati.

Si è visto che se si prelevano in occasioni ripetute campioni di sangue dal medesimo paziente, in condizioni di assoluta stabilità di salute e normalizzando al massimo le condizioni di prelievo, le concentrazioni dei differenti componenti biochimici non hanno sempre lo stesso valore. Questo fenomeno è il risultato di un equilibrio dinamico, il cui valore di concentrazione all’equilibrio è denominato “punto omeostatico” ed è determinato dal bilanciamento di quanto un componente biologico “entra” ed “esce” dal torrente circolatorio.

Le variabilità biologiche sono grandezze misurabili mediante l’applicazione di opportuni protocolli sperimentali, ad esempio considerando le caratteristiche biologiche non modificabili dell’individuo e della specie considerata. Ad esempio:

• La variabilità intraindividuale del colesterolo è del 6%;
• Il colesterolo misurato in un individuo è di 220 mg/dl;
• Il risultato potrà oscillare mediamente tra:
  • 220 + 6% = 220 + 13,2 = 233,2
  • 220 – 6% = 220 – 13,2 = 206,2

Sperimentalmente si è visto che eseguendo misure singole e ripetute di un determinato analita in un paziente o ripetute sullo stesso campione, di cui ne conosciamo la concentrazione vera, i risultati che si ottengono non sono sempre identici, ma si discostano più o meno dal valore teorico. Tale scostamento è l’errore totale della singola misura (Et) esprimibile come: Et = (stima) – (valore vero). Un metodo “attendibile” fornirà stime assai vicine al valore vero.

Due sono gli errori riscontrabili: imprecisione ed inesattezza; all’imprecisione fanno parte gli errori casuali (quando vi è una notevole dispersione dei dati), mentre all’inesattezza appartengono gli errori sistematici (i risultati sono sistematicamente superiori o inferiori al valore vero).

Controllo di qualità

Per controllo di qualità si intende lo studio di quegli errori che rientrano nella responsabilità del laboratorio e delle procedure utilizzate per riconoscerli e minimizzarli. Questo è un passaggio fondamentale per ottenere un’analisi precisa ed accurata. Il controllo di qualità può essere:

• Interno (QCI): si utilizza al fine di monitorare la precisione dei metodi analitici utilizzati e per assicurare l’attendibilità dei risultati ottenuti;
• Esterno (VEQ): si utilizza al fine di valutare l’efficienza del laboratorio in relazione ad altri, attraverso un siero di controllo sconosciuto che passa in esame nei diversi laboratori. È finalizzato a migliorare le prestazioni, la cura e la sicurezza dei pazienti.

Deviazione standard (ds): zona di confidenza all’interno della quale il valore è attendibile (attendibilità = 2ds). Oltre questa zona c’è la zona di azione in cui il risultato è sballato poiché supera il traguardo analitico di precisione. Dunque si deve bloccare il lavoro e modificare il metodo.

\(x1 – x) ^2\

Σn – 1 somma dei quadrati delle differenze tra misure e valore medio / n° misure – 1;

Performance diagnostica

Il termine sensibilità diagnostica o clinica (positività della malattia) è impiegato per indicare la frequenza di risposte positive che si ottengono applicando l’esame a pazienti affetti dalla malattia. Il concetto di sensibilità è quindi assimilabile a quello di positività dell’esame in presenza di malattia o di potenza diagnostica dell’esame espresso in percentuale:

Sensibilità = (Veri Positivi x 100) / (Veri Positivi + Falsi Negativi) (totale malati)

Il termine specificità diagnostica o clinica (o negatività nello stato di salute) è impiegato per indicare la frequenza di risposte negative che si ottengono applicando l’esame a pazienti non portatori della malattia. Il concetto di specificità è quindi assimilabile a quello di negatività nello stato di salute espresso in percentuale:

Specificità = (Veri Negativi x 100) / (Veri Negativi + Falsi Positivi) (totale malati)

Sensibilità e specificità sono inversamente correlate, tanto che all’aumentare della sensibilità pochi “malati” sfuggono alla diagnosi a scapito però della specificità che diminuisce con la conseguenza che si considerano “malati” anche soggetti sani; viceversa aumentando la specificità il risultato è positivo quasi solamente per i soggetti “malati”, a scapito però della sensibilità in quanto si considerano “sani” anche soggetti malati. In base alla sensibilità e alla specificità dell’esame si determina il livello discriminante o valore soglia: CUT/OFF.

Diabete (iperglicemia)

Per l’organismo è importante che la glicemia (ossia il livello di glucosio nel sangue) sia costante, poiché il SNC ha costantemente bisogno di zuccheri. In condizioni di sazietà dal pancreas viene secreta insulina, la quale ha un effetto ipoglucemizzante e permette l’assorbimento di glucosio nei tessuti, stimolando:

• Ossidazione del glucosio;
• Sintesi del glicogeno;
• Sintesi dei lipidi.

In condizioni di digiuno, invece, prevale il glucagone che ha un effetto iperglucemizzante e stimola:

• Glicogenolisi;
• Chetogenesi;
• Gluconeogenesi.

Il pancreas endocrino produce l’insulina ed il glucagone che hanno un ruolo fondamentale nel regolare l’omeostasi delle sostanze nutritive, sia nel periodo di alimentazione che di digiuno. L’insulina è secreta principalmente in risposta ad un aumento del livello ematico di glucosio; il glucagone, invece, è secreto in risposta ad un calo del livello ematico di glucosio.

Insulina: l’insulina è sintetizzata quindi nel pancreas endocrino dalle “Isole di Langherhans”, che rappresentano il 2% della massa totale dell’organo. Nelle isole vi sono tre tipi principali di cellule, specializzate nella sintesi di ormoni diversi:

• Cellule α (glucagone);
• Cellule β (60–80% delle cellule) insulina;
• Cellule δ (somatostatina).