Le piccole GTPasi e molecole regolative

Di queste strutture secondarie ci sono 10 loop di connessione e 5 sono rivolti sullo stesso lato della struttura a

formare il sito attivo, ed abbiamo distinto i loop importanti per il sito attivo e sono:

G1: è presente il loop P ed è identico in tutti i domini che legano i nucleotidi legando i fosfati α e β dei

nucleotidi;

G2 e G3: all’interno di questi loop ci sono piccole regioni che vengono chiamati switch I e II importante per

ɣ

il legame con il Fosfato in ed il Mg e poiché queste sono le regioni importanti l’interazione con il fosfati

queste subisco la modifica conformazionale tra lo stato in cui la proteina lega il GTP e quella che lega il

ɣ

GDP infatti l’unica differenza tra le due strutture è la presenza o assenza del fofato in . Il taglio di questo

fosfato porta al rilascio di questi due loop che prima erano costretti in una posizione ferma dalla necessità di

legare il fosfato tramite legami H in modo altamente direzionale;

G4 e G5: loop che permette l’interazione con la base Guaninica del nucleotide quindi è responsabile del

legame specifico rendendo possibile la distinzione di una Guanina dagli altri nuceotidi.

Queste strutture presentano sequenze altamente conservate, infatti questa sequenza, GXXXXGKS/T (dove la

X sta per un amminoacido generico G per Glicina, K Lisina, S Serina e T Treonina) è presente in tutti i

Ploop. Lo switch I contiene una Treonina altamente conservata. La specificità per la Guanina nel dominio G

è dovuta ad una lato della catena di Aspartame (Asp, dal motivo DXXG ed è so switch II), il quale forma un

doppio legame H con la base, e attraverso un interazione con la catena principale di un invariante Alanina

146

(Ala , dal motivo SAK), con l’O della Guanina la quale per ragioni steriche non tollererebbe il gruppo

Amminico dell’Adenina.

Queste sequenze conservate sono importanti per il corretto svolgimento delle funzioni di queste proteine

infetti mutazioni di queste sequenze in proteine come Ras possono causare il suo mantenimento nella sua

conformazione attiva diventando un oncogene. In realtà l’attitività catalitica è una condizione necessaria ma

non sufficiente perché Ras per essere attivo, non deve essere legato al GTP ma è importante anche la sua

collocazione di membrana, infatti se si inibisce la sua collocazione sulla MP, Ras anche se lega il GTP è

inattivo. Molti farmaci antitumorali che contrastano l’attività di Ras agiscono sulla sua localizzazione

impedendo per esempio la farnesilazione o le varie modificazione post traduttive di Ras. Sono importanti due

modifiche post traduttive, l’aggiunta di un farnesile e la palmitolazione, (quest’ultima non è sempre presente

perché nell’isoforme di RAS 4b non c’è necessità della palmitolazione poiché è presenta una sequenza carica

positivamente).

Ci sono diverse piccole proteine GTPasi che hanno funzioni diverse capaci di indurre la catalisi in tempi

diversi (questo perché proteine diverse sono attivi in tempi diversi), inoltre queste proteine possono essere

fortemente regolate, e questa ulteriore modulazione avviene attraverso proteine regolative. Ci sono tre tipi di

proteine regolative con capacità diversa:

1) GAP (aumenta la velocità di idrolisi del GTP in GDP)

2) GEF (aumenta la velocità di dissociazione) Queste due proteine regolano la velocità di

3) GDI (diminuisce la velocità di dissociazione) dissociazione del GDP

Proteine GAP:

Tutte queste proteine sono composte da più domini, infatti posseggono un dominio specifico che ne

garantisce la funzione, per esempio che permette la catalisi del GPT, e domini che permettono le interazioni

proteina-proteina. Un esempio è la p120 GAP, una delle GAP più caratterizzate, che presenta un dominio

SH2 un dominio SH3 un dominio PH un dominio per il legame con il Ca ed un dominio GAP, e questi

domini gli permettono l’interazione con le proteine. Questo interazione è importante perché la proteina GAP

ha la capacità di indurre un aumento della velocità d’inattivazione della proteina GTPasica, quindi questa

proteina deve essere attivata nel momento in cui si vuole bloccare il segnale. Un segnale esterno è il

responsabile dell’attivazione di una proteina recettrice che agirà su GAP permettendo la sua azione,

bloccando l’azione di una proteina (GTPasica).

(Le strutture delle GAPs per le varie sub-famiglie delle GNBPs sono differenti).

La reazione di idrolisi del GTP avviene mediante l’azione di una molecola di H O che reagisce con il fosfato

2

ɣ

in , e questo ne induce il suo rilascio formando il GDP. Questa reazione può avvenire spontaneamente, in

realtà questo è un processo molto lenta, e solo attraverso l’azione di un enzima, che crea un nucleofilo forte

(l’acqua non lo è) riesce a velocizzare la reazione. Quindi il primo step è la formazione di un nucleofilo forte

-

e questo si forma grazie all’enzima che sottrae un protone all’acqua formando OH che può attaccare il

ɣ

fosfato in . L’azione dell’OH forma una struttura pentavalente, dato che il Fosforo forma 5 legami invece

che 4 poiché oltre ai 4 Ossigeni già presenti legherà un 5 Ossigeno del gruppo OH. Questo composto

pentavalente formato dal fosforo è altamente stabile dovuto alla presenza di una carica negativa molto forte,

e l’enzima ha la funzione di stabilizzare questo stadio di transizione, e questo avviene schermando le cariche

negative con cariche positive. I residui catalitici sono una Glutammina, presente nello switch II, questo

amminoacido ha la capacità di sottrarre il protone all’ H O, creando il nucleofilo. L’intermedio pentavalente

2

è schermato dalla Treonina 177, che lega il fosfato attivato, ed un’Arginina. Questa Arginina nella subunità α

della proteina G è presente nel dominio ad α-elica del coperchio. Nel Ras è assente il dominio ad α-elica e la

conseguenza è l’assenza di questa Arginina, che rende molto bassa la velocità di idrolisi di Ras. Questo

residuo di Arginina è fondamentale per la stabilizzazione del’intermedio pentavalente. Questo non significa

che il dominio GTPasico di Ras non è indipendente e quindi non è capace di idrolizzare, ma che la sua

efficienza è molto bassa e necessita la presenza di questa Arginina. GAP, avente questo amminoacido si

posiziona sopra il dominio GTPasico, in una posizione molto simile al coperchio ad α eliche della proteina G

e fornisce in trans questo residui necessario alla catalisi. La funzione di GAP è proprio quella di fornire

questa Arginina. In questa figura è mostrato l’azione di GAP su altre proteina che presentano un dominio

GTPasico, in giallo è rappresentato Ras, in

rosso Rho, in ciano il complesso Rac-Exos

ed in magenta Gα-RGS. L’acqua catalitica è

segnalata con la lettera “W” in rosso. I

residui Tirosina, Glutammina e Arginina

sono costanti in tutte le proteine questo

perché sono fondamentali per la riuscita

della catalisi.

N.B: Come Ras che presenta Gap per

velocizzare la reazione catalitica, anche le

Gα presentano dei regolatori simili alle Gap,

queste hanno come unica funzione la

stabilizzazione della Glutammina della

subunità α delle proteine G trimeriche.

Queste proteine accessorie sono dette RGS

(es: RGS4).

La figura qui sotto mette a confronto le reazioni di idrolisi del GTP da parte della subunità α della proteina

trimerica G e delle piccole GTPasi (Ras, Rho, Rab… ). Quello che si osserva è Il GTP che reagisce con H O

2

a formare uno stato di transizione pentavalente. L’enzima sottrae un protone all’acqua rendendola un buon

nucleofilo e nello stesso momento stabilizzando lo stato di transizione.

Nel primo riquadro è mostrato la subunità α che fornisce l’Arg per stabilizzare lo stato di transizione, mentre

la Glutammina sottrae un protone all’acqua.

Nel secondo riquadro è mostrato l’attività di Ras in grigio mentre Gap in rosso. La reazione è identica ma in

questo caso l’Arg non è di Ras ma è fornita in trans da Gap che si posiziona nello stesso punto del sito attivo

(quindi la posizione di è importante).

Le Gap possono avere strutture tridimensionali differenti quindi non c’è una conservazione di fold però

hanno tutte la stessa funzione quella di fornire Arginina (simula il dominio α delle proteine G). Inoltre Gap

ha la funzione di stabilizzare in maniera corretta la struttura dello switch I e del II (stabilizza la

conformazione attiva della proteina interagendo con gli switch, orientando in modo migliore la Glutammina,

responsabile del meccanismo catalitico).

In pratica Gap velocizza la reazione perché fornisce l’Arg e posiziona la Gln che permette la formazione del

nucleofilo OH.

N.B: Esiste un mutante di Ras che presenta una mutazione sulla Gly12 che rende Ras incapace di interagire

con Gap, quindi questa Glicina è fondamentale per garantire l’interazione fra GAP e Ras. La mutazione di

questo residuo crea una proteina incapace di interagire con Gap quindi si ha una Ras sempre attiva ma con

una lenta velocità di reazione rendendola un oncogene.

Proteina regolativa GEF

Queste proteina permettono il distacco del GDP agevolando in questo modo il legame con il GTP, quindi

hanno la funzione di favorire l’attivazione delle proteine G. Questo è reso possibile poiché GEF stabilizza la

conformazione vuota del Dominio GTPasico.

Le Proteine G possiedono un alta specificità di legame che le rende capaci di discernere tra GTP e gli altri

ribonucleotidi, questo significa che legano in modo estremamente forte il GTP rendendo il suo rilascio

difficoltoso (la forma GDP). La proteina deve essere capace di legare in modo specifico il GTP e nello stesso

tempo essere capace di distaccarsi dal GDP, questo è reso possibile dall’azione di queste proteine accessorie

capaci di alterare il sito di legame rendendo così la proteina incapace di legare il GDP.

Alterazione del sito di legame: alterano la posizione del loop P modificando così lo switch I e II, che sono le

regioni impegnate nel legame con il nucleotide.

La struttura della proteina GEF hanno 2 domini:

1) Dominio DH: è il dominio funzionale, che presenta 3 sequenze conservate CR1; CR2; CR3. E’ costituito

da 10-15 α-eliche.

2) Dominio PH: è un dominio di interazione tra proteine e lipidi (permette la localizzazione sulla

membrana). Ha un fold identico (solo quello il sito di legame è diverso) al dominio PTB, 7 filamenti β

antiparalleli che formano 2 foglietti β a sendwitch ovvero ortogonali l’uno sull’altro.

Questa struttura è un esempio di struttura

tridimensionale del dominio DH-PH che

interagisce con la struttura di Rho GTPasi

(rappresentata in verde con Cdc42, lo switch I). I

due siti di Rho, S1 e S2, interagiscono con le

regioni CR1 e CR3 del dominio DH.

Meccanismo di azione:

CR1: è presente un residuo di Glutammato estremamente conservato, che si lega con una Serina del loop P

impedendo il legame di questa Serina con il Fosfato β. Questa regione interagisce oltre che con il loop P

anche con lo switch I.

Il ruolo di GEF è quello di perturbare il sito di legame tra la proteina G e il nucleotide, causando l’espulsione

del nucleotide GDP dal sito attivo. Per fare questo deve perturbare la posizione dei loop che interagiscono

con il GDP. Vediamo come fa a destabilizzare il sito attivo.

Prima di tutto distrugge il legame tra la proteina G e il Fosfato β (è la sua funzione principale), questo

avviene eliminando il legame tra il loop P ed il Fosfato β, competendo con la Serina del loop P responsabile

dell’interazione con il nucleotide, formando una nuova interazione con un proprio residuo di Glutammato

(Serina-Glutammato).

CR3: interagisce con lo switch II, facendogli assumere una nuova posizione che rende stabile la nuova

posizione che ha assunto il loop P. Queste interazioni sono specifiche e questo rende di conseguenza anche

specifico il legame di specifiche GEF con specifiche GTPasi (sono proprio su CR3 i residui di specificità

delle interazioni). Questo sito occlude inoltre il sito di binding del Magnesio, necessario per la catalisi,

alterando lo switch I facendogli assumere una struttura ordinata.