Le piccole GTPasi e molecole regolative

Nel secondo riquadro è mostrato l’attività di Ras in grigio mentre Gap in rosso. La reazione è identica ma in

questo caso l’Arg non è di Ras ma è fornita in trans da Gap che si posiziona nello stesso punto del sito attivo

(quindi la posizione di è importante).

Le Gap possono avere strutture tridimensionali differenti quindi non c’è una conservazione di fold però

hanno tutte la stessa funzione quella di fornire Arginina (simula il dominio α delle proteine G). Inoltre Gap

ha la funzione di stabilizzare in maniera corretta la struttura dello switch I e del II (stabilizza la

conformazione attiva della proteina interagendo con gli switch, orientando in modo migliore la Glutammina,

responsabile del meccanismo catalitico).

In pratica Gap velocizza la reazione perché fornisce l’Arg e posiziona la Gln che permette la formazione del

nucleofilo OH.

N.B: Esiste un mutante di Ras che presenta una mutazione sulla Gly12 che rende Ras incapace di interagire

con Gap, quindi questa Glicina è fondamentale per garantire l’interazione fra GAP e Ras. La mutazione di

questo residuo crea una proteina incapace di interagire con Gap quindi si ha una Ras sempre attiva ma con

una lenta velocità di reazione rendendola un oncogene.

Proteina regolativa GEF

Queste proteina permettono il distacco del GDP agevolando in questo modo il legame con il GTP, quindi

hanno la funzione di favorire l’attivazione delle proteine G. Questo è reso possibile poiché GEF stabilizza la

conformazione vuota del Dominio GTPasico.

Le Proteine G possiedono un alta specificità di legame che le rende capaci di discernere tra GTP e gli altri

ribonucleotidi, questo significa che legano in modo estremamente forte il GTP rendendo il suo rilascio

difficoltoso (la forma GDP). La proteina deve essere capace di legare in modo specifico il GTP e nello stesso

tempo essere capace di distaccarsi dal GDP, questo è reso possibile dall’azione di queste proteine accessorie

capaci di alterare il sito di legame rendendo così la proteina incapace di legare il GDP.

Alterazione del sito di legame: alterano la posizione del loop P modificando così lo switch I e II, che sono le

regioni impegnate nel legame con il nucleotide.

La struttura della proteina GEF hanno 2 domini:

1) Dominio DH: è il dominio funzionale, che presenta 3 sequenze conservate CR1; CR2; CR3. E’ costituito

da 10-15 α-eliche.

2) Dominio PH: è un dominio di interazione tra proteine e lipidi (permette la localizzazione sulla

membrana). Ha un fold identico (solo quello il sito di legame è diverso) al dominio PTB, 7 filamenti β

antiparalleli che formano 2 foglietti β a sendwitch ovvero ortogonali l’uno sull’altro.

Questa struttura è un esempio di struttura

tridimensionale del dominio DH-PH che

interagisce con la struttura di Rho GTPasi

(rappresentata in verde con Cdc42, lo switch I). I

due siti di Rho, S1 e S2, interagiscono con le

regioni CR1 e CR3 del dominio DH.

Meccanismo di azione:

CR1: è presente un residuo di Glutammato estremamente conservato, che si lega con una Serina del loop P

impedendo il legame di questa Serina con il Fosfato β. Questa regione interagisce oltre che con il loop P

anche con lo switch I.

Il ruolo di GEF è quello di perturbare il sito di legame tra la proteina G e il nucleotide, causando l’espulsione

del nucleotide GDP dal sito attivo. Per fare questo deve perturbare la posizione dei loop che interagiscono

con il GDP. Vediamo come fa a destabilizzare il sito attivo.

Prima di tutto distrugge il legame tra la proteina G e il Fosfato β (è la sua funzione principale), questo

avviene eliminando il legame tra il loop P ed il Fosfato β, competendo con la Serina del loop P responsabile

dell’interazione con il nucleotide, formando una nuova interazione con un proprio residuo di Glutammato

(Serina-Glutammato).

CR3: interagisce con lo switch II, facendogli assumere una nuova posizione che rende stabile la nuova

posizione che ha assunto il loop P. Queste interazioni sono specifiche e questo rende di conseguenza anche

specifico il legame di specifiche GEF con specifiche GTPasi (sono proprio su CR3 i residui di specificità

delle interazioni). Questo sito occlude inoltre il sito di binding del Magnesio, necessario per la catalisi,

alterando lo switch I facendogli assumere una struttura ordinata. Questa figura mostra GEF

che prende contatto con il

sito attivo della proteina G,

ovvero i due switch ed il

loop P centrale,

perturbando il sito di

legame per il GDP.

Le varie proteine GEF non

hanno una stessa struttura

ciò che resta uguale è la

funzione.

Queste interazioni rompono il legame con il GDP permettendone la sua espulsione dal sito attivo. Adesso

sorge un problema ovvero si è creato un interazione stabile tra GEF e la proteina G, e questo potrebbe

rendere difficile il legame di una molecola di GTP. Cosa rende possibile il legame con il GTP:

bisogna tener presente che questa alterazione della struttura impedisce fondamentalmente l’interazione della

proteina con il Fosfato in β, quindi la proteina comunque mantiene la capacità di legare il GNP (la base

azotata e lo zucchero) questo è reso possibile dal loop G4e G5 (questa regione resta identica quindi è in

grado di riconoscere una Guanosina). Quindi la Guanosina (del GTP) interagisce con questi loop inducendo

un cambiamento conformazionale della struttura che comporta il distacco di GEF.

E’ da osservare che nel complesso proteina G-GEF in forma vuota potrebbe entrare sia GTP che GDP, poiché

quello che viene riconosciuto è la base azotata, invece si lega il GTP perché è presente nella cell in quantità

molto più elevate rispetto al GDP, quindi è fortemente favorito perché ha una concentrazione di 10 volte

maggiore. GEF si distacca nel momento in cui si lega il GTP perché riesce a legare solo il complesso

proteina G-GDP, e non quando questa è legata al GTP, (ulteriore meccanismo di controllo per far si che si

leghi il GTP), può discernere questo legame poiché GEF interagisce con la proteina G negli switch, che

modificano la loro struttura in relazione al loro legame con il GTP o GDP.

Tossina del colera, usata molto nei saggi di trasduzione del segnale, provoca ADP-ribosilazione

dell’Arginina di G bloccando l’Arg del sito attivo (dominio α elica proteina G). In questo modo blocca

α

l’attività GTPasica, rendendola incapace di idrolizzare ad alta velocità il GTP, questo rende G sempre attiva.

α

Questo comporta un aumento dell’ AMPc (adenilato ciclasi …) e di conseguenza aumenta l’afflusso di ioni

Na nell’intestino che porta alla morte.

Tossina della bortedella pertossi che determina ADP-ribosilazione della Cys all’estremità C-Term della G α

questo determina l’assenza dell’interazione tra la proteina G e il recettore associato e quindi è impedita

l’attivazione della proteina G.

N.B: nella proteine Gα il distacco del GDP è permesso dall’interazione con il recettore (mentre nelle proteine

G monomeriche questo compito è svolto da GEF). Oltre all’azione del recettore esistono proteine GEF-like

per le Gα che aumentano la velocità di questo processo modulandolo (questa modulazione non avviene nelle

monomeriche necessitano di GEF per effettuare il cambiamento conformazionale).

Dominio PH delle GEF

Il domini PH ha diversi ruoli a seconda della proteina GEF. Si è osservato che in alcuni casi questo dominio

partecipa al legame con il dominio GTPasico, cooperando nella stabilizzazione della conformazione attiva.

La funzione principale resta il riconoscimento e l’ancoraggio della proteina GEF sulla MP, questo è

importante perché Ras è attiva solo quando è ancorata alla MP, (questo garantisce una localizzazione

modulabile poiché riconosce lipidi di membrana modificati (fosforilati). Qui sotto sono mostrati dei

fosfolipidi che presentano delle fosforilazioni che richiamano il dominio PH il quale lo riconosce e si lega

permettendo in questo modo di interagire con la GTPasi (in figura Rho) mediante il dominio DH che

catalizza il rilascio di GDP.

Regolazione allosterica da inibizione:

Inizialmente il dominio DH e PH formano delle interazioni intramolecolari, nel momento in cui PH lega la

MP in quanto è presente un fosfolipide attivato, l’ancoraggio costringe PH a rompere i legami con DH,

poiché sono gli stessi siti di interazione, questo comporta DH ad assumere una nuova conformazione quella

attiva. Quindi abbiamo due conformazioni, una chiusa DH-PH con DH inattiva, ed un’aperta dovuta al

legame tra PH e la MP ed attivazione di DH. (esiste un caso particolare dove il DH assume la sua

conformazione attiva nel momento in cui viene fosforilata una Tirosina).

Proteina regolativa GDI: (meno importanti e meno studiate)

Queste proteine hanno un effetto opposto alle GEF, rendendo più difficoltoso il distacco del GDP,

stabilizzando la struttura della proteina legata al GDP, questo avviene stabilizzando la posizione dei loop,

quelli dello switch I e II, rendendo difficile lo switch di attivazione.

Recettori Tirosin Kinasici:

E’ il meccanismo principale per l’attivazione di proteine Ras, questi recettori una volta attivati, presentano

Tirosine fosforilate che sono siti di docking per l’interazione con proteine cellulari.

Questi recettori legano una proteina adattatore (Grb2), queste sono non possiedono nessuna funzione

catalitica ma fungono da ponte collegando il recettore con altre proteine. Queste sono composti solo da

moduli proteici di interazione proteina-proteina. Infatti come è mostrato in figura il recettore Tirosin

Chinasico è legato da Grb2, che riconosce un sito fosforilato, e collega una proteina regolativa come GEF o

nella figura SOS (son of sevenless, è una GEF che induce lo scambio tra GDP e GTP), questa lega a sua

volta Ras attivandola (Ras GDP è nella forma intattiva, mentre è attiva legata al GTP). In seguito interverrà

un'altra proteina regolativa che riporterà Ras nel suo stato inattivo.

Struttura recettori Tirosin Kinasici:

L’ultima classe di recettori di membrana sono i recettori Tirosin Kinasici, questi sono gli unici recettori che

presentano un attività catalitica (attività chinasica che riconoscono particolari siti di Tirosina fosforilandoli).

Nella topologia di questi recettori è possibile distinguere 3 domini:

1) Dominio Extracellulare

2) Dominio Transmembrana (TM)

3) Dominio Intracellulare

Il dominio intracellulare, anchesso molto conservato, presenta il dominio chinasico, un dominio comune a

tutte le chinasi sia quelli citosoliche attivate da secondi messaggeri sia quelle di membrana. Il dominio

chinas