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Laboratorio biomolecolare

Appunti di Laboratorio molecolare basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof. Cutrupi dell’università degli Studi di Torino - Unito, Facoltà di Scienze matematiche fisiche e naturali, Corso di laurea in Scienze biologiche. Scarica il file in formato PDF!

Esame di Laboratorio biomolecolare docente Prof. S. Cutrupi

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ESTRATTO DOCUMENTO

per rinoscere i vettori:

se conosco la sequenza uso la PCR

– se non la conosco uso gli enzimi di restrizione

Una libreria deve essere: rappresentativa, di diverse ampiezze (non possono

essere troppo piccole), hanno diversi tipi di frammentazione, numero di cloni. I

cloni possono avere sequenze adiacenti o sovrapposti.

Frammenti non sovrapposti: il dna genomico viene tagliato e ciascuno è

distinto dall'altro

Frammenti sovrapposti: le sequenze hanno parti in comune

TIPI DI FRAMMENTAZIONE:

1) frammentazione meccanica: tramite sonicazione che ci permette di

ottenere sovrapposti. La frammentazione è casuale.

2) Dnasi : taglia casualmente il dna. La frammentazione è casuale e lo

svantaggio è che la dnasi crea frammenti troppo piccoli

3) enzimi di restrizione: possono agire con digestione parziale. È il metodo

più utilizzato perchè permette un facile clonaggio.

Per ridurre il numero di frammenti si utilizza la digestione parziale. La colonia

può essere amplificata ottenendo cosi grandi quantità di frammenti.

A seconda della dimensione del frammento avremmo la libreria di dimensioni

diverse.

LIBRERIA A CDNA

Dna complementare a partire dall'rna.

L'rna viene estratto e purificato dalle cellule. L'mrna viene purficato grazie alla

coda del poliadenilato. Il poliadenialto può innescare la sintesi di una copia di

dna grazie all'enzima trascrittasi inversa.

Come si crea il cdna: ho un primer oligo dt. La trascrittasi inversa riesce ad

avere dall'rna una molecola di dna. Si crea un doppio filamento. La nucleasi

crea delle estremità nette.

Utilizziamo quini gli olinucleotidi ( frammenti a doppio filamento che contiene

un sito di restrizione)

La ligasi lega il linker cdna. Il linker si legano alle estremità blunt. Gli enzimi

di restrizione ci fanno ottenere estremità sticky più facile da clonare.

IDENTIFICAZIONE CLONE RICOMBINANTE

se partiamo da una libreria genomica:

screening

– PCR

– restrizione

– sequenziamento

con singola sequenza (ascolta regstrazione)

per ibridazione:

1) possiamo operare per analogia di sequenza ( avere la stessa sequenza in

un altra specie)

2) identificazione parziale della sequenza peptidica

3) operare tramite espressione ( ci sono plasmidi che permettono espressioni

proteiche)

1_ sulla piastra faccio aderire un filtro e una parte di batteri rimane adesa al

filtro. Se liso i batteri, dal loro interno uscirà il dna che poi verrà denaturato.

Utilizzo poi una sonda marcata che ibrida la sequenza omologa sui cloni.

Riuscirò a riconoscere il clone di origine sul filtro.

IBRIDAZIONE: un gene A

produco una sonda (prob)

posso operare in due modi:

1) ibridazione ad alta stringenza : impongo che i due filamenti siano

appaiati . Formmmide a 42°C

2) ibridazione a bassa stringenza: formammide a 35°C. Se tengo una

temperatura bassa i movimenti molecolari sono di più quindi non ho un

appaiamento perfetto. Posso avere più molecole ibride.

Come si marcano le sonde:

inserimento dei nick

– random primer

– estensione degli enzimi di restrizione

– end-labeling

– PCR

Nick: ho un doppio filamento di dna, uso la dnasi a bassa concentrazione. In

corrispondenza dei tagli lavora la polimerasi.

Random: denaturazione,appaiamento.Vengono utilizzati come innesco per la

sintesi del nuovo nucleotide.

CLONAGGIO PER OMOLOGIA

_ avere una sequenza omologa_

1) recettori tirosina chinasi: se isolo i domini dei RTK posso riconoscere

altri membri. Isolando la regione che conosco posso fare lo screening del

dna.

2) Proteine come il gene dell'albumina di topo. Una proteina nota può

aiutarci a riconoscere un altra proteina ( la stessa) in un altra specie.

OMOLOGIA: possiamo cercare un analogia allineando due sequenze di aa e

trovare gli aa comuni delle due sequenze.

L'omologia può essere cercata direttamente sulle sequenze nucleotidiche. In

questo caso confronto direttamente le sequenze. L'omologia in genere è più alta

nelle sequenze aminoacidiche perchè una tripletta può modificare più geni.

SINTESI DI OLIGONUCLEOTIDI

Si utilizzano dei sistemi chimici. Vengono modificate le estremità in modo tale

che l'oligo venga inserito in modo preciso. Le posizione 3' è modificata con il

diisopropilfosforamidite. Il 5' viene modificata con il dimetossitritile. Le

estremità reagiscono e si forma un ponte fosfodiestere. Con la dietrilazione si ha

la liberazione del 5'.

in sintesi: il metile del 3' si aggancia con il gruppo OH del 5' del nucleotide

precendete formando il ponte fosfodiestere. Per liberare il 5' si utilizza

l'ossidazione con iodio e deotrilazione.

COME POSSONO ESSERE MANIPOLATI I BATTERI?

La colonia può essere conservata o amplificata all'infinito su piastra agar dove

si possono isolare le singole colonie, oppure cresciute in terreno liquido con la

presenza di glicerolo utilizzando:

un terreno piccolo ( 3-5 ml) avendo quindi un plasmide dell'ordine dei

– microgrammi ( MINIPREP)

un terreno di coltura di 100 ml o 1L a 37°C overnight, ottenendo un

– plasmide in quantità superiore al microgrammo (MAXIPREP)

il terreno di coltura utilizzato è : LB MEDIUM ( Luria Berta)

composizione:

triptone: composione di peptidi che derivano dalla digestione della

– caseina grazie alla tripsina

estratto di lievito

– nacl

– ph 7.0

Una volta prodotto, il terreno deve essere autoclavato ( porto ad alta

temperatura per eliminare muffe e batteri). Il terreno poi può essere conservato

a temperatura ambiente o addizionato con antibiotici.

Pastre agar: ad alta temperatura si presentano liquide, mentre a temperatura

ambiente diventano solide.

Per poter manipolare i batteri possiamo manipolare diverse quantità di dna.

manipolazione del gene stesso di dna: fusione, delezione, mutazioni

– determinazione delle sequenza nucleotidica

– i vettori possono essere utilizzati in: cellule animali e vegetali, lieviti,

– animali e pianti transgenici e terapia genica.

MANIPOLAZIONE DNA PLASMIDICO

Ciascun clone può essere prelevato con ansa batterica. Una volta prelevato la

colonia si trasferisce in un terreno liquido. Ciascuna provetta avrà la sua

colonia. Il terreno liquido viene tenuto in movimento per mantenare una certa

areazione nella coltura e per mantenere i nutrienti in movimento. Si hanno , con

questo metodo, 4 mila miliardi di cellule.

Come crescono i batteri?

La crescita batterica si descrive con la curva sigmoide. Si ha una fase

esponenziale dove i batteri crescono. Una fase di crescita esponenziale dove i

batteri raggiunono il picco di cresciuta e una fase di fine screscita per mancanza

di nutrienti.

PURIFICAZIONE DNA PLASMIDICO.

Abbiamo:

parete

– genoma

– plasmidi

Rompo la parete con il sodio adenil fosfato. Il genoma e il plasmide vengono

denaturati con nNaOh che separa la doppia elica e rompe i nucleotidi. Si

utilizza poi un soultingh out: si aggiumge l'acetato di potassio che fa precipitare

i lipidi e le proteine. Tramite centrifugazione ritroviamo in soluzione il dna

plasmidico. Per ottenere il dna o l'rna puro si usa soluzione organica di fenolo

cloroformio ( ph basico per il dna , ph acido per l'rna). Si applica una

centrifugazione e ottengo così una fosfatasi ( superiore di dna o rna). Con una

pipetta prelevo la fase superiore e la trasferisco in una provetta nuova.

Aggiungo un volume doppio di etanolo a freddo e centrigufo ottenedo un pellet

di rna o dna. Elimino il surnatante, effettuo un lavaggio, centrifugo, faccio

asciugare all'aria e infine aggiungo un buffer per portare il dna o rna in

sospensione.

La purificazione fenolo-cloroformio è un metodo molto efficiente ma

cancerogeno. Un altro meccaniscmo di purificazione in alternativa al fenolo

cloroformio: sono state utilizzate delle colonnine all'interno del quale è presente

una matrice. Grazie alle colonnine posso aggiungere il dna che si lega alla

matrice. Cambiando la forza ionica il dna viene staccato ed eluito quando

effettuo il lavaggio le proteine sono le prime ad uscire dalla colonna.

RICONOSCIMENTO DNA

Si utilizza il bromuro di etidio che si inserisce nella doppia elica ed è

fluorescente. È cancerogeno ed è stato eliminato dai laboratori. Ora si usa una

nuova classe di sostanze che sono meno invasive : SYBR SAFE (cromogeni

che consentono di vedere il dna quando viene esposto alla luce)

altro sistema di purificazione: CLORURO DI CESIO ( si effettua una

purificazione assoluta)

si carica sul surnatante il cscl e centrifugo per 40 ore. Si forma un anello ( dna)

che viene prelevato con una siringa.Una volta purificato si conclude con un

analisi di restrizione con enzimi di restrizione visibili sul gel.

MAPPA DI RESTRIZIONE

mappa che ricostruiamo perchè conosciamo la posizione delgi enzimi di

rstrizione. In base all'enzima avrò lunghezze duverse dei frammenti.

SEQUENZIAMENTO DNA

riconosce la sequenza. E stato rinoscosciuto l'intero genoma umano. Dalla

sequenza del dna derivano una serie di applicazioni mediche. Il sequenziamento

non si limita al rinoscimento delle sequenze ma cerca di capire:

le modificazione epigenetiche ( riguarda la cromatina)

– fattori trascrizionali

il sequenziamento riguardo anche l'rna di tutti i tipi.

METODI DI SEQUENZIAMENTO

ho il doppio filamento di dna:

clonaggio in vivo: ho i batteri( colonie) si purificano e si sequenziano

– clonaggio in vitro (PCR): si crea una libreria e vengono sequenziate.

PERCHE IL CLONAGGIO CI AIUTA NEL SEQUENZIAMENTO?

Ci aiuta ad avere grandi quantità di frammento. Le sequenze del plasmide ci

consentono di creare primer complementari.

I sistemi di sequenziamento antichi: MAXAM GILBERT, metodo chimico per

interrompere le sequenze di dna.

Quando voglio separare pochi nucleotidi uso il gel di poliacrilamide. Un altro

metodo è quello di SANGER ( metodo del desossi). Otteniamo un gel

d'agarosio con le basi di grandezze diverse. Il vantaggio: non è possibile

aggiungere altri nucleotidi alla sequenza.

Una successiva evoluzione del metodo ha permesso l'automazio del dna. Il gel

d'agarosio viene sostituito con l'elettroforesi capillare: colonnina capace di

separare singoli frammento per un solo nucleotide.

SEQUENZIAMENTO NEX GENERATION

Uso la PCR ( posso avere grandi quantità dei frammenti) e dei linker. Il

vantaggio di usare la PCR è quello di essere una procedura molto rapida, e

abere tante molecole a basso costo.

Precauzioni/ problemi:

alta possibilità di avere frammenti di dna

– la taq polimerasi riesce a lavorare con frammenti molto lunghi

– alta sensibilità per cui se ci sono contaminanti entrano nelle nostre

– reazioni.

I due sistemi ( clonaggio in vivo e in vitro) prevedono metodi diversi per

assemblare le sequenze.

Sistema gerarchico: strutta il fatto che al principio ciascun laboratorio aveva

un solo cromosoma da separare. La procedura era troppo impegnativa.

Metodo shotgun: frammento l'intero genoma senza tener conto di nulla. Quindi

abbiamo popolazioni omogenee. Otteniamo un sequenzimento veloce

(ricostruzione dell'intero genoma). Tutte le seuqneza sono over-rappresentate.

Questa evoluzione ci ha portato ad avere cloni batterici e cloni a dna.

AMPLIFICAZIONE SENZA CLONAGGIO

_ tramite PCR_

l'adattatore serve a riconoscere il suo corrispettivo su un supporto solido.

Amplificazione mediante emulsione PCR:

sferette con PRIMER

– nella provetta aggiungo il dna

– la sintesi dei frammenti consente di avere l'amplificazione.

Bridge PCR

sferette su supporto solido

– il framnento amplificato forma dei ponti,

SISTEMA DI RILEVAMENTO

pirosequenzuamento:

viene rilasciato il pirofosfato che viene utilizzato dall'ATP sulforilasi che

– in presenza di adenosina 5-fosfato fa ottenere una molecola di atp. L'ATP

viene utilizzato dalla luciferasi per liberare luce. L'apirosi rimuove i

nucleotidi e l'ATP in eccesso e cosi si passa al ciclo successivo.

La reazione avviene in tante cuvette dove veìiene amplificato in clone di dna.

Le celle si trovano su un vetrino che quando viene chiuso crea una camera

microfluidica.

Illumino solex:

si utilizza nucleotidi ,arcati che si inseriscono nella sequenza. Viene

– rilevato e al termine della reazione viene eliminato e si ricomincia il ciclo.

Per aumentare la sensibilità di lettura hanno pensato di utilizzare una dna ligasi

che si inserriscono in frammenti ottendone così sempre un segnale. Il

READOUT sono milione di corte sequenze che vengono chiamate “ READS”

( vengono allneati al genoma e assegnati ai diversi geni)

attualmente è stato eliminato lo step di amplificazione PCR. Si agisce per

singola molecola.

PACIFIC BIOSENCENS:

ho un supoporto solido. L'enzima lavora nella sequenza della singola

– molecola. Vengono utilizzati nucleotidi marcati che quando si appaiono

genarano un segnale.

SMRT SEQUENCING:

è possibile rilevare l'inserimento dal nucleotide con un detector

IONE TORRENT:

sistema a semi conduttore. Tutte le volte che viene inserito un nucleotide

– viene rilasciato uno ione x che rappresenta un segnale.

SEQUENZIAMENTO NANO PORO:

la dna polimerasi si trova su di un poro in grado di rilevare un passaggio

– del singolo nucleotide che ne determina il segnale.

SCOPO DELLE MANIPOLAZIONI

i TAG che ci consentono di studiare la proteina pure, sono epitopi che usiamo

come sequenza e ci permettono di riconoscere la proteina.

Co immuno precipitazioni: possiamo studiare la nostra proteina

I Tag possono essere procariotici ed eucariotici in cellule animali.

Le tecniche di trasfezione e trasduzione ci permettono di studiare la proteina.

Rna-antisenso : ci permette di inibire l'espressione della proteina.

Animali trangenici: geni knock-out

TRASCRIZIONE

modelli:

E.coli: proteina ricombinante da un punto di vista funzionale, interazioni,

– reagenti

lievito: funzionabilità,ricombinazione, interazione

– animali: studio funzionale.

Se parto da una libreria:

identifico il clone

– lo sequenzio

– effettuo un sub clonaggio

se parto dal database:

disegno primer per amplificare il dna

– effettuo una PCR

– clono il vettore

– effettuo un sub clonaggio

AFTER: cerco il nuovo gene.

La sequenza completa deve avere l'ATC e il codone di STOP.

Due metodi:

1) RACE (amplificazione degli estremi)

2) estensione dei primer

1) RACE:

m rna

– disegno un primer specifico

– ( con la revers trascrittasi) ottengo un filamento di dna

– (elimino l'rna grazia all'rnasi)

– al 3' aggiungo i nucleotidi grazie alla terminal trasferasi che crea al 3' una

– sequenza aggiuntiva,grazie alla quale si crea un primer che consente alla

taq polimerasi di creare un cdna

in alternativa alla terminal trasferasi il cdna può essere addizionato con un

ancor primer che ci permette di avere una seuqnenza consciuta che possiamo

amplificare tramite la RACE.

ASEEMBLAGGIO DELLE SEQUENZE 5' E 3' ATTENUTO DALLA RACE

sintetizzo il primer che hanno una coda

– (tramite la PCR) entrmbi i filamenti hanno il sito di restrizione

– (ligasi) riuscisco i frammenti

PRIMER EXSTENTION

si possono avere regioni comuni ai 2 filanebtu

– (PCR) ottengo i due filamenti

– (denaturo grazia alla taq polimerasi) e ottengo un filamento a cdna

– completo

STUDIO DELLA PROTEINA:

localizzazione

– funzione

– interazione

– struttura

Per passare ad un altro vettore ho due metodi:

enzimi di restrizione

– utilizzo la PCR

VETTORI DI ESPRESSIONE DEGLI EUCARIOTI

possiedono:

un promotore

– una sequenza operatore

– un polylinker

– un sito binding

– una sequenza temrinatore

– un origine di replicazione un marcatore di selezione

PROTEINA DI FUSIONE

1) unione dei domini di proteine diverse

2) TAG : seuqneza polipeptidica che può essere aggiunta alla proteina

dìinteresse

come si crea lla proteina di fusione? ( la fusione avviene a livello della

sequenza).

taglio entrambi i dna con l'adatto enzima di restrizione. Se unisco i 2 dna e li

sottopongo all'azione della dna ligasi ( senti registrazione)

GLUCATIONE S TRANSFERASI

sito multiplo di clonaggio che consente di creare la proteina di fusione. Può

essere riconsociuta dalla proteasi che ci permette di eliminare il taglio.

GST: abbiamo un supporto di biglie accompagnato dal glucaitione. La GST

– riconosce il glucatione.

Bisogna tenere conto delle triplette e quindi tenere conto del fatto che stiamo

inseriendp dei codoni di stop o meno. Con l'IPTG possoamo far esprime la

proteina solo quando vogliamo. Per capire quali domaini lega la proteina

elimino mano a mano le varie parti di essa.

Ad esempio: se elimino il dominio 3 perdo la capacità di legare il GTP.

Viceversa, se elimino il dominio 2 perdo al capacità di legare la proteina

numero2.

GENOMICA FUNZIONALE IN LIEVITO

il lievito:

è piccolo

– ha una crescita veloce

– è un m.o semplice

– è facile da manipolare

il lievito ha due gruppi di compatibilità: A e alfa. Nella forma aploide si

riconoscono e corrispondono ad una precisa struttura nel genoma.

A e alfa insieme formano: A/alfa che grazie ai nutrienti limitanti formano della

tatradi aploidi ( A,alfa;A,alfa) e grazie alla germinazione si formano delle

gemme.

Mating tipe switch:

cambiamento di compatibilità che avviene garzie ad una ricombinazione

– che viene sfruttata per avere mutanti di ricombinazione.

Partiamo da cellule aploide che possono contenere il gene URA3. Si sfrutta la

capacità del lievito di formare tetradi che successivaente vengono disgregate.

L'URA 3 è un gene di selezione.

Terreno senza uracile: URA 3 consenta la sopravvivenza

terreno con uracile: URA 3 non è necessario

Se il gene è essenziale per la crescita cellulare e non lo mettiamo le cellule

moriranno. Ci sono mutanti di lievito che possono essere selzionato per la

temperatura.sono mutanti sensibili alle variazioni di temperatura. Possiamo

avere mutanti che differiscono per la morfologia.

TRESFERIMETNO GENICO IN CELLULE DI EUCARIOTI SUPERIORI

_ CELLULE ANIMALI IN COLTURA_

colture cellulari

la linee cellulari possono essere amplificate in colture.. possono anche essere

delle linee primari (ad esempio tumorali)

cellule normali:

- fibroblasti che hanno una forma affusolata che messi in piastra tendono ad

aderire e ad attaccarsi al fondo della piastra stessa.

Cellule trasformate o tumorali:

hanno morfologia diversa e tendono a formare gruppi di cellulare. In

– piastra tendono a crescere formando dei veri e proprio aggregati

Le cellule in laboratorio vengono cresciute all'interno di incubatori che possono

mantenere la temperatura ( a 37 gradi), hanno un atm arricchita in CO2 che

serve a temponare il mezzo di coltura, si può modulare anche la percetuale di

O2. L'incubatore alimentato da bombole che contengono i gas necessari.

All'interno dell'incubatore viene mantenuto un certo grado di umidità grazie a

vsache che contengono dell'acqua (necessario per mantenere in vita le

cellule).Un altro aspetto importante è il fatto della sterilità! L'incubatore deve

essere sterile. Ci sono dei sistemi ciclici di decontaminazione che eliminano

eventuali muffe e batteri resistenti.

Crescita di cellule

Le cellule crescono in piastre specifiche per le colture cellulari. Sono di diverse

dimensioni perchè consentono la crescità di coltura cellulari differenti. Esistono

anche piastre multipozzetto utilizzate per i saggi biologici.

Coltivazione di cellule

abbiamo tipi diversi di terreno. Per mettere il terreno di coltura nelle piastre si

utilizzano delle pipette (sterile). Tutte le azioni vengono compitue sotto cappa a

flusso laminare che mantengono l'ambiante interno sterile, ne esistono di

diverso tipo a seconda della manipolazione che si fa.

Lo stesso concetto di studio di una sostanza viene applicato con i plasmidi.

Trasfezione cellulare: trasferimento genico ad una cellula animale effettuato

con vari metodi.

Trasfezione delle cellule animali

abbiamo diversi metodi:

co precipitazione con fosfato di calcio

– complessazione di DEAE destrano

– lipofezione

– eletroporazione

il dna plasmidico entra in alcune cellule ma non in tutte. Viene in parte

degradato e in parte riesce raggiugnere il nucleo dove può essere espresso il

nostro gene. Ha una finestra temporale di 12-72 ore dopo la trasfezione.

Superate queste ore il dna vien degradato oppure può essere integrato all'interno

del genoma della cellula ospite

trasfezione con calcio fosfato

si prepara una slz in cui il dna viene incubato con un sale che contiene il

fosfato. In questa soluzione si aggiunge il Ca molto lentamente facendo formare

cosi molecole con fosfato di Ca più dna. Una volta complessato il dna con il

fosfato, viene addizionato sulle nostre cellule.

Il DEAE destrano funziona allo stesso modo

lipofezione

è il campo che ha ancora adesso un notevole sviluppo biotecnologico pechè si

utilizzano dei lipidi (composizione eterogenea soprattutto per quanto riguarda la

colture primarie). Il principio è quello di creare delle micelle, con all'interno il

dna,che sono in grado di entrare all'interno delle particelle che vengono

inglobate all'interno delle cellule, successivamente viene quindi espresso il

nostro gene dìinteresse

elettroporazione

Già vista nei batteri e indentica per le cellule animali. Le cellulev egnono messe

in una celletta. Si creano deipori nella cellula grazie all'applicazione di una

campo elettrico, il dna entra nella cellula e quelle che sopravvivono a questo

trattemento esprino il nostro gene.

Nelle cellule animali per favorire l'espressione del gene occorre:

il 5' UTR

– IL 3' UTR

– il poliadenilato

quando si vuole far esprime un gene di soltio si mette solo la sequenza

codificante. La ORF è fiancheggiata dal 5' utr 3 ' UTR e del poliadeliato. Il

promotore è l'elemeto necessario per la trascrizone del gene.

Il promotore può anche contenere un anhancer. Possiamo avere un introne che

favorisce il pocessamento del gene, un sito multiplo d clonaggio e un sito

multiplo di poliadenilazione. Tutti i plasmidi hanno una selezione di resistenza

per identificare le cellule che hanno inserito stabilmente il nostro plasmide. Per

poter transfttare le nostre cellule devo avere una certa quantità del plasmide. Per

avere una certa quantità di plasmide lo amplifico dei batteri. Posso fare quindi

MINIPREP o MAXIPREP. Il plasmide quindi può essere purificato con il

fenolo cloroformio ( usato molto poco). Il plasmide può essere trasfettato nelle

cellule e abbiamo due possibilità:

un espressione transiende

– un espressione stabile

il promotore può essere:

una sequenza LTR ricavata dai virus che infettano gli animali ma che

– hanno una grande potenza di regolazione della trascrizione

RSV: rous sarcoma virus

– SV40: simian virus 40

– CMW: citomegalovirus

ci sono anche altri tipi d vettori con caratteristiche diverse.possiamo avere

vettori con una T sporgente che favoriscono l'inserimento del frammento

d'interesse. Altri vettori possono avere sequenza regolaori come la bete-globina

5' UTR.

Trasfezione stabile e transiente

Con trasfezione transiente :

- si intende la transfezione che dura per una finestra temporale da 12 a 72 ore

dove durante questo periodo si può avere l'espressione del gene. Dopodiche il

pasmide può essere degradato.

Una piccola percetuale può integrare, cioò il gene va inserirsi nel genoma della

cellula ospite in questo caso nel genoma della cellula abbiamo la sequenza del

dna plasmidico. Abbiamo quindi la tranfezione stabile dove le cellule figlie

ricevono il gene d'interesse. Il plasmide viene incubato con le cellule ma viene

utilizzata una selezione ( G418 che fa morire le cellule senza il plasmide).

Grazie a questo sistema è possibile selezionare tutte le cellule che hanno preso

il gene e che quindi possono trasferirlo alle cellule figlie.

Geni di resistenza specifici per cellule animali:

ce ne sono di diversi tipi a seconda del vettore e del tipo cellulare. In genere

sono tutti o onibitore della sintesi proteica o del metabolismo cellulare. Ad

esempio la timidina chinasi che è in grado di fosforilare la timidina a timidina

fosforilasi. Questa fa sopravvivere le cellule perche nel terreno togliamo la

timidina; se manca non potranno sopravvivere, grazie alla presenza del gene

possono sintetizzare i nucleotidi.

Possiamo trasfettare nelle cellule il nostro dna di interesse. A volte il plasmide

può non contenere il gene di resistenza. Si crea la miscela del calcio fosfato con

ivettori e si inserisce nelle cellule. Se utiliziamo ilterreno dove manca

ilcomponente fondamente per la crescita delle cellule ma vienen acquisito solo

dalle celllule che contengono i plasmidi possono ?

Possiamo verificare la presenza del gene nel genoma utilizzando il souther

bloth.

Efficienze di trasfezione

a seconda elle percentuale di cell trasfettate possiamo capire quanto la proteina

abbia fatto effetto sulle nostre cellule. Per valutare la % di trasfezione si utilizza

la proteina GFP. Di questa proteina sono stati fattyi diversi mutanti che

consentono di sviluppare la proteina con diverse emissioni d'onda. La GFP ha

una struttra all'intenro della quale c'è un fluorocromo che emette grazie alla luce

ed è di colore verde. Grazie all'espressione della proteina possiamo

indentificare le cell trasfettate. Possiamo quantificarle attraverso uno strumento

che rileva la presenza della GFP. Possiamo inserire la GFP sul vettore stesso.

La sequenza IRES è una sequenza che consente la sintesi di un RNA

policistronico ( si ottiene un rnam che ha una prima porzione codificante e poi

ha una przione ires grazue alla quale posso codificare per due proteine diverse)

il vantaggio è che i due geni sono sullo stesso plasmide quinsi entraranno

insieme all'intenro della stessa cellula.un altro aspetto interessante è che

entrambi i geni sono regolati dallo stesso promotore, è molto impo perche se

voglio regolare la quantità di proteina sintetizzata all'ntenro della cellula posso

sare solo questo metodo.Questo sistema è utile quando non si vuole aggiungere

un TAG alla nostra proteina d'interesse.

Come si controlla l'integrazione del plasmide nel genoma della cell ospite

ho due sistemi:

-pcr quantitativa

-souther bloth

souther blot:

dalle nostre cellule animali posso purifcare il dna genomico: liso le cellule,

purifico il dna genomico con il fenolo cloroformio, si frammenta,si caricano su

gel. Applicando il campo elettrico i frammenti vengono separati in base alla

taglia. A questo punto traferimao il dna dal gel ad una membrana di nitro

cellulosa.grazie a questo sistema otteniamo sul filtro il dna. Grazie a qst filtro

posso utilizzare una sonda marcata che si ibriderà nelle posizioni dove è prsente

il gene di interessa. Questo sistema si chiama souther blot perchp consiste nel

trasferimento di dna da gel a filtro di notro cellulosa.

Ho una vaschetta all'intenro del quale metto una carta, il gel e la membrna di

nitro cellulosa. Questi foglietti consentono il passaggio dalla vaschetta al gel.

Una volta trsferito si utilizza la sonda incubandola con l anostra memebrana di

nitro, e applicando dei lavaggi ad alta stringenza posso indentifacare una sola

banda che ci indicherà che nelle cell è stato integrato il nostro genen di

interesse. Tuttavia nonsempre dispongo di una sequenza completa, per favorire

il riconoscimento posso utilizzare dei lavaggi a media stringenza o ad alta

stringenza.

Il plasmide si replica nelle cell animali?

NO. tuttavia ci sono delle cell e dei plasmidi che consentono l'ampificazione del

plasmide all'intenro della cellula. Queste cellule sono particolari. Il pasmide ha

un origine di replicazione SW40 che per essere utilizzata dalle cellule devono

avere caratteristiche particolrre: clelule COS che possono esprimere l'antigene

virale LT. Grazie a questo antigene viene riconsociuto l'origine di replicazione

SW40 e possiamo avere quindi un alto numeor di copie plasmidiche. Qst

sistema è utilizzato quando voglio ottenere grandi quantità della nostra proteina

di interesse.

Se voglio utilizzare altre cellule invece devo utilizzare un altro metodo e devo

affrontare il problema della bassa efficienza di trasfezione. Per aumetare

l'efficienza di trasfezione senza fare delle linee stabili si utilizza l'infezione

virale. Si parla quindi di trasduzione con vettori virali; è un sistema ad alta

efcienza di trasferimento genico e anche molto rapido. Per l'inf.virale vengono

utilizzati diversi vettori virali che hanno origine da diversi virus. L'infezione

virale è uno dei campi in attiva crescita biotecnologica proprio perche l'inf.

virale può essere estesa agli organismi e quindi utilizzata per la terapia genica.

I virus più utilizzati sono:

gli adenovirus: struttura a capside con proteina che sporgono dal capside e

– possono essere riconsciute dalla proteine target. A seconda della proteina

espressa sul capisde il virus sarà riconosciuto

adenovirus

– retrovirus o lentivirus

la caratteristica fondamentale per poter utilizzare qst virus e renderli innoqui è

quella di eliminare dal genoma virale le sequenze che codificano per il capside.

Il genoma virale è difettivo (mancano dei geni per dar euna parteicella attiva)

quest i geni però sono necessari. I geni del capside vengono integrati nel

genoma delle cell helper ( cellule animali in grado di sintetizzare il capside ma

non hanno il genoma virale). In questo modo quando vogliamo produrre la

nostra particella virale ricombinante con un capside e con il nostro dna

diinteresse e non quello del virus. Qst particelle possono essere utilizzate per

infettare le nostre cell target. Qst plasmidi hanno la capacità di inserirsi nel

genoma della cell target. in questo modo si creano un grande numero di cell che

esprimono il gene target. Le sequenze ITR permettono l'inserimento nel

genoma.

La particella virale è ricombinante cioè ha dei geni del capside che vengono

espressi dalla helper ma il genoma virale è il nostro plasmide.

Mentre tutte le trasfezioni possono essere fatto in cell in attiva replicazione, una

caratteristica dei lentivirus è quella di trasdurre delle cell differenziate. Per la

terapia genica è molto importante. Quindi si utilizzano dei virus che sono in

grado di trasdurre delle particelle virali che non si dividono.

Per studiare la funzione del nostro gene, possiamo studiare la localizzazione, la

crescita, il movimento l'adesione e l'espressione genica, ma come??

FUNZIONE DELLA PROTEINA TARGET

all'interno delle funzioni possiamo distinguere delle sovrapposizioni tra

tecniche diverse.la localizzazioni la crescita l'adesione e l'apoptosi sono tutte

funzioni.il gene di interesse si manipola con tecniche di biologia molecolare.

Una volta che abbiamo trasnfettato la proteina nella cellula bisogna valutare

l'espressione del nostro gene.. come?

L'espresssione si valuta con l'rnam o con la proteina stessa. Possiamo valutare

diverse funzioni biologiche. L'espressione continua di una proteina esogena

all'interno di una cellula non è normale. Delle proteine che espresse

continuamente possono essere letali per la cellule. Per studiare proteina di

questo tipo studiamo un sistema indicibile ( faccio esprimerre la proteina solo

quando lo voglio e in un arco di tempo ben preciso). Questo sistema utilizza

proteina ingegnierizzate. A monte del gene troviamo un promotore, a monte del

promotore c'è una seq. TRE modificata perchè viene riconosciuta da una

proteina repressore procariotico. Questa proteina nel caso del sistema tet-off

quando è legata al suo elemento di regolazione TRE induce la trasrizione del

gene perchè è fusa con un dominio di transattivazione VP16. Quando

aggiungiamo una sostanza cioè la doxociclina, quando si lega al repressore, lo

stacca dalla sequenza e il gene viene silenziato. Questa stessa proteina è

modificata perchè può funzionarre da attivatore della trascrizione solo quando

lega la doxociclina, per questo si chiama tet-on.

Questo sistema funziona con due plasmidi diversi:

uno è il plasmide con il gene , l'altro è il plasmide che continene la proteina

ricombinante. Nel sistema tet-off la proteina si lega alla seq regolatoria e attiva

la trascrizone. Quando è lagata alla doxociclina si stacca dalla sequenza e il

gene non viene indotto.

COSTRUZIONE DI UNA PROTEINA TAG

possiamo inserire una sequenza ( corta o breve a seconda del TAG) e che ci

consente di ottenere una proteina di fusione e cui agganciamo una corta

sequenza proteica che può essere riconosciuta da anticorpi. Nel vettore abbiamo

il gene, il TAG può essere fuso in una posizione vicina al gene.come? I due

frammenti possono entrare a far parte di un unico vettore, quindi si crea un

unica seq che ci darà un unica proteina.

Quali sono i TAG?

Ci sono molti tag che vengono utilizzati in modo differente.

Una della funzioni dei tag è indentificare la proteina nella cellula.uno dei TAG

più utilizzati per studiare la localizzazione è la GFP. Quando si studia la

localizzazione è come tracciare una mappa che ci indica la posizione. Grazie ai

TAG è anche possibile seguirne il perxorso. La GFP si usa perchè può essere

anche utilizzata nelle cellule vitali.

Ci sono diversi fenomeno che sono molto importanti come il traffico

vescicolare. Qui ad esempio la RAB27 è in delle vescicole che possiamo

identificare grazie a diversi coloranti. In un altra foto possiamo notare che la

RAB27 è localizzata in vescicole di actina.

Se nelle proteina inserisco una mutazione cosa succede?

Per la mutagenesi si utilizza in genere la PCR. Si sintetizzano due

oligonucleotidi che hanno al loro interno la mutazione che vogliamo introdurre.

Costruiremo ai lati della nostra seq. Altre due coppie di primer che ci cosentono

di creare due frammenti: A che contiene la mutazioni e B idem. In questa zona

comune possiamo far appaiare i due segmenti A e B. utilizzando la pcr

possiamo amplificare l'intero filamento. Il doppio filamento completo avrà la

mutazione nella parte centrale. Per velocizzare questo sistema esiste un chit

molto efficiente: quikchange mutagenesis method. Il principio è lo stesso. Il

vantaggio è che qst sistema lavora direttamente sul plasmide di origine. Il

plasmide di origine quando viene amplificato nei batteri ci sono delle posizioni

cche possono essere metilate dal batterio stesso. Quindi una volta che ho

amplificato il plasmide, aggiungo il primer disegnato e sintetizzato e faccio

avvenire la PCR che sintetizza tutto il plasmide. È una PCR molto particolare:

molto precisa e che non inserisce altre mutazioni. Il plasmide che non contiene

la mutazione e che devo eliminare viene digerito con enzimi che riconoscono

solo il dna metilato.

A cosa serve?

La RAB 27 nella forma wide type si trova in vesciole. Se la mutiamo ( in

posizioni ben precise) viene persa la sua localizzazione nelle vescicole.

Sempre su questo discorso possiamo studiare approcci additivi o sottrattivi. Per

il sistema di sotrazione ( eliminare l'espressione della proteina) possiamo usare

diversi approcci:

tecnologia dell'rna interferente

– utilizzo di antisenso

– sistema del dominante negativo

quest'ultimo è un approccio in cui introduziamo una mutazione nella proteina e

se la proteina fa parte di un complesso la proteina può formare un complesso

con le proteina attiva e inattivare l'intero complesso. In questo caso si parla di

funzione dominante negativo.

Uno dei mutanti che fa perdere la localizzazione di RAB27 funzione da

dominante negativo. Il mutante di RAB27a , ovvero T23N.

Quando abbiamo una mutazione,il mutante che funge da dominante negativo va

a sostituirsi alla proteina wild type nelle vescicole.il dominante negativo è

proprio il fatto quindi che la proteina mofidicata faccia perdere la funzione alla

wild type.

Approccio antisenso

possiamo utilizzare sempre un vettore dove all'interno possiamo avere una seq

di dna che può essere sintetizzata a rna. Questo rna è antisenso cioè

complementare all'rna m presente nella cellula. Il doppio filamento di rna viene

degradato. Si possono utilizzare anche degli oligonucleotidi antisenso sintetici (

con 5' e 3' primo mdificati). Avviene la degradazione perchèè; il compleso

proteicono viene riconosciuto dal dicer che degrada il filamento. Il complesso

risc taglia e riconosce le seq, degradandola.

STUDIO DELL'INTERAZIONE TRA PROTEINE

ci sono diversi sistemi. Quello più utilizzato è quello del doppio ibrido nel

lievito,in vitro oppure in vivo cioè nella cellula.

Un altro metodo è quello del phage display.

Intereazione delle proteine:

la GST è uno dei tag che può essere utilizzato nelle purificazione ma può essere

anche utilizzato per studiare l'interazione tra proteine. Sulla sup. delle sfera

abbiamo del glucatione che viene riconosciuta dall glucatione s transferasi

.poichè la GST è in grado di rinoscere il glucatione rimarra' adesa. In qst

sistema possiamo aggiungere un estratto cellulare ( prendiamo altre cell le

lisiamo e il lisato lo mettiamo a contatto della proteina fissata alla matrice).

Laviamo via le proteine non legate. A qst punto dobbiamo staccare il complesso

dalla matrice quindi aggiungo il glucatione, avviene quindi una competizione. Il

glucatione libero sarà più appetibile per il complesso che si infine si stacca. Il

complesso proteico purificato potrà essere identificato tramite spettrometria di

massa o altro.

Un altro sistema è la co immuno precipitazione. Qui si utilizzano anticorpi

contro la proteina di interesse. Possiamo lisare le cell, immuno precipitare,

l'anticoprpo recluta la proteina. Qst anticorpo può essere fatto legare ad una

matrice di agarosio, quindi tutto il nostro complesso lo troviamo agganciato ad

una matrice perchè vogliamo isolare il complesso , laviamo tutto ciò che non ci

interesa e purifichiamo il nostro complesso proteico. Viene analizzato tramite

western bloth.( gel di poliacrillamide in cui le proteine vengono denaturate

grazie alla presenza di SDS che confersce una carica. Trasferisco quindi da un

gel ad una membrana di nitro cellulosa le proteine. La membrana può essere

ibridata con un anticorpo.)

lo studio delle interazioni può essere fatto sempre utilizzando anticorpi ma

contro il TAG.

Doppio ibrido

utilizza delle proteine di fusione ( ESCA) formata da un dominio che lega il dna

e una parte di proteina. L'altra proteina si chiama PREDA ed è formata da un

dominio che vogliamo studiare e un altra di attivazione trascrizionale. Abbiamo

una seq regolatorio a monte di un gene reporter (luciferasi) all'interno della

quale c'è il sito di legame della proteina esca. Quando i due domini

interagiscono tra loro formano un complesso proteico per cui la rpteina esca si

lega al dna, interagisce con la preda che attiva la trascrizione. Il sistema del

doppio ibrido è un sistema che utilizza tra plasmidi: uno contiene il gene

reporte ele altre due esprimono la proteina esca e preda. Formano un complesso

attivatorio se l'esca e la preda interagiscono. In questo caso creiamo una

proteina di fusione.

Quando il gene reporter è espresso ho un istogramma molto alto che mi dice

che le proteine stanno interagendo. Si inserisce un mutante di NFACT per

vedere se anch'esso interviene.

Fret

fusione di proteine della famiglia della GFP. Qst sistema è un sistema che

sfrutta l'energia di trasmissione della fluorescemza. Abbiamo due proteine x e y

fuse con una proteina fluorescente blu o verde. Se la proteina x viene eccitata da

una luce violette emette blu. Se la proteine interagiscono emettono luce verde.

Se ho i due fluorocromi all'estremità della proteina solo quando interagiscono

ottengo un segnale.

È stato dimostrato il cambiodi conformazione dei recettori estrogeni. Il cambio

di conformazione è legato al tamoxifen. Grazia alla fret si è studiata il cambio

del recettore in diverse condizioni.

L'N corrisponde all'asparagina.

I mutanti delle proteine vengono indicati con le single degli aa ( solo con le

lettere) la prima lettera corrisponde all'aa presenta nella wite type neòòa

posizione 23, l'ultima lettera corrisponde a quale aa abbiamo introdotto in

alternativa. La scelta dell'aa che si introduce in sostituzione di quello wyte type

ha un significato ben preciso. L'aa con cui si fanno le sostituzioni non è casuale.

Come si sostituisce un aa nella sequenza?

Quando vogliamo sostituire un aa dobbiamo sostituire il dna. Cioè sostituire le

triplette sul dna che si ripercuoteranno sull'rna messaggero con la sostituzione

dell'aa corrispondente. I primer che noi sintetizziamo devono contenere il

codone modificato all'interno per consetire di ottenere una proteina mutata in

posizione 23.

METODI DI STUDIO DELL'ESPRESSIONE GENICA

per studiare un singolo gene o metodi per studiare più geni

contemporaneamente.

Partendo da un gene si nota al monte del gene possiamo avere il complesso di

regolazione della trascrizione che induce l'espressone del gene. Già a questo

livello il ranon s ci consente di studiare l'rna neo sintetizzato. Qst tecnica

consente di analizzare l'rna neo sintetizzato utilizzando dei nucleotidi marcati.

Una volta sintetizzzato l'rna messaggero ( è un pre rna contiene esoni ed introni

e grazie alla maturazione dell'rna cioè allo splicing otteniamo l'rna m matura


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DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2015-2016

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher giada.camastra di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Laboratorio biomolecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Cutrupi Santina.

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