Laboratorio biomolecolare

FUNZIONE DELLA PROTEINA TARGET

all'interno delle funzioni possiamo distinguere delle sovrapposizioni tra

tecniche diverse.la localizzazioni la crescita l'adesione e l'apoptosi sono tutte

funzioni.il gene di interesse si manipola con tecniche di biologia molecolare.

Una volta che abbiamo trasnfettato la proteina nella cellula bisogna valutare

l'espressione del nostro gene.. come?

L'espresssione si valuta con l'rnam o con la proteina stessa. Possiamo valutare

diverse funzioni biologiche. L'espressione continua di una proteina esogena

all'interno di una cellula non è normale. Delle proteine che espresse

continuamente possono essere letali per la cellule. Per studiare proteina di

questo tipo studiamo un sistema indicibile ( faccio esprimerre la proteina solo

quando lo voglio e in un arco di tempo ben preciso). Questo sistema utilizza

proteina ingegnierizzate. A monte del gene troviamo un promotore, a monte del

promotore c'è una seq. TRE modificata perchè viene riconosciuta da una

proteina repressore procariotico. Questa proteina nel caso del sistema tet-off

quando è legata al suo elemento di regolazione TRE induce la trasrizione del

gene perchè è fusa con un dominio di transattivazione VP16. Quando

aggiungiamo una sostanza cioè la doxociclina, quando si lega al repressore, lo

stacca dalla sequenza e il gene viene silenziato. Questa stessa proteina è

modificata perchè può funzionarre da attivatore della trascrizione solo quando

lega la doxociclina, per questo si chiama tet-on.

Questo sistema funziona con due plasmidi diversi:

uno è il plasmide con il gene , l'altro è il plasmide che continene la proteina

ricombinante. Nel sistema tet-off la proteina si lega alla seq regolatoria e attiva

la trascrizone. Quando è lagata alla doxociclina si stacca dalla sequenza e il

gene non viene indotto.

COSTRUZIONE DI UNA PROTEINA TAG

possiamo inserire una sequenza ( corta o breve a seconda del TAG) e che ci

consente di ottenere una proteina di fusione e cui agganciamo una corta

sequenza proteica che può essere riconosciuta da anticorpi. Nel vettore abbiamo

il gene, il TAG può essere fuso in una posizione vicina al gene.come? I due

frammenti possono entrare a far parte di un unico vettore, quindi si crea un

unica seq che ci darà un unica proteina.

Quali sono i TAG?

Ci sono molti tag che vengono utilizzati in modo differente.

Una della funzioni dei tag è indentificare la proteina nella cellula.uno dei TAG

più utilizzati per studiare la localizzazione è la GFP. Quando si studia la

localizzazione è come tracciare una mappa che ci indica la posizione. Grazie ai

TAG è anche possibile seguirne il perxorso. La GFP si usa perchè può essere

anche utilizzata nelle cellule vitali.

Ci sono diversi fenomeno che sono molto importanti come il traffico

vescicolare. Qui ad esempio la RAB27 è in delle vescicole che possiamo

identificare grazie a diversi coloranti. In un altra foto possiamo notare che la

RAB27 è localizzata in vescicole di actina.

Se nelle proteina inserisco una mutazione cosa succede?

Per la mutagenesi si utilizza in genere la PCR. Si sintetizzano due

oligonucleotidi che hanno al loro interno la mutazione che vogliamo introdurre.

Costruiremo ai lati della nostra seq. Altre due coppie di primer che ci cosentono

di creare due frammenti: A che contiene la mutazioni e B idem. In questa zona

comune possiamo far appaiare i due segmenti A e B. utilizzando la pcr

possiamo amplificare l'intero filamento. Il doppio filamento completo avrà la

mutazione nella parte centrale. Per velocizzare questo sistema esiste un chit

molto efficiente: quikchange mutagenesis method. Il principio è lo stesso. Il

vantaggio è che qst sistema lavora direttamente sul plasmide di origine. Il

plasmide di origine quando viene amplificato nei batteri ci sono delle posizioni

cche possono essere metilate dal batterio stesso. Quindi una volta che ho

amplificato il plasmide, aggiungo il primer disegnato e sintetizzato e faccio

avvenire la PCR che sintetizza tutto il plasmide. È una PCR molto particolare:

molto precisa e che non inserisce altre mutazioni. Il plasmide che non contiene

la mutazione e che devo eliminare viene digerito con enzimi che riconoscono

solo il dna metilato.

A cosa serve?

La RAB 27 nella forma wide type si trova in vesciole. Se la mutiamo ( in

posizioni ben precise) viene persa la sua localizzazione nelle vescicole.

Sempre su questo discorso possiamo studiare approcci additivi o sottrattivi. Per

il sistema di sotrazione ( eliminare l'espressione della proteina) possiamo usare

diversi approcci:

tecnologia dell'rna interferente

– utilizzo di antisenso

– sistema del dominante negativo

–

quest'ultimo è un approccio in cui introduziamo una mutazione nella proteina e

se la proteina fa parte di un complesso la proteina può formare un complesso

con le proteina attiva e inattivare l'intero complesso. In questo caso si parla di

funzione dominante negativo.

Uno dei mutanti che fa perdere la localizzazione di RAB27 funzione da

dominante negativo. Il mutante di RAB27a , ovvero T23N.

Quando abbiamo una mutazione,il mutante che funge da dominante negativo va

a sostituirsi alla proteina wild type nelle vescicole.il dominante negativo è

proprio il fatto quindi che la proteina mofidicata faccia perdere la funzione alla

wild type.

Approccio antisenso

possiamo utilizzare sempre un vettore dove all'interno possiamo avere una seq

di dna che può essere sintetizzata a rna. Questo rna è antisenso cioè

complementare all'rna m presente nella cellula. Il doppio filamento di rna viene

degradato. Si possono utilizzare anche degli oligonucleotidi antisenso sintetici (

con 5' e 3' primo mdificati). Avviene la degradazione perchèè; il compleso

proteicono viene riconosciuto dal dicer che degrada il filamento. Il complesso

risc taglia e riconosce le seq, degradandola.

STUDIO DELL'INTERAZIONE TRA PROTEINE

ci sono diversi sistemi. Quello più utilizzato è quello del doppio ibrido nel

lievito,in vitro oppure in vivo cioè nella cellula.

Un altro metodo è quello del phage display.

Intereazione delle proteine:

la GST è uno dei tag che può essere utilizzato nelle purificazione ma può essere

anche utilizzato per studiare l'interazione tra proteine. Sulla sup. delle sfera

abbiamo del glucatione che viene riconosciuta dall glucatione s transferasi

.poichè la GST è in grado di rinoscere il glucatione rimarra' adesa. In qst

sistema possiamo aggiungere un estratto cellulare ( prendiamo altre cell le

lisiamo e il lisato lo mettiamo a contatto della proteina fissata alla matrice).

Laviamo via le proteine non legate. A qst punto dobbiamo staccare il complesso

dalla matrice quindi aggiungo il glucatione, avviene quindi una competizione. Il

glucatione libero sarà più appetibile per il complesso che si infine si stacca. Il

complesso proteico purificato potrà essere identificato tramite spettrometria di

massa o altro.

Un altro sistema è la co immuno precipitazione. Qui si utilizzano anticorpi

contro la proteina di interesse. Possiamo lisare le cell, immuno precipitare,

l'anticoprpo recluta la proteina. Qst anticorpo può essere fatto legare ad una

matrice di agarosio, quindi tutto il nostro complesso lo troviamo agganciato ad

una matrice perchè vogliamo isolare il complesso , laviamo tutto ciò che non ci

interesa e purifichiamo il nostro complesso proteico. Viene analizzato tramite

western bloth.( gel di poliacrillamide in cui le proteine vengono denaturate

grazie alla presenza di SDS che confersce una carica. Trasferisco quindi da un

gel ad una membrana di nitro cellulosa le proteine. La membrana può essere

ibridata con un anticorpo.)

lo studio delle interazioni può essere fatto sempre utilizzando anticorpi ma

contro il TAG.

Doppio ibrido

utilizza delle proteine di fusione ( ESCA) formata da un dominio che lega il dna

e una parte di proteina. L'altra proteina si chiama PREDA ed è formata da un

dominio che vogliamo studiare e un altra di attivazione trascrizionale. Abbiamo

una seq regolatorio a monte di un gene reporter (luciferasi) all'interno della

quale c'è il sito di legame della proteina esca. Quando i due domini

interagiscono tra loro formano un complesso proteico per cui la rpteina esca si

lega al dna, interagisce con la preda che attiva la trascrizione. Il sistema del

doppio ibrido è un sistema che utilizza tra plasmidi: uno contiene il gene

reporte ele altre due esprimono la proteina esca e preda. Formano un complesso

attivatorio se l'esca e la preda interagiscono. In questo caso creiamo una

proteina di fusione.

Quando il gene reporter è espresso ho un istogramma molto alto che mi dice

che le proteine stanno interagendo. Si inserisce un mutante di NFACT per

vedere se anch'esso interviene.

Fret

fusione di proteine della famiglia della GFP. Qst sistema è un sistema che

sfrutta l'energia di trasmissione della fluorescemza. Abbiamo due proteine x e y

fuse con una proteina fluorescente blu o verde. Se la proteina x viene eccitata da

una luce violette emette blu. Se la proteine interagiscono emettono luce verde.

Se ho i due fluorocromi all'estremità della proteina solo quando interagiscono

ottengo un segnale.

È stato dimostrato il cambiodi conformazione dei recettori estrogeni. Il cambio

di conformazione è legato al tamoxifen. Grazia alla fret si è studiata il cambio

del recettore in diverse condizioni.

L'N corrisponde all'asparagina.

I mutanti delle proteine vengono indicati con le single degli aa ( solo con le

lettere) la prima lettera corrisponde all'aa presenta nella wite type neòòa

posizione 23, l'ultima lettera corrisponde a quale aa abbiamo introdotto in

alternativa. La scelta dell'aa che si introduce in sostituzione di quello wyte type

ha un significato ben preciso. L'aa con cui si fanno le sostituzioni non è casuale.

Come si sostituisce un aa nella sequenza?

Quando vogliamo sostituire un aa dobbiamo sostituire il dna. Cioè sostituire le

triplette sul dna che si ripercuoteranno sull'rna messaggero con la sostituzione

dell'aa corrispondente. I primer che noi sintetizziamo devono contenere il

codone modificato all'interno per consetire di ottenere una proteina mutata in

posizione 23.

METODI DI STUDIO DELL'ESPRESSIONE GENICA

per studiare un singolo gene o metodi per studiare più geni

contemporaneamente.

Partendo da un gene si nota al monte del gene possiamo avere il complesso di

regolazione della trascrizione che induce l'esp