Laboratorio biomolecolare

Manipolazione di sequenze di DNA

Elementi del DNA

DNA genomico: RNA messaggero per ottenere proteine, RNA non codificanti (nucleo o citosol).

Elementi regolatori: possono trovarsi distanti dai geni e possono essere riconosciuti da fattori trascrizionali (proteine).

Encode: prima banca dati che racchiude tutte le caratteristiche del genoma umano (Genome Wide Studios).

Clonaggio del DNA

Per poter manipolare piccole quantità di DNA si utilizza il plasmide. Grazie agli enzimi di restrizione:

• Inserisco il DNA nel plasmide formando un plasmide ricombinante che può essere inserito nei batteri che ne producono grandi quantità.
• I batteri vengono piastrati.
• Crescono colonie singole; ottengo quindi dei cloni.
• Purifico il DNA.

A cosa serve il clonaggio del DNA? DNA vertebrato: 3-4 x10 alla nona bp (1 millionesimo), da questa quantità possono ottenere 1 pg del frammento specifico quindi piccole quantità. Clonare ci permette di ottenere grandi quantità, in alternativa uso la PCR (a patto che io conosca il primer).

PCR

Ho un frammento di DNA. Grazie al primer posso ottenere grandi quantità dei cloni successivi.

Clonaggio

Parto dal DNA donatore, scelgo un frammento, lo inserisco nel vettore ottenendo un DNA ricombinante che inserisco in un ospite.

Vettori

Sono strutture a doppio filamento dove notiamo: i geni della resistenza che servono a selezionare i batteri.

• Tipi di vettori: naturali, trasposomi, plasmidi, virus, batteriofagi (fagi).

Replicazione plasmide

Hanno un'origine di replicazione, grazie alla formazione di una forcella che si apre, ottengo 2 plasmidi. Esistono diversi batteri che riescono a produrre tante copie o poche copie.

Come fa il batterio a controllare il numero delle copie?

• Sintetizza 2 molecole di RNA.
• Formazione di un ibrido con il DNA.

Possiamo avere quindi:

• Plasmidi rilassati: che producono più copie.
• Plasmidi stringenti: che producono una singola copia.

Il tipo di meccanismo di controllo definisce il gruppo di compatibilità. Se i plasmidi sono differenti c'è un principio di esclusione, cioè viene ereditato un solo plasmide.

Selezione clonale

Si utilizzano i marcatori di selezione che codificano enzimi che conferiscono resistenza ai comuni antibiotici:

• Ampicillina
• Cloramfenicolo
• Tetraciclina
• Kenamicina

Questi antibiotici inibiscono la sintesi proteica. Prendo il plasmide e lo faccio crescere in terreno agar che contiene tetraciclina. Non tutte le molecole di DNA entrano nel plasmide, quindi faccio una doppia selezione. La selezione con antibiotico ci permette di eliminare il batterio che non ci interessa.

Sistema di selezione blue-white

Richiede il gene Lac-Z che codifica per l'enzima beta-galattosidasi. Substrato: X-Gal metabolizzato dalla beta-galattosidasi diventa verde. Il Lac-Z viene usato per riconoscere le colonie ricombianti e al suo interno esiste il sito multiplo di clonaggio in cui inserisco il gene d'interesse. Il plasmide senza inserto viene inserito nel batterio e sono prodotte le subunità Lac-Z e viene prodotto il frammento alfa e omega che produce la beta-galattosidasi attiva. Semino su agar e le colonie diventano blu perché l'X-Gal libera il suo cromogeno. Il plasmide con inserto, invece, viene inserito nel batterio. Alla beta-galattosidasi manca una subunità ed è inattiva. La colonia ricombinante sarà quindi bianca.

IPTG

Induttore (serve per indurre il gene della beta-galattosidasi). Senza IPTG la beta-gal non è prodotta, viceversa invece viene prodotta. Tanta beta-gal può essere tossica per il batterio. Il Lac-Z fa parte di un complesso di geni (operone LAC) e sono:

• Lac-Z
• Lac-Y
• Lac-A
• Lac-I

La colonia bianca è la colonia ricombinante.

Inserimento del DNA nel plasmide

Partiamo da un DNA donatore, si usano le endonucleasi di restrizione e le ligasi. I siti multipli di clonaggio variano da vettore a vettore e sono oligonucleotidi all'interno della quale ci sono i siti di restrizione.

Enzimi di restrizione: endonucleasi di tipo II che tagliano il DNA; riconosco siti specifici che chiamo palindromici. I siti che possiamo ottenere sono:

• Blunts: estremità nette
• 5' Hoverhangs: dove l'estremità 5' è sporgente
• 3' Hoverhangs: dove l'estremità 3' è sporgente

L'enzima di restrizione rompe un ponte fosfodiestere. Condizioni che influenzano l'attività enzimatica:

• Composizione del buffer peculiare per ciascun enzima
• Temperatura: 37°C
• Sensibili alla metilazione: se il sito è metilato l'enzima non lo riconosce
• Contaminanti del DNA: gli enzimi non riescono a lavorare
• Contesto del sito di taglio

Il polylinker è sintetico e può essere anche il gene d'interesse. La ligasi ripristina la rottura consumando ATP. La ligasi funziona sia sulle sticky end che sulle blunts. Su quest'ultime lavora con efficienza più bassa perché manca l'appaiamento delle basi. Per la ligasi le condizioni che influenzano sono:

• La temperatura: 16°C
• Concentrazione del DNA: rapporto vettore/inserto (in genere si mette più inserto) la concentrazione delle molecole deve essere equimolare
• Contaminanti del DNA: che inibiscono le ligasi
• Tampone di reazione: c'è ATP e non deve essere degradato

Per fare legare due frammenti tagliati con enzimi diversi, esistono enzimi che formano frammenti. Il frammento di Klenow della DNA polimerasi I di E. coli è privo di attività 5'-3' esonucleasica. Può trasformare le due estremità da sticky a blunt. La fosfatasi alcalina rimuove i gruppi 5' fosfato.

Gli svantaggi:

• Serve più plasmide
• Non è una reazione efficiente
• Si formano dei nick (punti in cui si rompe il doppio filamento)

Plasmide del batterio - Trasformazione batterica

Tre meccanismi diversi:

• Chimico (più usato): shock termico, viene utilizzato il CaCl₂
• Elettroporazione
• Fagi

I batteri sono competenti quando esprimono proteine che riconoscono il plasmide. Lo shock termico permette l'acquisizione del plasmide. I batteri vengono incubati con CaCl₂ a freddo. Elettroporazione: cuvette a cui viene applicato un campo elettrico che consente l'entrata del plasmide.

Batteriofagi

Destinato alla manipolazione dei grandi batteri. I batteriofagi hanno una capsula formata da una testa e una coda. Aderisce alla parete del batterio per via:

• Lisogenica
• Ciclo litico

Se il fago procede per via lisogenica si ha integrazione con il DNA fagico nel cromosoma di E. coli. I batteriofagi consentono l'amplificazione del gene d'interesse.

Vettori di clonaggio

Esistono vari tipi di vettori:

• BAC: derivati dal plasmide F
• PAC: derivati dal fago P1
• YAC: vettori di lievito
• Cosmidi: elementi ibridi tra fagi e plasmidi che possono circolare

Cosmidi (cos-plasmidi): hanno un'origine di replicazione, una resistenza, siti cos, un polylynker, frammenti del DNA genomico che entrano all'interno del vettore legati tramite ligasi. Le particelle fagiche permettono l'infezione dei batteri. Quando il batterio acquisisce il plasmide, acquisisce la resistenza.

YAC

Yeast artificial chromosome: la peculiarità è che questo lievito sfrutta la replicazione degli eucarioti e degli elementi telomerici e centromerici.

BAC

Bacterial artificial chromosome: resistenza al cloramfenicolo. Possiamo creare una particella molto grande; grazie all'elettroporazione c'è l'entrata della particella.

Clonaggio batterico

Possiamo inserire una sequenza di DNA derivata da:

• PCR
• Subclonaggio sintetico
• Clonaggio di DNA complesso: librerie genomiche, librerie cDNA (derivano dagli RNA), libreria mutagenesi, librerie con oligonucleotidi random.

Librerie genomiche

Lego i frammenti di DNA all'interno di un vettore creando così delle librerie genomiche.

Librerie cDNA

Si utilizzano dei linker dove sono presenti dei siti di restrizione che vengono legati al cDNA che permette il clonaggio. Possono essere quindi inseriti nel vettore. Ciascun batterio avrà un solo plasmide al suo interno, questo ci permette di creare una libreria. Le librerie servono a riconoscere un frammento specifico. Isoliamo l'RNA, piastro. Per riconoscere i vettori:

• Se conosco la sequenza uso la PCR
• Se non la conosco uso gli enzimi di restrizione

Una libreria deve essere rappresentativa, di diverse ampiezze (non possono essere troppo piccole), hanno diversi tipi di frammentazione, numero di cloni. I cloni possono avere sequenze adiacenti o sovrapposti.

Frammenti non sovrapposti

Il DNA genomico viene tagliato e ciascuno è distinto dall'altro.

Frammenti sovrapposti

Le sequenze hanno parti in comune.

Tipi di frammentazione

• Frammentazione meccanica: tramite sonicazione che ci permette di ottenere sovrapposti. La frammentazione è casuale.
• Dnasi: taglia casualmente il DNA. La frammentazione è casuale e lo svantaggio è che la Dnasi crea frammenti troppo piccoli.
• Enzimi di restrizione: possono agire con digestione parziale. È il metodo più utilizzato perché permette un facile clonaggio.

Per ridurre il numero di frammenti si utilizza la digestione parziale. La colonia può essere amplificata ottenendo così grandi quantità di frammenti. A seconda della dimensione del frammento avremo la libreria di dimensioni diverse.

Libreria a cDNA

DNA complementare a partire dall'RNA. L'RNA viene estratto e purificato dalle cellule. L'mRNA viene purificato grazie alla coda del poliadenilato. Il poliadenilato può innescare la sintesi di una copia di DNA grazie all'enzima trascrittasi inversa.

Come si crea il cDNA: ho un primer oligo dt. La trascrittasi inversa riesce ad avere dall'RNA una molecola di DNA. Si crea un doppio filamento. La nucleasi crea delle estremità nette. Utilizziamo quindi gli oligonucleotidi (frammenti a doppio filamento che contiene un sito di restrizione). La ligasi lega il linker cDNA. Il linker si legano alle estremità blunt. Gli enzimi di restrizione ci fanno ottenere estremità sticky più facile da clonare.

Identificazione clone ricombinante

Se partiamo da una libreria genomica: screening, PCR, restrizione, sequenziamento. Per ibridazione:

• Possiamo operare per analogia di sequenza (avere la stessa sequenza in un'altra specie).
• Identificazione parziale della sequenza peptidica.
• Operare tramite espressione (ci sono plasmidi che permettono espressioni proteiche).

1. Sulla piastra faccio aderire un filtro e una parte di batteri rimane adesa al filtro. Se liso i batteri, dal loro interno uscirà il DNA che poi verrà denaturato. Utilizzo poi una sonda marcata che ibrida la sequenza omologa sui cloni. Riuscirò a riconoscere il clone di origine sul filtro.

Ibridazione

Un gene A produce una sonda (prob). Posso operare in due modi:

• Ibridazione ad alta stringenza: impongo che i due filamenti siano appaiati. Formammide a 42°C.
• Ibridazione a bassa stringenza: formammide a 35°C. Se tengo una temperatura bassa i movimenti molecolari sono di più quindi non ho un appaiamento perfetto. Posso avere più molecole ibride.

Come si marcano le sonde: inserimento dei nick, random primer, estensione degli enzimi di restrizione, end-labeling, PCR. Nick: ho un doppio filamento di DNA, uso la DNAasi a bassa concentrazione. In corrispondenza dei tagli lavora la polimerasi. Random: denaturazione, appaiamento. Vengono utilizzati come innesco per la sintesi del nuovo nucleotide.

Clonaggio per omologia

• Avere una sequenza omologa

Recettori tirosina chinasi: se isolo i domini dei RTK posso riconoscere altri membri. Isolando la regione che conosco posso fare lo screening del DNA. Proteine come il gene dell'albumina di topo. Una proteina nota può aiutarci a riconoscere un'altra proteina (la stessa) in un'altra specie.

Omologia

Possiamo cercare un'analogia allineando due sequenze di aa e trovare gli aa comuni delle due sequenze. L'omologia può essere cercata direttamente sulle sequenze nucleotidiche. In questo caso confronto direttamente le sequenze. L'omologia in genere è più alta nelle sequenze aminoacidiche perché una tripletta può modificare più geni.

Sintesi di oligonucleotidi

Si utilizzano dei sistemi chimici. Vengono modificate le estremità in modo tale che l'oligo venga inserito in modo preciso. Le posizioni 3' è modificata con il diisopropilfosforamidite. Il 5' viene modificata con il dimetossitritile. Le estremità reagiscono e si forma un ponte fosfodiestere. Con la dietrilazione si ha la liberazione del 5'.

In sintesi: il metile del 3' si aggancia con il gruppo OH del 5' del nucleotide precedente formando il ponte fosfodiestere. Per liberare il 5' si utilizza l'ossidazione con iodio e deotrilazione.

Come possono essere manipolati i batteri?

La colonia può essere conservata o amplificata all'infinito su piastra agar dove si possono isolare le singole colonie, oppure cresciute in terreno liquido con la presenza di glicerolo utilizzando:

• Un terreno piccolo (3-5 ml) avendo quindi un plasmide dell'ordine dei microgrammi (MINIPREP)
• Un terreno di coltura di 100 ml o 1L a 37°C overnight, ottenendo un plasmide in quantità superiore al microgrammo (MAXIPREP)

Il terreno di coltura utilizzato è: LB MEDIUM (Luria Berta) composizione:

• Triptone: composizione di peptidi che derivano dalla digestione della caseina grazie alla tripsina
• Estratto di lievito
• NaCl
• pH 7.0

Una volta prodotto, il terreno deve essere autoclavato (porto ad alta temperatura per eliminare muffe e batteri). Il terreno poi può essere conservato a temperatura ambiente o addizionato con antibiotici. Paste agar: ad alta temperatura si presentano liquide, mentre a temperatura ambiente diventano solide.

Per poter manipolare i batteri possiamo manipolare diverse quantità di DNA.

• Manipolazione del gene stesso di DNA: fusione, delezione, mutazioni
• Determinazione delle sequenze nucleotidiche
• I vettori possono essere utilizzati in: cellule animali e vegetali, lieviti, animali e piante transgenici e terapia genica.

Manipolazione DNA plasmidico

Ciascun clone può essere prelevato con ansa batterica. Una volta prelevata la colonia si trasferisce in un terreno liquido. Ciascuna provetta avrà la sua colonia. Il terreno liquido viene tenuto in movimento per mantenere una certa areazione nella coltura e per mantenere i nutrienti in movimento. Si hanno, con questo metodo, 4 mila miliardi di cellule.

Crescita batterica

La crescita batterica si descrive con la curva sigmoide. Si ha una fase esponenziale dove i batteri crescono. Una fase di crescita esponenziale dove i batteri raggiungono il picco di crescita e una fase di fine crescita per mancanza di nutrienti.

Purificazione DNA plasmidico

Abbiamo:

• Parete
• Genoma
• Plasmidi

Rompo la parete con il sodio adenil fosfato. Il genoma e il plasmide vengono denaturati con NaOH che separa la doppia elica e rompe i nucleotidi. Si utilizza poi un soultingh out: si aggiunge l'acetato di potassio che fa precipitare i lipidi e le proteine. Tramite centrifugazione ritroviamo in soluzione il DNA plasmidico. Per ottenere il DNA o l'RNA puro si usa soluzione organica di fenolo cloroformio (pH basico per il DNA, pH acido per l'RNA). Si applica una centrifugazione e ottengo così una fase superiore di DNA o RNA. Con una pipetta prelevo la fase superiore e la trasferisco in una provetta nuova. Aggiungo un volume doppio di etanolo a freddo e centrifugo ottenendo un pellet di RNA o DNA. Elimino il surnatante, effettuo un lavaggio, centrifugo, faccio asciugare all'aria e infine aggiungo un buffer per portare il DNA o RNA in sospensione.

Purificazione fenolo-cloroformio

È un metodo molto efficiente ma cancerogeno. Un altro meccanismo di purificazione in alternativa al fenolo cloroformio: sono state utilizzate delle colonnine all'interno del quale è presente una matrice. Grazie alle colonnine posso aggiungere il DNA che si lega alla matrice. Cambiando la forza ionica il DNA viene staccato ed eluito quando effettuo il lavaggio le proteine sono le prime ad uscire dalla colonna.

Riconoscimento DNA

Si utilizza il bromuro di etidio che si inserisce nella doppia elica ed è fluorescente. È cancerogeno ed è stato eliminato dai laboratori. Ora si usa una nuova classe di sostanze che sono meno invasive: SYBR SAFE (cromogeniche consentono di vedere il DNA quando viene esposto alla luce).

Altro sistema di purificazione: cloruro di cesio

Si effettua una purificazione assoluta. Si carica sul surnatante il CsCl e centrifugo per 40 ore. Si forma un anello (DNA) che viene prelevato con una siringa. Una volta purificato si conclude con un'analisi di restrizione con enzimi di restrizione visibili sul gel.

Mappa di restrizione

Mappa che ricostruiamo perché conosciamo la posizione degli enzimi di restrizione. In base all'enzima avrò lunghezze diverse dei frammenti.

Sequenziamento DNA

Riconosce la sequenza.