Laboratorio biomolecolare

Metodi e applicazione del DNA ricombinante

Clonaggio del DNA

Se prendiamo il DNA di un vertebrato, abbiamo un genoma della grandezza di circa 3-4 x 10⁹ bp. Supponiamo di volere isolare un frammento di 3-4 Kb, un milionesimo del genoma totale. Partendo da un µg di DNA da 3-4 x 10⁹ bp, il nostro frammento specifico sarà 1 pg, quindi una quantità difficile da maneggiare e studiare. La tecnologia del clonaggio ci aiuta a disporre di una grande quantità di copie del frammento di DNA che vogliamo studiare. Riusciamo ad ottenere grandi quantità del nostro frammento perché, introdotto in un vettore, può essere acquisito da un batterio che, moltiplicandosi, genera una grande quantità di copie del nostro frammento. Un’altra tecnica, oltre al clonaggio, è la PCR, che ha la stessa funzione: grazie a cicli ripetuti di amplificazione, riusciamo ad avere una grande quantità di una molecola target. L’unica differenza è che il clonaggio permette anche di manipolare il DNA, consentendo diverse applicazioni.

Tipi di DNA che possiamo clonare

• Geni: DNA che codifica per trascritti da cui potranno avere origine le proteine.
• Non coding RNAs: DNA codificante per trascritti non codificanti.
• Regioni genomiche regolatrici: regioni del genoma che non codificano per i geni, ma sono necessarie per regolare la trascrizione dei geni, quindi l’espressione genica della cellula. Non danno nessun prodotto diretto ma contribuiscono alla regolazione delle funzioni biologiche cellulari.

Molecole ricombinanti

Per quanto riguarda i geni, il clonaggio permette di studiare la struttura e funzione della proteina, il suo ruolo nella trasduzione del segnale e la sua localizzazione. Per quanto riguarda i non coding RNAs, il clonaggio permette di studiarne l’espressione e la funzione. Infine, gli elementi regolatori. Il DNA è impacchettato nel nucleo insieme agli istoni e alle proteine formando la cromatina (struttura compatta). Se districhiamo la cromatina, troviamo diverse regioni. I geni (tra cui promotori ed enhancer) sono regolati da regioni regolatrici che possono essere localizzate più a valle o a monte del promotore. I geni possono essere trascritti e si possono ottenere trascritti primari, ovvero RNA lunghi che possono essere processati. Il processo di maturazione dell’RNA porta a diversi trascritti proteici che hanno ruoli diversi nelle cellule. Ciascun tipo di cellula può sfruttare in modo diverso il genoma.

Studi di genomica

Gli studi di genomica riguardano l’intero genoma e ci permettono di conoscere tutte le caratteristiche del genoma (proteine, trascritti no coding, ecc.) in ciascun tipo cellulare. I genome wide studies sono gli studi delle funzioni delle diverse parti del genoma e si effettuano all’interno di ENCODE (database all’interno del quale vi sono informazioni sul genoma umano). Questi studi ci permettono di dire quali geni sono trascritti in ciascun tipo cellulare, quali modificazioni istoniche ci sono e quali fattori di trascrizione intervengono. Dal punto di vista tecnologico, si sfruttano queste informazioni per il clonaggio, che si attua attraverso diverse tappe: isolare il frammento da clonare, inserirlo in un vettore dando origine ad un ricombinante e inserirlo in una cella batterica che lo trasferirà alla progenie. Otteniamo quindi un gene amplificato o una proteina amplificata. Il primo viene usato per la ricerca scientifica, nell’industria medica, farmacologica e alimentare. Il secondo viene usato per ricerca scientifica, industria medica e farmacologica, pesticidi/insetticidi o per creare piante resistenti.

Tappe del clonaggio

• Inserire il DNA di interesse in un vettore.
• Incubare la particella ricombinante in un batterio (trasformazione/trasfezione batterica) che può moltiplicarsi per passare il gene alla progenie o dare tante copie del gene.
• Scelta dei cloni che hanno acquisito il vettore.
• Crescita dei cloni ricombinanti e purificazione del DNA di interesse.

Vettore di clonaggio

Il vettore usato per il clonaggio ha elementi essenziali che lo caratterizzano e sono indispensabili per il suo funzionamento; essi sono:

• Origine di replicazione (ORI).
• Marcatori di selezione (ad esempio il gene di resistenza alla penicillina e tetraciclina).
• Siti di restrizione.

I vettori di clonaggio possono essere plasmidici, ma non solo; abbiamo anche i trasposoni, batteriofagi o virus. Tutti questi vettori sono presenti in natura e sono stati sviluppati i loro meccanismi molecolari per poterli sfruttare in quest’applicazione. Vi sono però anche i vettori artificiali come i cosmidi, BAC, YAC e vettori virali/retrovirali. La prima grande differenza fra tutti questi vettori è la loro capacità di accogliere il DNA esogeno. In realtà, i plasmidi possono accettare massimo 5 kb di DNA esogeno, quello scritto in tabella è solo un valore teorico.

Replicazione plasmidica

Il plasmide è un elemento circolare di DNA che può replicarsi in corrispondenza delle ORI (siti di origine di replicazione). In corrispondenza delle ORI si crea una forcina che apre il plasmide e permette di ottenere due molecole plasmidiche. Esistono due tipi di plasmidi: ad alto numero di copie e a basso numero di copie. I primi vengono replicati nel batterio in un numero elevato e vengono trasferiti alle cellule figlie. Questo tipo di plasmide permette di avere un numero elevato di molecole che contengono il DNA di interesse, quindi se l’obiettivo è avere un elevato numero di proteine (ad esempio se vogliamo produrre insulina), usiamo questo plasmide. Nel caso in cui l’obiettivo del clonaggio sia quello di studiare la funzione di una proteina all’interno della cellula, non è vantaggioso usare un plasmide ad elevato numero di copie, perché producendo molte proteine si sbilancia la fisiologia del batterio. Quindi, se vogliamo studiare la funzione delle proteine, usiamo i plasmidi a basso numero di copie. Essi danno origine solo a due molecole che vengono trasferite ognuna in una cellula figlia.

La differenza tra i plasmidi ad elevato numero di copie e a basso numero di copie consiste nel meccanismo di controllo del numero di plasmidi del batterio. Esistono diversi sistemi di controllo:

• Abbiamo un’origine di replicazione affiancata da una sequenza di DNA (RNA II) che viene trascritta da una proteina (RNAP) e sintetizza RNA II. Questo trascritto può formare un ibrido DNA-RNA in corrispondenza dell’origine man mano che viene trascritto. Quando è presente questo ibrido, una molecola di RNAsi H (un’altra proteina) crea dei nick (tagli) in corrispondenza dell’RNA. Questi frammenti di DNA rappresentano l’innesco della DNA poli I per sintesi della nuova molecola. Se non si forma l’ibrido, non parte la replicazione del plasmide.
• Questo sistema è sempre basato sull’ibrido DNA-RNA in cui però ci sono diverse sequenze (RNA I e II) che si sovrappongono all’ORI. All’interno di questo plasmide c’è la proteina Rop che favorisce la formazione di ibridi tra RNA I e II. Quando si formano questi ibridi, essi sono talmente legati che non si ha la replicazione. Viceversa, se l’RNA II forma un ibrido in corrispondenza della ORI, allora l’RNA rappresenta l’innesco per la sintesi del DNA complementare e quindi la replicazione del plasmide. L’intervento della proteina Rop determina il numero di copie del plasmide.

A seconda dei meccanismi di controllo del numero di copie, possiamo parlare di plasmidi rilassati (che formano più copie) e plasmidi stringenti (una sola copia). Ciascun batterio conserva solo un tipo di plasmide, cioè il batterio tollera solo un tipo di plasmide ed esso verrà replicato ed ereditato dalle cellule figlie. Se dovessero essere presenti più tipi di plasmide, le cellule figlie ereditano solo un tipo. Questo garantisce la clonalità, cioè ogni clone ha un solo tipo di plasmide. Questo perché trasformiamo batteri che non contengono plasmidi, quindi la cellula ha dei meccanismi per il riconoscimento di plasmidi e quale far replicare.

Selezione dei batteri che hanno acquisito i plasmidi

La selezione dei batteri viene effettuata attraverso antibiotici. Trattando i batteri con antibiotici, sopravvivono solo quelli che hanno acquisito il plasmide perché esso al suo interno ha i marker di selezione, ovvero frammenti di DNA che codificano per enzimi di resistenza agli antibiotici. Il plasmide resistente all’ampicillina ha al suo interno il gene che codifica per l’enzima β lattamasi. Per ciascun antibiotico c’è un enzima contro di esso. Questi enzimi (o coenzimi) distruggono l’antibiotico evitando che esso inibisca la sintesi proteica e uccida il batterio.

Gli antibiotici β lattamici (ve ne sono molti perché i batteri possono sviluppare una resistenza naturale contro gli antibiotici) vengono metabolizzati dalla β lattamasi. Questo enzima rompe gli anelli della molecola rendendo l’antibiotico inefficace. Quando trasformiamo un batterio (di solito ceppi di E. coli che non contengono altri plasmidi), lo incubiamo insieme al plasmide, ma non tutti i batteri sono capaci di acquisire il plasmide. Di conseguenza, avremo una cultura mista in cui ci saranno dei batteri che hanno acquisito il plasmide e altri no. Per poter eliminare i batteri che non hanno il plasmide, si usa la selezione. Ciò significa che la cultura batterica verrà piastrata su una piastra di agar che contiene un antibiotico. Quindi, tutti i batteri che non hanno acquisito il plasmide muoiono.

Prima di poter accogliere il plasmide, però, i batteri devono essere resi competenti, ovvero prepararli ad internalizzare il plasmide. Uno dei metodi è l’utilizzo di cloruro di calcio, in presenza del quale i batteri acquisiscono delle capacità sulla parete batterica che permettono loro di internalizzare il plasmide. Dopodiché possiamo avere batteri che non hanno acquisito il plasmide oppure quelli che hanno acquisito il plasmide. Tra questi ultimi, però, ci sono anche i plasmidi non ricombinanti, ovvero quei plasmidi che non hanno acquisito il frammento di interesse. Quindi, in realtà, abbiamo tre popolazioni diverse. L’acquisizione del plasmide è casuale e non è ad alta resa in quanto i batteri non sono inclini ad acquisire materiale esogeno.

Per poter selezionare il batterio col plasmide ricombinante, dobbiamo effettuare una doppia selezione, ciò è possibile perché il plasmide può contenere più di un gene di resistenza, ognuno dei quali può contenere i siti di restrizione. All’interno di uno dei due geni di resistenza possiamo inserire il DNA di interesse. Quindi ho un gene di resistenza intatto e uno che può essere interrotto dal DNA. I plasmidi che hanno la doppia resistenza non sono ricombinanti, mentre quelli che hanno una resistenza sola sono ricombinanti. La prima selezione ci permette di eliminare i batteri che non hanno acquisito il plasmide, la seconda, invece, ci permette di eliminare i batteri non ricombinanti (perché hanno solo una resistenza), quindi possiamo confrontare le due piastre e selezionare i batteri ricombinanti (che saranno presenti solo nella prima piastra).

Ci sono però altri metodi per selezionare il plasmide ricombinante: lo screening blu-bianco. Il principio su cui si basa questo metodo è il gene LacZ che codifica per la β galattosidasi. Esso è interrotto, cioè al suo interno è presente un sito di clonaggio che non altera l’enzima ma ci permette di inserire il gene di interesse. In più, continua ad essere presente il gene di resistenza per l’ampicillina che ci consente di selezionare i batteri che hanno acquisito il plasmide. Il gene della β galattosidasi è presente nei batteri ed è usato per il metabolismo del lattosio. I batteri che crescono in un terreno con lattosio possono assorbirlo e metabolizzarlo grazie all’enzima che scinde il lattosio in galattosio e glucosio. Il gene lacZ si trova all’interno dell’operone lac insieme a lacY (codifica per la lattosio permeasi che permette l’assorbimento di lattosio), lacA (codifica per l’atiogalattoside transacetilasi di cui ancora non è ancora bene conosciuta la funzione) e lac I (codifica per il repressore di lac). In corrispondenza del sito di inizio della trascrizione può legarsi il repressore lac, impedendo all’RNA poli di trascrivere questi geni. Quando è presente il lattosio ed entra nella cellula, esso è in grado di legarsi alla proteina lac repressore e farla staccare dal sito di inizio della trascrizione. Quando il repressore lascia il sito di inizio trascrizione libero, l’RNA poli inizia a scorrere.

Nel sistema di selezione blu/bianco, nel terreno di coltura dei batteri inseriamo X-Gal, una molecola molto simile al lattosio, ma con un vantaggio notevole. Quando X-Gal viene scisso, crea un gruppo cromogeno di colore blu. Però dobbiamo ingegnerizzare anche il repressore, perché esso si stacca dal sito di inizio della trascrizione solo in presenza di lattosio. Al posto di usare il lattosio, si usa l’IPTG (isopropil tiogalattoside) che svolge la stessa funzione del lattosio, ovvero si lega al repressore e lo stacca dal sito di inizio della trascrizione, facendo procedere così l’RNA poli e codificando l’enzima β galattosidasi. Quindi nel nostro terreno di coltura sarà presente sia X-Gal, sia IPTG. Se non fosse presente IPTG, X-Gal non sarebbe scisso, non produrrebbe il cromogeno e noi non potremmo selezionare le colonie batteriche. Ciò ci permette di creare un sistema inducibile, ovvero facciamo produrre la β galattosidasi al batterio solo quando forniamo IPTG. Il vantaggio di questo sistema è che non sovraccarichiamo il batterio dal punto di vista metabolico, ovvero facciamo produrre la proteina in un preciso momento e quindi i batteri crescono senza produrre la proteina, permettendo loro di dividersi, poiché la produzione di una proteina sovraccarica i batteri a discapito della divisione cellulare.

Noi inseriamo il DNA esogeno in corrispondenza del gene lacZ, quindi esso è interrotto e non potrà trascrivere l’enzima β galattosidasi. Facciamo la prima selezione (ovvero piastriamo i batteri in colture che contengono l’ampicillina) e otteniamo i batteri che hanno acquisito il plasmide. Con la seconda selezione otteniamo delle colonie blu e delle colonie bianche.

• Colonie blu: sono quelle che hanno scisso X-Gal e prodotto il cromatogeno blu; sono le colonie che non contengono il plasmide ricombinante.
• Colonie bianche: non hanno scisso X-Gal, quindi non hanno prodotto il cromatogeno blu, sono le colonie che contengono il plasmide ricombinante, perché il DNA esogeno è stato inserito in corrispondenza del gene lacZ, quindi il batterio non produce la β galattosidasi e di conseguenza non può scindere l’X-Gal.

La β galattosidasi è un enzima che può essere sintetizzato in due subunità: lacZ Ω e lacZ α. La prima viene integrata nel genoma del batterio per non rendere troppo grande il plasmide. La seconda subunità serve per attivare l’enzima, si lega ad Ω quando viene trascritta e non può essere interrotta dagli enzimi di restrizione perché i siti per questi enzimi sono posti in triplette diverse da quelle necessarie per la struttura del sito catalitico.

Come si inserisce il DNA di interesse nel plasmide?

Possiamo selezionare il nostro DNA target e inserirlo nel vettore usando due strumenti:

• Endonucleasi: enzimi che tagliano sia il vettore che l’inserto in particolari siti di restrizione.
• DNA ligasi: enzima che ripristina i tagli dando origine alla molecola ricombinante.

Gli enzimi di restrizione tagliano le molecole in particolari siti detti siti di restrizione, nel plasmide essi sono presenti nel sito multiplo di clonaggio o nei geni di resistenza agli antibiotici. Le endonucleasi usate per il clonaggio sono endonucleasi di restrizione di tipo II, ovvero prodotte da batteri che non hanno attività metil-transferasica. Di per sé, solo i batteri che producono enzimi di restrizione hanno attività metil-transferasica per proteggere il proprio genoma dai tagli, ovvero aggiungono un gruppo metile sui siti di restrizione del proprio genoma. Noi abbiamo ingegnerizzato questi batteri in modo che producano gli enzimi di restrizione, ma che non abbiano attività metil-trasnferasica in modo da lasciare libero il sito multiplo di clonaggio.

Gli enzimi di restrizione riconoscono dei siti specifici, ciascun enzima riconosce una precisa sequenza di nucleotidi, in particolare sono sequenze palindromiche, ovvero possiamo immaginare un asse di simmetria al centro del sito in cui i nucleotidi sono speculari, quindi l’enzima riconosce il sito su entrambi i filamenti di DNA. Ogni enzima taglia in modo diverso, ci sono enzimi che generano tagli blunt, ovvero estremità nette ed enzimi che generano tagli sticky (o protrudenti), ovvero con porzioni di nucleotidi che sporgono in 5’ (5’ overhand) o 3’ (3’ overhand). Tutto ciò ci permette di scegliere gli enzimi da usare.

Come scelgo gli enzimi di restrizione?

L’enzima di restrizione deve tagliare sia il vettore che l’inserto, ma deve tagliare l’inserto solo in un unico sito, cioè deve generare estremità uniche, non deve avere altri siti nella sequenza. Gli enzimi di restrizione interrompono il ponte fosfodiestere che si trova nella catena di DNA, lasciando una estremità 3’ con il gruppo ossidrile e una 5’ fosforilata.