Laboratorio biomolecolare

LIPOFAZIONE

Vengono usati liposomi. Questa è una tecnologia in via di sviluppo perché i liposomi (lipidi

modificati) hanno le teste o le code con gruppi attivi diversi per favorire l’acquisizione di

DNA. Quando i liposomi vengono messi a contatto con le cellule, si fondono con la

membrana e fanno acquisire il DNA alla cellule.

ELETTROPORAZIONE

È il metodo più invasivo perché si usa un campo elettrico che crea pori sulla membrana e

fa entrare il DNA. Il problema è che la membrana è disassemblata quindi la percentuale di

cellule vive è basse.

DAE-DESTRANO

È un reagente in grado di legare il DNA e ne permette l’acquisizione alle cellule (simile al

calcio fosfato).

Grazie agli elementi plasmidici possiamo inserire il gene. Il transgene, ovvero il gene che

può essere acquisito dalla cellula, deve avere un 5’ cap, una regione 5’ UTR ed una ORF

(la cornice di lettura che permette di sintetizzare la proteina), 3’ UTR e coda di poliA. A

monte del gene abbiamo il promotore.

Come sono costruiti i vettori usati per l’espressione del gene nelle cellule eucariotiche?

Abbiamo la regione regolatrice (promotore ed enhancer), il sito multiplo di clonaggio dove

troviamo i siti per gli enzimi di restrizione che ci permettono di inserire il DNA di interesse,

la sequenza di poliA, gene di resistenza e ORI. I plasmidi possono integrarsi nella cellula

ospite. Per poterli selezionare, i plasmidi possono avere un gene per la resistenza

specifico per le cellule animali (es neomicina). Dato che funziona solo per le cellule animali

avrà una regione regolatrice e poliA.

Quali sono le tappe che ci permettono di esprimere la proteina nella cellula animale?

Grazie al MCS facciamo un clonaggio, all’interno scegliamo un sito di restrizione che ci

permette di inserire il DNA. Una volta ottenuto il plasmide ricombinante, trasformiamo i

batteri di E. coli competenti. Dopo facciamo crescere le colonie e le selezioniamo tramite

l’ampicillina. Le colonie che sopravvivono verranno messe in un terreno liquido, qui

avremo l’amplificazione del plasmide e purificarlo con diversi metodi. In genere si usano le

colonnine che danno la miglior purezza. Il fenolo cloroformio si usa raramente perché

possono rimanere contaminanti tossici per le cellule. Adesso che abbiamo il plasmide

purificato trasfettiamo le cellule animali. Possiamo avere un’espressione transiente (12/72

ore) o integrazione del plasmide nel genoma. Se vogliamo un’espressione transiente,

tratteremo le cellule con neomicina dopo le 72 ore, mentre se vogliamo che il plasmide si

integri nel genoma, le trattiamo prima. Dopodichè purifichiamo la proteina di interesse

dall’estratto cellulare.

I possibili promotori del plasmidi sono costitutivi, cioè quando sono vicini ad un gene

legano sempre la polimerasi e permettono la sintesi continua della proteina. Abbiamo la

LTR, che deriva da virus animali ed è uno dei promotori più forti (cioè che è molto attivo e

viene prodotta una grande quantità di proteina), RSV, SV40, CMV. Il promotore è sempre

a monte del nostro gene di interesse. Dopo il promotore abbiamo l’MCS. Tra il promotore e

DNA di interesse può essere introdotto un introne.

La selezione avviene tramite neomicina, ma non solo.

Ci sono diversi modi per svolgere il clonaggio, possono essere usati anche vettori con

delle T sporgenti che permettono di introdurre dei prodotti di PCR. Abbiamo tanti vettori

perchè per ottimizzare l’efficienza i plasmidi sono stati modificati in base al tipo cellulare.

Ad esempio ci sono dei vettori che usano la 5’ UTR della β globina. Ci possono essere vari

elementi che aiutano a produrre il trascritto o la proteina.

La trasfezione nelle cellule può essere transiente o stabile, quando noi applichiamo una

selezione le cellule che non hanno integrato il plasmide nel genoma muoiono. Il fatto che il

plasmide si sia integrato nel genoma della cellula fa si che sia trasferito alle cellule figlie.

Nella trasfezione stabile, applicando una resistenza, eliminiamo tutte le cellule che non

hanno integrato il plasmide, quindi proliferano e sopravvivono solo le cellule che hanno

integrato il plasmide.

Nella trasfezione transiente invece abbiamo una coltura eterogenea in cui sono presenti

sia le cellule che hanno il plasmide sia quelle che non ce l’hanno, in questo modo abbiamo

la produzione della proteina per un arco di tempo preciso.

Oltre alla neomicina, vi sono altri antibiotici che inibiscono la sintesi proteica o creano

danni al DNA, il gene di resistenza li inattiva.

Ricapitolando, il nostro vettore di espressione ha un promotore, sequenze che permettono

la trascrizione e processamento del gene, MCS, ORI (indicata con f1 ORI se si tratta di un

fago), la cassetta del gene di selezione per l’integrazione nel genoma e il gene di

resistenza.

La popolazione selezionata esprime la proteina di interesse e grazie ad un’analisi

possiamo verificare, tramite PCR o Southern blot, se il nostro gene di interesse è stato

integrato nel genoma e dove.

EFFICIENZA DI TRASFEZIONE

Come facciamo a valutarla? In alcuni casi è importante valutarla senza ricorrere a processi

di selezione. Si ricorre ad una proteina fluorescente, la GFP. Essa è estratta dalla medusa

Acquorea ed è una proteina autonomamente fluorescente, quindi quando è espressa

all’interno della cellula, essa diventa verde. Sono stati creati mutanti della GFP, in

particolare si mutano i residui per il colore di fluorescenza per dare diversi colori. Nel

vettore, la GFP è introdotta tra IRES e il poliA. Se vogliamo valutare solo l’efficienza di

trasfezione, usiamo un vettore che contiene GFP. La sequenza IRES (internal ribosom

entry) viene creato un trascritto bicistronico. Prima abbiamo il trascritto della proteina di

interesse e poi quella della GFP, in questo modo è prodotto un unico trascritto ma con due

proteine diverse e nessuna delle due prevale sull’altra e le cellule non vengono

sovraccaricate. In questo modo quando il plasmide è acquisito dalla cellula, si identificano

sia le cellule trasfettate sia la localizzazione della proteina di interesse. L’IRES forma dei

loop per cui la traduzione avviene in modo consequenziale. La valutazione dell’efficienza

può essere quantificata.

COME SI CONTROLLA L’INTEGRAZIONE?

Tramite PCR quantitativa e Southern blot.

Southern blot: il DNA genomico viene estratto, SDS e fenolo cloroformio a pH basico, si

carica su gel d’agarosio che verrà sottoposto a campo elettrico e si produce una strisciata

unica perché ci sono frammenti di grandezza diversa. Il gel viene messo a contatto con

una membrana di nitrocellulosa e si crea un sistema a strati multipli e si crea una

pressione, per cui dal gel il DNA viene trasferito alla membrana di nitrocellulosa. A questo

punto si usano delle sonde marcate, cioè la sequenza complementare al DNA di interesse

e sulla membrana di nitrocellulosa si identificano i cloni che hanno integrato il plasmide nel

loro genoma. Si applica alta (totale complementarietà) o bassa stringenza (appaiamenti

anche non completamente complementari).

I plasmidi una volta acquisiti dalle cellule, vengono eliminati perché non possono essere

replicati all’interno delle cellule animali, a meno che non ci sia l’ORI SV40. Essa funziona

solo in cellule COS in cui è stato integrato nel genoma il gene per la proteina large T

antigen, che riconosce l’ORI SV40 e amplifica il plasmide nella cellula. Questo serve per

avere grandi quantità della proteina di interesse.

L’efficienza di trasfezione è bassa, ma ci sono linee cellulari (HeLa cell, HEK293T,

NIH3T3, CHO) che sono facilmente trasfettabili, quindi vengono usati per esperimenti in

cui si vogliono studiare proteine o processi molecolari. Per tutte le altre cellule è

necessario ottimizzare la trasfezione, cioè trovare il reagente giusto (che può essere il

calcio fosfato con diverse combinazione, la lipofezione) e il plasmide (dal tipo di promotore

inserito). Uno dei sistemi usato per migliorare l’efficienza di trasfezione per esprimere la

proteine per un breve tempo (cioè avere una linea stabile che però non esprima

continuamente la proteina), possiamo usare dei sistemi inducibili. Uno molto usato è

quello TET on/ TET off, cioè quello della tetraciclina. Nel caso del TET on, a monte del

gene di interesse abbiamo una sequenza TRE che associa una proteina ricombinante,

che, nel caso in cui non sia presente la tetraciclina o doxiciclina, non fa esprimere il gene

di interesse (funziona da repressore). Solo quando diamo alle cellule la doxiciclina, il

nostro repressore viene legato, si stacca e si avvia la trascrizione del gene. In realtà la

proteina può essere ingnerizzata in modo da poter avere il sistema della doxiciclina che

attiva o reprime il gene di interesse. Nel caso del TET off, invece, il repressore è legato al

promotore se è presente la tetraciclina o doxiciclina e viene staccato quando non si

fornisce uno dei due.

Il sistema può essere sia a monte che a valle.

Il vettore contiene anche dei tag che possono essere: epitopo c-myc (corta sequenza di

myc) oppure una serie di istidine. Essi

vengono usati per riconoscere la proteine

con Ab specifici oppure per purificarla.

Nell’articolo hanno purificato CD4, hanno

purificato la linea e selezionato dei cloni e

solo quando viene messa la tetraciclina si

ha l’espressione della proteina.

INFEZIONE VIRALE

È un altro sistema per introdurre DNA

esogeno in una cellula. Vengono usati

vettori virali che fanno da veicolo per il

nostro DNA di interesse sulle cellule target. Questo sistema è maggiormente studiato ed

utilizzato perché può essere usato per la TERAPIA GENICA.

Ci sono diversi tipi di vettori virali (a DNA o RNA) che derivano dai virus esistenti in natura.

La differenza tra adenovirus e retrovirus è la struttura del capside. A seconda delle

proteine del capside essi infettano una diversa cellula. Ogni proteina è specifica per un

tipo cellulare.

RETROVIRUS

Sono virus a RNA, esso è contenuto nel capside, una struttura complessa multistrato

composta da proteine. All’interno del virus troviamo la retrotrascrittasi che amplifica il

genoma virale, gag (proteine del primo involucro, sono di due tipi diversi quelle associate

alla membrana e quella che la costituiscono), env (proteine dell’envelope per il

riconoscimento delle cellule target).

Il punto fondamentale del trasferimento genico è che i virus ricombinanti sono difettivi,

ovvero non hanno il genoma virale ma solo quello di interesse. Le cellule virali vengono

prodotte nelle cellule packaging.

La cellula packaging ha integrato nel genoma le