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Laboratorio biomolecolare Appunti scolastici Premium

Appunti del modulo "Tecnologie del DNA ricombinante" di Laboratorio biomolecolare basati su appunti personali del publisher presi alle lezioni della prof.ssa Cutrupi dell’università degli Studi di Torino - Unito. Scarica il file in formato PDF!.
Esito esame totale 28/30.

Esame di Laboratorio biomolecolare docente Prof. S. Cutrupi

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METODI E APPLICAZIONE DEL DNA

RICOMBINANTE

CLONAGGIO DEL DNA

Se prendiamo il DNA di un vertebrato, abbiamo un genoma della grandezza di

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approssimativamente di 3-4 x 10 bp. Supponiamo di volere isolare un frammento di 3-4

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Kb (un milionesimo del genoma totale). Partendo da un µg di DNA da 3-4 x 10 bp, il

nostro frammento specifico sarà 1 pg, quindi una quantità difficile da maneggiare e

studiare. La tecnologia del clonaggio ci aiuta per poter disporre di una grande quantità di

copie di frammento di DNA che vogliamo studiare. Riusciamo ad ottenere grandi quantità

del nostro frammento perché esso, introdotto in un vettore, esso può essere acquisito da

un batterio ed esso, moltiplicandosi, genera una grande quantità di copie del nostro

frammento. Un’altra tecnica, oltre al clonaggio, è la PCR, che ha la stessa funzione: grazie

a cicli ripetuti di amplificazione riusciamo ad avere una grande quantità di una molecola

target. L’unica differenza è che il clonaggio ci permette anche di manipolare il DNA

consentendo, quindi, diverse applicazioni.

Che tipo di DNA possiamo clonare?

GENI: DNA che codifica per trascritti da cui potranno avere origine le proteine

 NON CODING RNAs: DNA codificante per trascritti non codificanti

 REGIONI GENOMICHE REGOLATRICI: regioni del genoma che non codificano per

 i geni, ma sono necessarie per regolare la trascrizione dei geni, quindi l’espressione

genica della cellula. Non danno nessun prodotto diretto ma contribuiscono alla

regolazione delle funzioni biologiche cellulari.

Cosa ci permettono di studiare le molecole ricombinanti?

Per quanto riguarda i geni, il clonaggio ci permette di studiare la struttura e funzione della

proteina, il suo ruolo nella trasduzione del segnale e la sua localizzazione.

Per quanto riguarda i non coding RNAs, il clonaggio ci permette di studiarne l’espressione

e la funzione.

Infine, abbiamo gli elementi regolatori. Il DNA è impacchettato nel nucleo insieme agli

istoni e alle proteine formando la cromatina (struttura compatta). Se districhiamo la

cromatina troviamo diverse regioni. I geni (tra cui promotori ed enhancer) sono regolati da

regioni regolatrici che possono essere localizzate più a valle o a monte del promotore. I

geni possono essere trascritti e si possono così ottenere trascritti primari, ovvero RNA

lunghi che possono essere processati. Il processo di maturazione dell’RNA porta a diversi

trascritti proteici che hanno ruoli diversi nelle cellule. Ciascun tipo di cellula può sfruttare in

modo diverso il genoma.

STUDI DI GENOMICA

Gli studi di genomica riguardano l’intero genoma e ci permettono di conoscere tutte le

caratteristiche del genoma (proteine, trascritti no coding ecc) in ciascun tipo cellulare. I

genome wide studies sono gli studi delle funzioni delle diverse parti del genoma e si

effettuano all’interno di ENCODE ( database all’interno del quale vi sono informazioni sul

genoma umano). Questi studi ci permettono di dire quali geni sono trascritti in ciascun tipo

cellulare, quali modificazioni istoniche ci sono e quali fattori di trascrizione intervengono.

Dal pdv tecnologico si sfruttano queste informazioni per il clonaggio. Il clonaggio si attua

attraverso diverse tappe: isolare il frammento da clonare; inserirlo in un vettore dando

origine ad un ricombinante e inserirlo in una cella batteriche che lo trasferirà alla progenie.

Otteniamo quindi un gene amplificato o una proteina amplificata. Il primo viene usato per

la ricerca scientifica; nell’industria medica, farmacologica e alimentare. Il secondo viene

usato per ricerca scientifica, industria medica e farmacologica, pesticidi/ insetticidi o per

creare piante resistenti.

TAPPE DEL CLONAGGIO

1 Inserire il DNA di interesse in un vettore

2 Incubare la particella ricombinante in un batterio (trasformazione/ trasfezione batterica)

che può moltiplicarsi per passare il gene alla progenie o dare tante copie del gene

3 Scelta dei cloni che hanno acquisito il vettore

4 Crescita dei cloni ricombinanti e purificazione del DNA di interesse

VETTORE DI CLONAGGIO

Il vettore usato per il clonaggio ha elementi essenziali che lo caratterizzano e sono

indispensabili per il suo funzionamento; essi sono:

Origine di replicazione (ORI)

 Marcatori (marker) di selezione (ad esempio il gene di resistenza alla penicillina e

 tetraciclina)

Siti di restrizione

I vettori di clonaggio possono essere plasmidici, ma non solo, abbiamo anche i trasposoni,

batteriofagi o virus. Tutti questi vettori sono presenti in natura e sono stati i loro

meccanismi molecolari per poterli sfruttare in quest’applicazione. Vi sono però anche i

vettori artificiali come i cosmidi, BAC, YAC e vettori virali/ retrovirali.

La prima grande differenza fra tutti questi vettori è la loro capacità di accogliere il DNA

esogeno In realtà i plasmidi possono

accettare massimo 5 kb di DNA

esogeno, quello scritto in

tabella è solo un valore teorico

REPLICAZIONE PLASMIDICA Il plasmide è un elemento circolare di DNA che

può replicarsi in corrispondenza delle ORI (siti di

origine di replicazione). In corrispondenza delle

ORI si crea una forcina che apre il plasmide e

permette di ottenere due molecole plasmidiche.

Esistono due tipi di plasmidi: ad alto numero di copie e a basso numero di copie. I primi

vengono replicati nel batterio in un numero elevate e vengono trasferiti alle cellule figlie.

Questo tipo di plasmide ci permette di avere un numero elevato di molecole che

contengono il DNA di interesse, quindi se il nostro obiettivo è avere un elevato numero di

proteine (ad esempio se vogliamo produrre insulina), usiamo questo plasmide. Nel caso in

cui l’obiettivo del clonaggio sia quello di studiare la funzione di una proteina all’interno

della cellula, non è vantaggioso usare un plasmide ad elevato numero di copie, perché

producendo molte proteine sbilancia la fisiologia del batterio. Quindi se vogliamo studiare

la funzione delle proteine usiamo i plasmidi a basso numero di copie. Essi danno origine

solo a due molecole che vengono trasferite ognuna in una cellula figlia.

La differenza tra i plasmidi ad elevato numero di copie e a basso numero di copie consiste

nel meccanismo di controllo del numero di plasmidi del batterio. Esistono diversi sistemi di

controllo:

Abbiamo un origine di replicazione affiancata da una sequenza di DNA (RNA II) che

 viene trascritta da una proteina (RNAP) e sintetizza RNA II. Questo trascritto può

formare un ibrido DNA-RNA in corrispondenza dell’origine man mano che viene

trascritto. Quando è presente questo ibrido, una molecola di RNAsi H (un’altra

proteina) crea dei nick (tagli) in corrispondenza dell’RNA. Questi frammenti di DNA

rappresentano l’innesco della DNA poli I per sintesi della nuova molecola. Se non si

forma l’ibrido, non parte la replicazione del plasmide

Questo sistema è sempre basato sull’ibrido DNA-RNA in cui però ci sono diverse

 sequenze (RNA I e II) che si sovrappongono all’ORI. All’interno di questo plasmide

c’è la proteina Rop che favorisce la formazione di ibridi tra RNA I e II. Quando si

formano questi ibridi, essi sono talmente legati che non si ha la replicazione.

Viceversa, se l’RNA II forma un ibrido in corrispondenza della ORI, allora l’RNA

rappresenta l’innesco per la sintesi del DNA complementare e quindi la replicazione

del plasmide. L’intervento della proteina Rop determina il numero di copie del

plasmide.

A seconda dei meccanismi di controllo del numero di copie, possiamo parlare di plasmidi

rilassati (che formano più copie) e plasmidi stringenti (una sola copia).

Ciascun batterio conserva solo un tipo di plasmide, cioè il batterio tollera solo un tipo di

plasmide ed esso verrà replicato ed ereditato dalle cellule figlie. Se dovessero essere

presenti più tipi di plasmide, le cellule figlie ereditano solo un tipo. Questo garantisce la

CLONALITÀ cioè ogni clone ha un solo tipo di plasmide. Questo perché trasformiamo

batteri che non contengono plasmidi, quindi la cellula ha dei meccanismi per il

riconoscimento di plasmidi e quale far replicare.

SELEZIONE DEI BATTERI CHE HANNO ACQUISITO I PLASMIDI

La selezione dei batteri viene effettuata attraverso antibiotici. Trattando i batteri con

antibiotici sopravvivono solo quelli che hanno acquisito il plasmide perché esso al suo

interno ha i marker di selezione, ovvero frammenti di DNA che codificano per enzimi di

resistenza agli antibiotici. Il plasmide resistente all’ampicillina ha al suo interno il gene che

codifica per l’enzima β lattamasi. Per ciascun antibiotico c’è un enzima contro di esso.

Questi enzimi (o coenzimi) distruggono l’antibiotico evitando che esso inibisca la sintesi

proteica e uccida il batterio.

Gli antibiotici β lattamici (ve ne sono molti perché i batteri possono sviluppare una

resistenza naturale contro gli antibiotici) vengono metabolizzati dalla β lattamasi. Questo

enzima rompe gli anelli della molecola rendendo l’antibiotico inefficace.

Quando trasformiamo un batterio (di solito ceppi di E. coli che non contengono altri

plasmidi), lo incubiamo insieme al plasmide, ma non tutti i batteri sono capaci di acquisire

il plasmide. Di conseguenza avremo una cultura mista in cui ci saranno dei batteri che

hanno acquisito il plasmide e altri no. Per poter eliminare i batteri che non hanno il

plasmide, si usa la selezione. Ciò significa

che la cultura batterica verrà piastrata su

una piastra di agar che contiene un

antibiotico. Quindi tutti i batteri che non

hanno acquisito il plasmide muoiono.

Prima di poter accogliere il plasmide, però i

batteri devono essere resi competenti,

ovvero prepararli ad internalizzare il

plasmide. Uno dei metodi è l’utilizzo di

cloruro di calcio, in presenza di essa i

batteri acquisiscono della capacità sulla

parete batterica che permettono loro di

internalizzare il plasmide.

Dopodiché possiamo avere batteri che non

hanno acquisito il plasmide oppure quelli

che hanno acquisito il plasmide. Tra questi

ultimi però ci sono anche i plasmidi non

ricombinanti, ovvero quei plasmidi che non

hanno acquisito il frammento di interesse.

Quindi, in realtà abbiamo 3 popolazioni

diverse.

L’acquisizione del plasmide è casuale e non è ad alta resa in quanto i batteri non sono

inclini ad acquisire materiale esogeno.

Per poter selezionare il batterio col plasmide ricombinante quindi dobbiamo effettuare una

doppia selezione, ciè è possibile perchè il plasmide può contenere più di un gene di

resistenza ognuno dei quali può contenere i siti di restrizione. All’interno di uno dei due

geni di resitenza possiamo inserire il DNA di interesse. Quindi ho un gene di resitenza

intatto e uno che può essere interrotto dal DNA.

I plasmidi che hanno la doppia resistenza non sono ricombinanti, mentre quelli che hanno

una resistenza sola sono ricombinanti. La prima selezione ci permette di eliminare i batteri

che non hanno acquisito il plasmide, la seconda, inevece, ci permette di eliminare i batteri

ricombinanti (perché hanno solo una resistenza), quindi possiamo confrontare le due

piastre e selezionare così i batteri ricombinanti (che saranno presenti solo nella prima

piastra).

Ci sono però altri metodi per selezionare il plasmide ricombinante: lo screening blu-bianco.

Il principio su cui si basa questo metodo è il gene LacZ che codifica per la β galattosidasi.

Esso è interrotto cioè al suo interno è presente un

sito di clonaggio che non altera l’enzima ma ci

permette di inserire il gene di interesse. In più,

continua ad essere presente il gene di resistenza per

l’ampicillina che ci consente di selezionare i batteri

che hanno acquisito il plasmide.

Il gene della β galattosidasi è presente nei batteri ed

è usato per il metabolismo del lattosio. I batteri che

crescono in un terreno con lattosio possono

assorbirlo e metabolizzarlo grazie all’enzima che

scinde il lattosio in galattosio e glucosio. Il gene lacZ

si trova all’interno dell’operone lac insieme a lacY

(codifica per la lattosio permeasi che permette

l’assorbimento di lattosio), lacA (codifica per la

tiogalattoside transacetilasi di cui ancora non è

ancora bene conosciuta la funzione) e lac I (codifica per il repressore di lac). In

corrispondenza del sito di inizio della trascrizione può legarsi il repressore lac, impedendo

all’RNA poli di trascrivere questi geni. Quando è presente il lattosio ed entra nella cellula,

esso è in grado di legarsi alla proteina lac repressore e farla staccare dal sito di inizio della

trascrzione. Quando il repressore lascia il sito di inizio trascrizione libero, l’RNA poli inizia

a scorrere.

Nel sistema di selezione blu/bianco, nel terreno di coltura dei batteri inseriamo X-Gal una

molecola molto simile al lattosio, ma ha un vantaggio notevole. Quando X-Gal viene

scisso, crea un gruppo cromogeno di colore blu.

Però dobbiamo ingegnerizzare anche il repressore, perché esso si stacca dal sito di inizio

della trascrizione solo in presenza di lattosio. Al posto di usare il lattosio si usa l’IPTG

(isopropil tiogalattoside) che svolge la stessa funzione del lattosio, ovvero si lega al

repressore e lo stacca dal sito di inizio della trascrizione, facendo procedere così l’RNA

poli e codificando l’enzima β galattosidasi. Quindi nel nostro terreno di coltura sarà

presente sia X-Gal, sia IPTG. Se non fosse presente IPTG, X-Gal non sarebbe scisso, non

produrrebbe il cromogeno e noi non potremmo selezionare le colonie batteriche. Ciò ci

permette di creare un SISTEMA INDUCIBILE, ovvero facciamo produrre la β galattosidasi

al batterio solo quando forniamo IPTG. Il vantaggio di questo sistema è che non

sovraccarichiamo il batterio dal punto di vista metabolico, ovvero facciamo produrre la

proteina in un preciso momento quindi i batteri crescono senza che essi producano la

proteina quindi possono dividersi, questo perché la produzione di una proteina

sovraccarica i batteri a discapito della divisione cellulare.

Noi inseriamo il DNA esogeno in corrispondenza del gene lacZ, quindi esso è interrotto e

non potrà trascrivere l’enzima β galattosidasi.

Facciamo la prima selezione (ovvero piastriamo i batteri in colture che contengono

l’ampicillina) e otteniamo i batteri che hanno acquisito il plasmide. Con la seconda

selezione otteniamo delle colonie blu e delle colonie bianche.

Colonie blu: sono quelle che hanno scisso X-Gal e prodotto il cromatogeno blu;

 sono le colonie che NON contengono il plasmide ricombinante

Colonie bianche: non hanno scisso X-Gal, quindi non hanno prodotto il

 cromatogeno blu, sono le colonie che contengono il plasmide ricombinante, perché

il DNA esogeno è stato inserito in corrispondenza del gene lacZ, quindi il batterio

non produce la β galattosidasi e di conseguenza non

può scindere l’X-Gal.

La β galattosidasi è un enzima che può essere sintetizzato in

due subunità: lacZ Ω e lacZ α. La prima viene integrata nel

genoma del batterio per non rendere troppo grande il

plasmide. La seconda subunità serve per attivare l’enzima, si

lega ad Ω quando viene trascritta e non può essere interrotto

dagli enzimi di restrizione perché i siti per questi enzimi sono

posti in triplette diverse da quelle necessarie per la struttura

del sito catalitico.

COME SI INSERISCE IL DNA DI INTERESSE NEL PLASMIDE?

Possiamo selezionare il nostro DNA target e inserirlo nel vettore usando due strumenti:

Endonucleasi: enzimi che tagliano sia il vettore che l’inserto in particolari siti di

 restrizione

DNA ligasi: enzima che ripristina i tagli dando origine alla molecola ricombinante

Gli enzimi di restrizione tagliano le molecole in particolari siti detti SITI DI RESTRIZIONE,

nel plasmide essi sono presenti nel SITO MULTIPLO DI CLONAGGIO o nei geni di

resistenza agli antibiotici.

Le endonucleasi usate per il clonaggio sono endonucleasi di restrizione di tipo II, ovvero

prodotte da batteri che non hanno attività metil-transferasica. Di soli i batteri che

producono enzimi di restrizione hanno attività metil-transferasica per proteggere il proprio

genoma dai tagli, ovvero aggiungono un gruppo metile sui siti di restrizione del proprio

genoma. Noi abbiamo ingegnerizzato questi batteri in modo che producano gli enzimi di

restrizione, ma che non abbiano attività metil-trasnferasica in modo da lasciare libero il sito

multiplo di clonaggio.

Gli enzimi di restrizione riconoscono dei siti specifici, ciascun enzima riconosce una

precisa sequenza di nucleotidi, in particolare sono sequenze PALINDROMICHE, ovvero

possiamo immaginare un asse di simmetria al centro del sito in cui i nucleotidi sono

speculari, quindi l’enzima riconosce il sito su entrambi i filamenti di DNA.

Ogni enzima taglia in modo diverso, ci sono enzimi che generano tagli blunt, ovvero

estremità nette ed enzimi che generano tagli sticky (o protrudenti), ovvero con porzioni di

nucleotidi che sporgono in 5’ (5’ overhand) o 3’ (3’ overhand). Tutto ciò ci permette di

scegliere gli enzimi da usare.

COME SCELGO GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE?

L’enzima di restrizione deve tagliare sia il vettore che l’inserto, ma deve tagliare l’inserto

solo in un unico sito, cioè deve generare estremità uniche, non deve avere altre siti nella

sequenza.

Gli enzimi di restrizione interrompono il ponte fosfodiestere che si trova nella catena di

DNA, lasciando una estremità 3’ con il gruppo ossidrile e una 5’ fosforilata.

CONDIZIONI CHE INFLUENZANO L’ATTIVITA DEGLI ENZIMI

L’enzima, per poter funzionare, ha bisogno di un buffer, ovvero un tampone con pH giusto

e sali che permettono l’attività enzimatica. Il buffer deve essere specifico per quell’enzima.

Il buffer ha caratteristiche diverse per ciascun enzima.

Un altro elemento importante è la temperatura, l’enzima di restrizione lavora a 37°, quindi

la nostra reazione enzimatica, per raggiungere la massima

efficienza (ovvero il 90% delle molecole vengono digerite),

deve essere incubata a 37°. In condizioni particolari ci

possono essere enzimi che lavorano a temperature diverse,

ma sono casi particolari, la maggior parte funzionano al

meglio a 37°.

Gli enzimi sono sensibili alla metilazione, quindi dobbiamo

far si che il DNA non sia metilato.

Ci sono anche dei contaminanti del DNA che inibiscono la

reazione enzimatica (etanolo, DMSO e glicerolo), sono

reagenti che possono essere usati nelle fasi di purificazione

del plasmide, quindi nelle procedure possiamo portarci dietro dei contaminanti che

impediscono il taglio enzimatico, quindi dobbiamo far attenzione nella fasi di purificazione

e conservazione del plasmide a non portarci dietro i contaminati.

CONTESTO DEL SITO DI TAGLIO: gli enzimi di restrizione riconoscono una sequenza

specifica, ma per poterla riconoscere hanno bisogno di basi supplementari che affiancano

la sequenza consenso. Quando tagliamo il vettore o inserto, creiamo un taglio che divide

le due molecole, quindi dobbiamo tenere conto, soprattutto nel vettore che è circolare, che

ci siano dei nucleotidi in più che permettano il riconoscimento del sito. Di conseguenza,

per facilitare le condizioni di clonaggio, inseriamo un POLYLINKER sintetico, ovvero

sequenze nucleotidiche (oligonucleotidi perché hanno dimensioni piccole) che contengono

siti per gli enzimi di restrizione, quindi se il nostro vettore non è dotato del sito utile per il

clonaggio, possiamo inserirlo attraverso il polylinker. Esso contiene i siti, possiamo

generare delle sticky ends perché decidiamo noi quali nucleotidi ottenere, possiamo far in

modo che essi si appaino e col sistema della DNA ligasi possiamo legarli all’interno del

vettore.

Abbiamo il sito di riconoscimento, l’enzima genera un taglio, ci sono delle sticky ends che

si appaieranno con dei nucleotidi complementari nel nostro DNA di interesse, perché le

estremità devono essere compatibili per la ricostruzione delle sequenze. Quando le

estremità sono appaiate la DNA ligasi ripristinerà il ponte fosfodiestere.

COME VERIFICHIAMO CHE LA NOSTRA SEQUENZA è STATA TAGLIATA? Attraverso un

gel d’agarosio che forma una maglia molecolare e a seconda della percentuale di agarosio

esse possono essere più strette o larghe e i frammenti di DNA verranno separati a

seconda del loro peso molecolare. Quando il DNA viene tagliato, darà dei frammenti

differenti e la grandezza dei frammenti può essere ricostruita confrontandoli con una

molecola a PM noto. Quando si usa DNA genomico, esso è molto grande e se lo

digeriamo con enzimi di restrizione, ci da una strisciata; ciò significa che dato che ci sono

molti diti di restrizione, ci sono anche molti frammenti di grandezza diversa.

DNA LIGASI

Ricostruisce il ponte fosfodiestere utilizzando una molecola di ATP, quindi nel buffer della

ligasi deve essere presente l’ATP. Essa è necessario alla ligasi perchè ha nel suo sito

attivo un gruppo amminico necessario per formare l’intermedio enzima-AMP. L’enzima

viene attivato tramite legame con ATP, mentre il gruppo pirofosforico viene rilasciato

nell’ambiente. L’enzima attivato è in grado di legare e catalizzare la formazione del

fosfodiestere con un attacco del gruppo ossidrile sul gruppo fosforico del 5’ protrudente. In

questo modo l’enzima ripristina il taglio e permette a due molecole di DNA di legarsi.

CONDIZIONI CHE PERMETTONO LA REAZIONE DI LIGAZIONE

La DNA ligasi è un enzima e lavorerebbe bene a 37°, tuttavia nel caso della ligasi non è

importante solo la capacità dell’enzima, ma le estremità del vettore e dell’inserto devono

potersi appaiare. Per favorire l’appaiamento delle basi è necessaria una temperatura di

16°, cioè bisogna ridurre i movimenti del vettore e dell’inserto per favorire il loro incontro.

Quindi anche se l’enzima funziona a 37, per favorire l’appaiamento lavoriamo a 16°. La

DNA ligasi è in grado anche di catalizzare l’unione di frammenti con blunt end. Quando

abbiamo queste estremità non ci sono basi che si possono legare, quindi il legame fra

estremità nette è sfavorito, quindi per favorire questo legame si abbassa la temperatura

fino a 4°.

La concentrazione di DNA influenza la reazione, infatti nella ligazione è importante il

rapporto vettore/inserto. Essi devono essere inseriti in un rapporto ben preciso, questo

valore non è deciso a priori ma è un valore sperimentale; solo preparando diluizioni

diverse di vettore e inserto si trova il valore a cui si ha la massima efficienza di ligazione.

Un altro fattore che influenza la reazione di ligazione è la presenza di contaminanti del

DNA, essi inibiscono la ligasi.

Infine, il tampone di reazione è specifico per la ligasi che usiamo (il componente

fondamentale è l’ATP).

Quando si usano delle condizioni più difficili nel clonaggio, possono essere utili anche

enzimi diversi. Uno di questi enzimi è la FOSFATASI ALCALINA. Quando si usa un solo

enzima di restrizione, quello che capita più frequentemente è che il vettore si richiude su

se stesso perchè come la ligasi lavora sulla coppia vettore-inserto, lavora anche sul

vettore stesso, perché se usiamo un enzima di restrizione solo le estremità sono

compatibili e il vettore si richiude. Per evitare ciò, si usa la fosfatasi alcalina che rimuove i

gruppi fosforici al 5’; questo sfavorisce il legame della ligasi (perché necessita di un 5’

fosforilato), quindi eliminiamo il 5’ fosforilato solo sul vettore per evitare che esso si

richiuda.

Un altro enzima che si usa nel clonaggio quando non abbiamo estremità compatibili tra

vettore e inserto, ovvero non riusciamo a trovare enzimi che ci diano estremità che

possano appaiarsi, possiamo usare il frammento Klenov della DNA poli I di E. coli. Se si

elimina la capacità di sintesi 5’-3’ della DNA poli e si lascia solo il frammento Klenov, esso

aggiunge dei nucleotidi complementari alle estremità sticky. Esse si trasformano quindi in

estremità blunt. In questo modo abbiamo creato estremità nette che possono legarsi con

altre.

TRASFORMAZIONE BATTERICA

Per far acquisire il plasmide ricombinante al batterio esistono diversi modi.

Elettroporazione: cioè l’applicazione di un campo elettrico permette la parete del

 batterio di permealizzarsi al plasmide

Metodi chimici: ad esempio trattamento con cloruro di calcio

 Shock termico

 Batteriofagi

Come entra il plasmide nel batterio?

I batteri competenti deformano la superficie in modo da poter associare una particella

plasmidica. Una volta che il plasmide aderisce alla parete del batterio viene internalizzato.

Per favorire questo processo si effettua un shock termico che avviene a 42° per 40s. Ѐ

estremamente importante rispettare il tempo per garantire la vitalità dei batteri e

l’efficienza dell’internalizzazione.

La competenza batterica è un evento raro che può essere acquisita dai batteri quando

sono in una fase di crescita logaritmica ovvero i batteri si stanno dividendo in maniera

efficiente. I batteri in questa fase sono incubati con cloruro di calcio a freddo. Il cloruro di

calcio fa deformare la parete batterica per favorire l’entrata del plasmide.

Nel caso dell’elettroporazione abbiamo delle cuvette a cui applichiamo un campo elettrico

calibrato in base al tipo di batterio e alla grandezza del plasmide. Il campo elettrico forma

dei fori nella parete batterica. Questo sistema è altamente efficiente l’unico problema è

che si compromette la vitalità del batterio.

METODI DI COLTURA BATTERICA

Il clonaggio avviene grazie alla formazione di colonie batteriche che possono essere

propagate all’infinito, cioè basta che vi sia terreno di coltura e condizioni ideali di crescita.

Possiamo conservare i batteri col plasmide per lunghi periodi.

Le singolo colonie vengono fatte crescere su piastre con agar che possono essere

conservati in stock congelati con un terreno di coltura al 15/20% di glicerolo e mantenuti in

modo indefinito a

-80°. Il glicerolo impedisce che le cellule si rompano, se congeliamo dei batteri senza

glicerolo, nel momento in cui le scongeliamo la parete si disintegra a causa dello sbalzo di

temperatura. Il glicerolo che questo sbalzo sia troppo elevato e preserva la vitalità del

batterio. Le colonie possono essere amplificate in terreni di coltura liquidi e generare così

molte copie. I singoli cloni possono essere ottenuti su piastre di agar, mentre l’intera

colonia viene amplificata in terreni di coltura liquidi.

Per amplificare la colonia, possiamo scegliere di fare crescite in piccola scala (3/5 ml

overnight a 37°) da crescite così piccole possiamo purificare plasmidi di pochi

microgrammi, queste vengono chiamate MINIPREP.

Se abbiamo bisogno di grandi quantità di plasmide, allora il nostro terreno liquidi dovrà

essere 100 ml o 1 l (37° overnight) e da queste preparazione potremo ottenere una

quantità di plasmide di mg. Queste vengono chiamate MAXIPREP.

TERRENI DI COLTURA LIQUIDI

Sono specifici per ogni specie di batteri. I componenti principali sono:

Triptone, composto da piccoli peptidi che originano dalla frammentazione della

 caseina con la tripsina

Estratto di lievito

 Cloruro di sodio

 pH 7

TERRENO SOLIDO (LB AGAR)

Terreno liquido a cui viene aggiunto agar, un componente che rende il terreno più

consistente.

Queste piastre vengono usate per fra crescere i cloni. L’agar a 55° è liquido, mentre a

temperatura

ambiente è solido.

Le fiasche di terreno che vengono incubate a 37° in agitazione, ovvero esse roteano ad

una velocità di 250 rpm per distribuire i batteri in tutta la fiasca, ossigenare la coltura e per

permettere la maggior distribuzione dei nutrienti.

AMPLIFICAZIONE E PURIFICAZIONE DEL PLASMIDE

Dopo aver piastrato i batteri su un terreno solido di agar con antibiotico di selezione.

Quando effettuiamo la piastratura otteniamo delle colonie che possono essere prelevate

con un ansa batterica sterile. Dopo aver prelevato i batteri, li trasferiamo in una provetta.

In ciascuna provetta avremo una colonia batteriche che faremo crescere. Il ciclo di

replicazione batterico è di 30 minuti, quindi ogni 30 minuti la colonia si duplica. Nell’arco di

16 ore abbiamo 4000 miliardi di cellule. Per seguire la crescita della coltura può essere

usato uno spettrofotometro e la densità della coltura viene misurata a 595 nm. È

importante misurare la densità della coltura perché è in questa fase esponenziale che i

batteri producono la maggior quantità di plasmide. Quando arriviamo al plateau (ovvero i

batteri non crescono più) vuol dire che tutti i nutrienti sono stati consumati, inizia ad

esserci carenza di ossigeno e i batteri iniziamo a morire. Morendo, i batteri degradano il

plasmide, quindi dobbiamo evitare di portare i batteri ad uno stato di saturazione.

A seconda della quantità di DNA che vogliamo ottenere, faremo crescere i nostri batteri in

un terreno di coltura liquido di 5ml (miniprep) o 500 ml/ 1 L (maxiprep).

La prima tappa di purificazione è quella di centrifugare le provette con i batteri in

sospensione. Grazie alla centrifugazione raccogliamo il pellet batterico. Una volta raccolto,

il pellet viene risospeso in una soluzione che contiene SDS e idrossido di sodio. Il primo

rompe la parete batterica, il secondo attua una denaturazione alcalina che denatura il DNA

genomico. L’incubazione con questa soluzione deve avvenire in un tempo ben preciso

affinchè l’idrossido di sodio non alteri il plasmide, ma denaturi solo il DNA genomico. Una

volta liberato il plasmide dal batterio, si ha la tappa di rinaturazione o SALTING OUT, cioè

si aggiungono dei Sali che riportano il pH ad un valore neutro. Si effettua una

centrifugazione per separare il plasmide dai residui batterici, quindi si ottiene un pellet di

residui batterici molto grande (DNA genomico + parete batterica) e in sospensione si

ottiene il DNA plasmidico. Questo è il primo step di purificazione.

Il DNA però non è ancora sufficientemente pronto per poter procedere con le successive

applicazioni, quindi si effettuano altre purificazioni. Una di queste è il fenolo cloroformio.

La tecnica del fenolo cloroformio è usata anche per la purificazione dell’RNA, la differenza

è il pH. A pH neutro si usa per la purificazione de DNA, mentre a pH acido si usa per la

purificazione dell’RNA.

Abbiamo la nostra soluzione di DNA a cui si aggiunge un pari volume di una soluzione

contenente fenolo cloroformio, si mescola e si centrifuga. Grazie alla centrifugazione si

ottengono fasi differenti, al fondo abbiamo il fenolo cloroformio, un’ interfaccia di proteine

che sono rimaste in soluzione, mentre nella fase acquosa troviamo il DNA. A questo punto

preleviamo la fase superiore, ripetiamo questa purificazione se necessario (dipende da

quanto è torbida la soluzione), oppure possiamo procedere con la precipitazione del DNA.

La precipitazione è necessaria perché abbiamo usato un volume grande, quindi per

concentrare il DNA lo precipitiamo. Per farlo aggiungiamo un sale (acetato di sodio 0.3 M)

e due volumi di etanolo il tutto a freddo. Si mescola, si centrifuga

e grazie alla centrifugazione il DNA precipita (la stessa cosa vale

per l’RNA). L’incubazione a freddo dipende dal volume, per una

precipitazione veloce si effettua un’incubazione a -80° per 10

minuti, di solito però si effettua a -20° per 1/2 ore.

Si forma un pellet, che sulla superficie contiene etanolo che

viene eliminato e si aggiunge etanolo 70/80%, si mescola, si

centrifuga e si elimina l’etanolo. Questo secondo lavaggio serve

per eliminare i Sali che possono essere precipitati col DNA, se

non si eliminano essi possono interferire con le operazioni successive di manipolazione

del plasmide (incubazione con enzimi di restrizione o reazione di ligazione). Dopo aver

eliminato l’etanolo, si può far asciugare la provetta ad aria (sotto cappa per velocizzare

l’evaporazione), dopodichè il pellet viene risospeso in un tampone (che può essere acqua

o TE, tris ETDA). Infine, il DNA può essere conservato a -20 o -70° all’infinito. In questa

soluzione il DNA è stabile.

Un altro metodo di purificazione del DNA è quello con colonne di matrice diversa. La

matrice può contenere granuli di vetro di silica. A seconda della composizione della

matrice varia l’efficienza di purificazione. L’efficienza non è solo legata all’eliminazione dei

contaminanti, ma anche dal tipo di vettore che si utilizza. Si usano le colonnine perché il

fenolo cloroformio, nonostante abbia un elevata efficienza, è cancerogeno quindi deve

essere usato sotto cappa e con le dovute precauzione, di conseguenza le colonnine sono

il metodo più sicuro e pratico da usare.

Il principio che viene sfruttato dalle colonnine che hanno una resina come la DEAE è

quello della cromatografia a scambio ionico. Esso ha un gruppo funzionale carico

positivamente che attira la carica negativa del DNA. Nella colonnina si aggiunge il DNA

che si legherà alla matrice, vengono effettuati diversi lavaggi per eliminare le molecole che

non sono trattenute dalla matrice, dopodichè il DNA viene staccato dalla colonna usando

dei Sali che competono per il legame del DNA alla matrice. Il DNA viene così eluito.

Questo aggiunta di Sali si chiama LAVAGGIO A BASSA FORZA IONICA, se noi misuriamo

l’assorbanza di questi eluiti, vediamo che nel primo passaggio (quando il DNA è legato alla

colonna) usciranno delle proteine, quindi l’assorbanza avrà un picco che corrisponde alle

proteine. Aumentando la forza ionica, viene eluito anche il DNA.

Per visualizzare il DNA, si usano dei reagenti es bromuro di etidio. Esso è un intercalante

del DNA che fa visualizzare il DNA in un gel d’agarosio sotto luce UV. Tuttavia il bromuro di

etidio è altamente cancerogeno, quindi è stato sostituito da altri intercalanti (non all’interno

della doppia elica ma nelle curve del DNA, questo deforma meno il DNA e quindi sono

meno cancerogeni), chiamati SYBR SAFE.

Esistono altri metodi di visualizzazione che però non sono molto usati, ma garantisce la

massimo purezza del DNA, è quella a gradiente di cloruro di cesio. Grazie a questa

tecnica, si carica il DNA purificato insieme a bromuro di etidio e una miscela di cloruro di

cesio. Sottoposto ad un processo di centrifugazione di 40 ore a 150 mila g, si crea un

gradiente che ci fa vedere una banda netta sul gel d’agarosio in corrispondenza del quale

troviamo il DNA plasmidico. Per ottenerlo si usa una siringa e si aspira il DNA in

corrispondenza della banda.

Dopodichè si attua un analisi di restrizione per verificare che il plasmide purificato sia

quello giusto.

MAPPE DI RESTRIZIONE

La mappa di restrizione ha la funzione di indicare quali sono i frammenti tagliati dai 2

enzimi e la loro posizione nel vettore o DNA di interesse. A seconda della grandezza del

frammento possiamo risalire alla posizione nella sequenza.

VETTORI DI CLONAGGIO

Sono distinti in base alla grandezza del frammento che possono portare.

I cosmidi sono ibridi tra fagi e plasmidi; circolarizzano grazie alle sequenze COS e si

replicano come i plasmidi. Possono portare 35-45 kb.

Ci sono vettori più grandi usati per i clonaggi dei genomi, come PAC (100 kb) e BAC( 300

kb). Infine vi sono i vettori derivati dal lievito (YAC) che possono portare fino a 1 Mb.

Cosmidi: hanno un sito COS che deriva dal fago, abbiamo i siti di restrizione, l’ORI

 nel batterio e geni di resistenza. Hanno estremità COS all’interno delle quali

possiamo inserire il DNA di interesse. Possono contenere frammenti molto grandi e

possono formare delle lunghe catene ed essere impacchettati dentro le particelle

fagiche. Esse fungono da mediatori, cioè vettori, che permettono l’inserimento del

DNA nel batterio, quindi parliamo di infezione fagica.

YAC e BAC: sono vettori che possono contenere frammenti molto grandi di

 cromosomi. YAC viene usato in lievito, quindi avrà la ORI nel lievito e sequenze

telomeriche che vengono usate dal lievito per amplificare le particelle.I BAC

possono essere inserite dentro i batteri tramite elettroporazione.

Il clonaggio nei batteri ci permette di amplificare una singola molecola di DNA e quindi

purificarlo, ma possiamo anche clonare un interno genoma (DNA complesso) attraverso la

creazione di librerie.

All’interno dei nostri vettori possiamo inserire tipi differenti di DNA di interesse e ottenere

così diverse librerie: librerie genomiche (intero genoma); librerie a cDNA (retrotrascritti

dell’RNA di una cellula); librerie di mutanti e librerie di oligonucleotidi random (cioè che

variano la propria sequenza).

LIBRERIE GENOMICHE

Per la costruzione di una libreria genomica, bisogna prima purificare il genoma di una

cellula attraverso sistemi simili a quelli per la purificazione dei batteri. Dopodichè si

frammenta il DNA, cioò avviene in vari modi (enzimi di restrizione e altri). Subito dopo aver

frammentato il DNA con enzimi di restrizione, si procede con la ligazione e infine si può

inserire il DNA in un vettore. In questo modo si crea una libreria di ricombinanti che

possono essere usati per la trasformazione in batteri

LIBRERIE DI cDNA

Il materiale di partenza è l’mRNA che possiamo purificare dalla cellula, esso viene

retrotrascritto in DNA complementare, così si ottiene DNA a doppia eliche che, grazie

all’inserimento di linker (oligonucleotidi all’interno dei quali vi sono i siti di restrizione), si

può tagliare con enzimi di restrizione e inserire i frammenti in vettori. Si ottengono dei

ricombinanti che contengono DNA cellulare.

Per le librerie genomiche il genoma usato può essere sia eucariotico che procariotico. Si

purifica il DNA genomico, si frammenta con enzimi di restrizione, questo crea estremità

compatibili che ci permettono di inserire i frammenti nei vettori. Il plasmide sarà trattato

con gli stessi enzimi di restrizione. In questo caso è una miscela. Se noi mettiamo questi

vettori ad incubare con i vettori, ciascun batterio propagherà solo un singolo tipo di

plasmide, quindi otteniamo tanti cloni per ciascun frammento. Le librerie sono questo

insieme di cloni formati da un certo tipo di DNA donatore. Questo vale anche per le librerie

a cDNA.

Se partiamo da cellule, possiamo estrarre RNA con diversi metodi a pH acido,

retrotrascrizione a DNA, poi inserendo dei linker possiamo generare delle molecole

ricombinanti con i plasmidi. I vettori contengono un cDNA diverso, possono essere così

trasformati.

Per identificare i cloni possiamo isolarli e amplificarli, possiamo analizzare i cloni usando

enzimi di restrizione diversi da quello del clonaggio (per identificare il tipo di DNA), oppure

possiamo sequenziare i cloni e definire qual è la sequenza nucleotidica dei nostri cloni.

CARATTERISTICHE LIBRERIE

Tutte hanno frammenti diversi. Quelle che derivano da un stesso organismo si

differenziamo per

Rappresentazione: a seconda del metodo di frammentazione (enzimi di restrizione,

 sonicazione cioè rottura fisica del DNA, oppure tramite enzimi di restrizione a bassa

efficienza in modo che non tagli tutti i siti presenti nel genoma) avremo frammenti di

grandezza diversa e varierà anche il numero di cloni contenenti i frammenti.

Grandezza: ciascun frammento ha grandezza diversa. Il tipo di frammentazione

 influenza il tipo di libreria

Numero di cloni: a seconda di come generiamo la libreria avremo un numero

 differente a seconda dei frammenti generati

Cloni adiacenti o sovrapposti: nel primo caso, ciascun clone avrà solo un

 frammento di DNA ben preciso, nel secondo caso i cloni possono avere una

sequenza in comune. Immaginiamo

di avere un DNA genomico, se il tipo

di frammentazione usato genera

delle stremità nette, avremo tanti

frammenti di DNA consequenziali.

Nel caso dei frammenti sovrapposti,

possono esserci cloni con delle

sequenze in comune.

Queste differenze sono collegate al metodo

di frammentazione del genoma. Essa può

essere:

Meccanica: possiamo usare la

sonicazione o il congelamento/scongelamento oppure il passaggio del DNA in una

siringa, questi generano una frammentazione casuale e non riproducibile.

Endonucleasi generiche (es DNasi I di E. coli) taglia il DNA in modo casuale,

 abbiamo frammenti molto eterogenei

Enzimi di restrizione: aumentiamo la variabilità dei frammenti, possono essere

 molto piccoli se i siti sono vicini o molto grandi se i siti sono molto distanti. Questo è

il metodo riproducibile perché possiamo verificare sia a priori che a posteriori la

mappa di restrizione. Se prendiamo il DNA umano e lo tagliamo con enzimi di

restrizione che hanno un sito di riconoscimento di 6 bp, otteniamo 1 milione di

frammenti. È una quantità enorme di frammenti, quindi di cloni. L’utilizzo degli

enzimi di restrizione è utile per i genomi ridotti, ma non per quelli grandi come

quello dell’uomo. Per avere frammenti più grandi si usa la frammentazione

meccanica o la digestione parziale con enzimi di restrizione. Come facciamo a non

far tagliare gli enzimi di restrizione in tutti i siti? Variamo le condizione per

l’efficienza di taglio. Una delle variabili che viene usata per far lavorare male

l’enzimi è il buffer: si usa una concentrazione di Sali che non è quella giusta, quindi

gli enzimi non riescono a tagliare tutti i siti. Quando non tagliano tutti i siti danno

frammenti molto ampi (es 20 kb). A seconda della grandezza dei frammenti che si

vogliono ottenere si sceglie il buffer più adatto. Quando generiamo questi frammenti

essi sono sovrapposti, essi sono comuni per più tagli.

Ciò ci permette di generare una libreria genomica con frammenti che hanno in comune

delle sequenze e con un numero ridotto di cloni da maneggiare. Una volta ottenuti i cloni, li

possiamo analizzare, cioè purifichiamo ciascun plasmide digerendolo con l’enzima usata

per il clonaggio, isoliamo il vettore e conoscere qual è la grandezza dei frammenti.

Possiamo quindi valutare la qualità della libreria, cioè sappiamo il numero di cloni ottenuti

e la grandezza dei frammenti inseriti nei vettori.

A seconda della grandezza dell’inserto, cambiamo il tipo di vettore e quindi incidiamo sul

numero di cloni e la dimensione della libreria. Più è grande il frammento, minore sarà il

numero di cloni.

Questi sistemi sono stati usati per procedere con il sequenziamento di interi genomi.

Un sistema è frammentare il DNA genomico in

modo da ottenere frammenti molto grandi (160

kb). Con questi frammenti si usano i vettori

BAC e successivamente si amplificano i

frammenti. Questo è stato il primo approccio

per il sequenziamento del genoma umano

(ciascun clone è stato dato a laboratori

differenti). Una volta ottenuto il clone, ciascun

frammento è stato frammentato in pezzi ancora

più piccoli e successivamente è stato possibile

ricostruire la sequenza del DNA (tramite il

sistema dei frammenti sovrapposti). Questo sistema è definito come METODO

GERARCHICO.

Un altro metodo è quello della frammentazione globale del genoma (sistema shotgun). In

questo sistema il genoma è stato subito frammentato in tantissimi pezzi e ciascuno è stato

subito sequenziato, si è generata una libreria ma senza l’utilizzo di ospiti. Grazie a ciò si è

ricostruita la sequenza in modo molto più rapido.

LIBRERIE GENICHE (cDNA)

Derivano dall’RNA e si basano sull’utilizzo del DNA complementare. Per sintetizzare e

clonare l’RNA dobbiamo estrarlo e purificarlo da una cellula. All’interno di una cellula l’RNA

è di tipi diversi, se vogliamo purificare solo l’mRNA possiamo sfruttare la coda di

poliadenilato (ricca di poliA). Questo ci consente di isolare solo l’mRNA. Sintetizziamo una

molecola di DNA complementare usando la trascrittasi inversa. Essa è una DNA poli che

sfrutta come stampo l’RNA per la replica del DNA.

Frammentiamo il nostro tessuto e purifichiamo l’RNA tramite un estrazione con fenolo e

cloroformio acido (essi vengono tamponati a pH acido per poter estrarre l’RNA), a questo

punto procediamo con la precipitazione in alcol e si ottiene così l’RNA totale. Sono stati

sviluppati una serie di kit per la purificazione dell’RNA, poiché l’RNA è molto degradabile,

tutti i reagenti mirano a preservarne l’integrità. Una volta ottenuto l’RNA totale, possiamo

procedere alla purificazione dell’mRNA con colonnine. Ci sono diversi sistemi che

sfruttano la coda di poliA e si basano sul fatto che sulla matrice a sfere di agarosio hanno

una sequenza di oligoidT (riconoscono la coda di poliA). Ciò avviene in un ambiente ad

alta forza ionica perché dobbiamo favorire l’interazione tra oligodT e poliA. Dopodiché

variamo la forza ionica e possiamo eluire il nostro mRNA dalla colonna.

Per isolare l’mRNA, la coda di poliA si appaia con le T presenti sulla matrice, con dei

lavaggi gli altri tipi di RNA vengono eliminati e variando la forza ionica, cioè cambiando le

condizioni della matrice, possiamo eluire il nostro mRNA. Ad alta forza ionica favoriamo

l’appaiamento della coda, a bassa eluiamo gli mRNA.

RETROTRASCRIZIONE

Una volta che abbiamo purificato l’mRNA, sfruttiamo ancora una volta la coda di poliA.

Usiamo un primer 5’-3’ composto da T. questo primer è il punto di partenza che ci permette

di avere un 3’ da cui la trascrittasi inversa sintetizza un filamento di DNA. Con l’utilizzo di

alcali possiamo degradare l’mRNA e grazie ad un piccolo loop in 3’ generiamo un innesco

per la DNA poli che a questo punto sintetizzerà un doppio filamento di DNA. Trattando con

una nucleasi S1 si elimina questo loop e si ottiene un doppio filamento di cDNA.

Abbiamo generato delle blunt end, ma se vogliamo inserirlo in un vettore non possiamo

usare degli enzimi di restrizione perché non conosciamo la sequenza, quindi introduciamo

dei linker che hanno dei siti di restrizione e grazie alla ligasi si uniscono alle estremità dei

cDNA. A questo punto possiamo usare gli enzimi di restrizione e generare delle estremità

compatibili che ci permettono di compiere un clonaggio all’interno del vettore.

IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DEL CLONE RICOMBINANTE

Il clonaggio può essere applicato sia a partire da una miscela complessa di RNA oppure

solo da mRNA e per identificare il clone ricombinante in questa miscela complessa

possiamo usare diversi metodi come lo screening tramite ibridazione, tramite espressione,

PCR, analisi di restrizione, sequenziamento.

Per il clonaggio delle singole sequenze invece, possiamo usare la PCR, analisi di

restrizione o sequenziamento.

Come si identifica il DNA di interesse?

Possiamo usare un criterio di omologia, cioè il nostro gene target può avere delle

somiglianze con altri geni conosciuti che possono essere della stessa specie o di specie

diverse.

Possiamo anche partire non direttamente dalla

sequenza nucleotidica ma dalla proteina

purificata tramite metodi biochimici. Se

conosciamo un pezzo della sequenza del

peptide, possiamo immaginare quale sia la sua

sequenza nucleotidica e usarla per identificare

il gene completo.

Oppure possiamo far esprimere il nostro gene

nell’organismo ospite, quindi useremo vettori di

espressione specifici che ci permettono di

produrre la proteina nell’ospite. L’identificazione delle sequenze target quando si parte da

un minor numero di frammenti o da una singola sequenza grazie alla PCR è molto più

semplice. Possiamo identificarlo mediante analisi di restrizione.

IDENTIFICAZIONE CLONI BASATA SU IBRIDAZIONE

Si usano delle sonde marcate. Esse sono delle sequenze oligonucleotidiche sintetizzate in

vitro e marcate con una sostanza che può essere sia un marcato radioattivo che un

fluorocromo. Si parte dalla piastra batterica. Facciamo aderire un filtro di nitrocellulosa a

cui si attaccheranno i batteri. I batteri sul filtro vengono lisati, cioè la parete viene rotta, il

DNA denaturato (la doppia elica si apre e diventa un singolo filamento) e quindi è reso

disponibile per essere riconosciuto dalla sonda marcata. Essa è omologa, oppure deriva

per ricostruzione da una sequenza peptidica oppure conosciamo solo un pezzo del DBA di

interesse e vogliamo avere la sequenza completa. La sona, ibridandosi col DNA, darà un

segnale sul filtro. Riposizionando il filtro sulla piastra batterica possiamo recuperare i

batteri che contengono il DNA di interesse.

Gli oligonucletodi della sonda sono denaturati, cioè a singola elica. Per isolare il DNA di

interesse da una miscela di frammenti, possiamo applicare l’ibridazione, cioè far appaiare i

frammenti. A seconda delle condizioni di ibridazione, abbiamo un ibridazione ad alta

stringenza o a bassa stringenza. Le condizioni per l’ibridazione ad alta stringenza

consistono al 50% di formammide a 42°, in queste condizioni la complementarietà è

perfetta, identifichiamo solo il DNA target che ha una sequenza identica alla sonda. Se

applichiamo le condizioni a bassa stringenza (50% formammide a 35°), la sonda potrà

appaiare diverse molecole target oltre a quella perfettamente complementare perché la

bassa temperatura consente anche appaiamenti senza una perfetta complementarietà tra

le basi. Quindi la nostra sonda riconosce più molecole.

Bassa stringenza: bassa temperatura, bassa concentrazione di agenti caotropici

(formammide) e alta forza ionica (alta concentrazione di Sali).

Alta stringenza: alta temperatura, alta concentrazione di agenti caotropici e bassa forza

ionica.

Se conosciamo la sequenza completa possiamo usare le condizioni ad alta stringenza, se

invece ci basiamo solo su omologia o conoscenza della sequenza peptidica dovremo

usare le condizioni a bassa stringenza perché non conosciamo la vera sequenza. Queste

condizioni ci permettono di identificare altre molecole e isolare DNA di interesse.

Per lo screening si possono usare anche metodi diversi contemporaneamente.

Possiamo amplificare un frammento tramite PCR e poi tutti i frammenti possono essere

clonati tramite un vettore. Il singolo clone che ha acquisito il vettore viene selezionato

tramite marcatori di selezione. Possiamo isolare un singolo clone e farlo crescere.

Ciascuna colonia può essere amplificata e poi può essere estratto il vettore e sequenziato.

SEQUENZIAMENTO DNA

Dopo il progetto genoma umano è partito il sequenziamento del DNA di persone di diverse

popolazioni per poter capire le malattie genetiche e si entra nella medicina molecolare,

perché bisogna capire il significato delle sequenze nucleotidiche e come incide la

variabilità genetica in una patologia. Gli studi convergono nel definire quali sono le

alterazioni della sequenza che sono associate ad una patologia. Questo vale per tutti gli

organismi. Il sequenziamento del DNA di per sé è solo una delle informazioni che

possiamo ricavare. Il nostro DNA è avvolto in proteine, forma una struttura complessa

della cromatina che ha tantissime caratteristiche e ciascuna di esse può essere attribuita

alla sequenza del DNA.

Per il sequenziamento si parte dal DNA a doppia elica, può essere un DNA genomico, ma

non solo. Quando partiamo da qui facciamo una frammentazione, cioè dobbiamo dividere

la nostra sequenza in pezzi. Questi possono avere diverse dimensioni, essere eterogenei

e se stiamo sequenziando non conosciamo la sequenza, quindi per poterlo fare dobbiamo

aggiungere degli adattatori. Essi ci permettono di iniziare a sequenziare il DNA (sono un

innesco). Dopo abbiamo una serie di sequenze e per analizzare i dati possiamo

approcciarci in due modi diversi: l’analisi può essere DENOVO (assembliamo noi il nostro

genoma facendo in modo di sovrapporre le sequenze di nucleotidi comuni e quindi

ricostruire il nostro genoma per intero) oppure ALLINEAMENTO DEI REED SUL GENOMA

DI RIFERIMENTO ( i reed sono i frammenti che otteniamo, questo è il metodo che viene

usato adesso perché è più veloce ed efficiente).

METODO SANGER

Partiamo da una sequenza di DNA ignota che può essere amplificata tramite PCR o

clonaggio. Questo step serve per avere una grane quantità del nostro DNA di interesse. A

questo punto ai frammenti (ottenuti per PCR o per clonaggio) si aggiunge la DNA poli, per

copiare il DNA, e i didesossinucleotidi, nucleotidi modificati che si legano alle estremità dei

frammenti bloccandone la sintesi. Essi contengono anche dei marcatori fluorescenti per

riconoscere i diversi frammenti uniti ai didesossinucleotidi. A questo punto si fa un

elettroforesi per capillarità per identificare i frammenti in base alla loro grandezza. E si

attua il sequenziamento.

I metodi di sequenziamento di nuova generazione si basano sul principio del metodo

Sanger. Ai frammenti di DNA vengono aggiunti degli adattatori a doppio filamento alle

estremità 5’ e 3’ del DNA. I frammenti si legano in modo diverso e si creano dei cluster che

verranno amplificati per PCR e sequenziati.

I didesossinucleotidi non contengono il gruppo OH né al 3’ né al 2’. L’OH al 3’ è necessario

per la formazione del ponte fosfodiesterico, quindi se è assente la duplicazione del DNA si

blocca. Se alla miscela di frammenti si aggiungono basse concentrazioni, ad esempio di

ddCTP, avremo nelle varie posizioni, la sintesi della G, ma qui si blocca. Questi ddNTP

sono fluorescenti.

In passato, si preparavano 4 provette con i 4 diversi ddNTP (C,G,T,P) che erano marcati

con fosforo radioattivo, si caricavano su gel le 4 provette e in ciascuna di esse i frammenti

si interrompevano a seconda della base usata (se usiamo ddCTP la sintesi si interrompe a

livello della G) e potevano essere riconosciuti tramite la radioattività.

Oggi possiamo mescolare i 4 diversi ddNTP, i frammenti vengono separati in base alla

grandezza, ma in questo caso si usa un lettore fluorescente. Passando per ogni posizione

della colonna capillare, si ottiene un segnale che corrisponde a ciascun nucleotide inserito

a seconda della grandezza del frammento separato.

NEXT GENERATION SEQUENCING

Nuovi sistemi di sequenziamento. Sono molto complessi ma più veloci ed efficienti.

Si inseriscono gli adattatori (servono per innescare la reazione di sintesi, i primer sono

complementari ad essi), e avvengono diversi cicli di PCR su diversi vetrini. In ogni riga si

carica la miscela di DNA, dipodichè si generano dei cluster di PCR. Con gli adattatori si ha

un appaiamento a delle sequenze che sono depositate su un vetrino. Dopodichè si ha la

fase di sintesi. Nelle diverse fasi di sintesi si generano le sequenze e ogni volta che si

inserisce una base all’interno della sequenza noi abbiamo un segnale che viene rilevato

dal sistema.

Il vantaggio di amplificare queste sequenze è

quello di ottenere un’accelerazione della

procedura di sequenziamento. non abbiamo più un

sequenziamento lineare (un singola sequenza

ottenuta tramite separazione per elettroforesi

capillare), ma abbiamo tante reed, ciascun

frammento viene sequenziato molte volte. Questo

metodo è più preciso, più veloce, la purificazione


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41

PESO

5.74 MB

AUTORE

Ile9

PUBBLICATO

+1 anno fa


DETTAGLI
Corso di laurea: Corso di laurea in scienze biologiche
SSD:
Università: Torino - Unito
A.A.: 2016-2017

I contenuti di questa pagina costituiscono rielaborazioni personali del Publisher Ile9 di informazioni apprese con la frequenza delle lezioni di Laboratorio biomolecolare e studio autonomo di eventuali libri di riferimento in preparazione dell'esame finale o della tesi. Non devono intendersi come materiale ufficiale dell'università Torino - Unito o del prof Cutrupi Santina.

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