Istologia prof.re Medico

ESPRESSIONE GENICA

Posso usare il sequenziamento per determinare livelli di espressione genica. È relativamente costoso da

fare e complicato gestire la quantità di dati che otteniamo.

La misurazione di tutti i messaggeri in un tessuto si fa con un’altra tecnica: microarray di DNA. Tecnica

grande

usata da 15 anni quantità di conoscenza accumulata.

68 Recettore TK 61

Si parte dal principio di generare delle copie a partire dagli mRNA espressi in quel tessuto.

Estraggo l’RNA e lo purifico. Faccio una trascrizione inversa: sintetizzo un cDNA

tramite la trascrittasi inversa. Questo enzima è pre-

presente nei retrovirus.

Si usa un oligonucletodide di 25T che lega la polyA

e regola la retrotrascrizone del cDNA.

L’oligonucleotide contiene anche il promotore per

l’RNA polimerasi batterica T7. 

Si sintetizza il 1° e poi il 2° strand ottengo cDNA

a doppia elica che diventa promotore per la T7 po-

limerasi.

Si sintetizza cRNA aggiungendo nucleotidi biotimi-

da 

lati (marcati) 1 cDNA ds ho decine di cRNA biotimidilati ho ottenuto quindi un’amplificazione

dei trascritti.

Ho miscela di RNA marcato; quante molecole ci sono di ogni tipo di RNA?

Uso un microarray sul quale sono depositati degli oligonucleotidi complementari ai messaggeri dei vari

geni. Sfrutto quindi l’ibridazione. Se c’è il cRNA complementare, questo va ad ibridarsi.

Più un trascritto è espresso, più vediamo un segnale fluorescente nella zona di microarray dove ci sono

oligonucleotidi per quel gene.

Ogni pallino è una sonda; alcune daranno un segnale, altre no. Quantifico così l’espressione genica.



10 pallini diversi per ogni gene. 48 mila sequenze (sonde) diverse circa 500 mila spot in un campione.

A volte ho anche più pallini per lo stesso gene.

Per ogni gene avrò quindi l’espressione.

Obiettivi:

1) prevedere se il cancro risponderà ad un certo trattamento in base al profilo di espressione. Scelgo co-

sì il farmaco più efficace.

2) predire l’aggressività del tumore. È utile quando il tumore non è grande e ancora non si è diffuso. Nel

dubbio, dopo l’intervento si fa una chemioterapia di copertura per limitare il rischio di recidiva (terapia

adiuvante). Se il rischio di recidiva è basso, la chemio fa più danni di un’eventuale recidiva. La chemiote-

rapia, a sua volta, è cancerogena.

3) capire quali sono i punti di aggressione (le alterazioni chiave) espressi in un tumore aggressivo e in

uno non aggressivo.

4) capire come funziona la cellula tumorale e quali sono i meccanismi di trasformazione tumorale e pro-

gressione del tumore.

Alcuni sono obiettivi clinici, altri di ricerca si base.

Firma molecolare

Si analizzano tanti campioni e si cercano i punti informativi che possono determinare il comportamento

di un tumore.

Una firma molecolare è quindi un insieme di geni che collettivamente definiscono una specifica caratte-

ristica clinica/biologica di un campione.

Linfoma che aveva un decorso clinico disomogeneo. Una parte dei pazienti guariva, l’altra non rispon-

deva al trattamento e moriva. 62

Analizzando alcuni

casi, si sono iden-

tificati dei geni il

cui livello di

espressione di-

stingueva la pro-

gnosi positiva da

quella negativa.

Alcuni geni sono

molto espressi nei

casi guariti, altri

geni sono più espressi nei pazienti morti.

Il singolo gene fa “errori” (lo stesso gene magari è espresso in entrambi i casi). Se considero però

l’insieme, ho un quadro abbastanza accurato della probabilità di risposta al trattamento.

In base alla conoscenza dei geni, si cerca di capire perché determinati casi saranno positivi e altri no.

Le ghiandole mammarie sono sensibili agli estrogeni.

Se ho un tumore piccolo non responsivo agli endocrini, lo devo trattare dopo l’intervento?

Alcuni tumori continuano a rispondere agli estrogeni, altri no. Quale tipo è il più aggressivo?



Quale dei due è indipendente dagli estrogeni (ossia dal fattore di crescita)? Il 2° il 2° è il più aggressi-

vo. N - = non ci sono cellule tumorali nei linfonodi.

Il grado indica quanto il tumore ricorda ancora le cellule “normali”.

Grado 3 è più aggressivo; grado 1 no (indica buona differenziazione).

possibile

Recettori per il progesterone sono negativi maggiore aggressività

ed è poco probabile l’efficacia di un farmaco antagonista degli estrogeni.

recettore 

HER2 - tirosina chinasico che non c’è non posso usare un an-

ticorpo per bloccarlo.

69

4 TAM : è terapia ormonale.

50% toglierebbero il tumore e basta.

Non trattare farmacologicamente una paziente dopo l’operazione è

psicologicamente negativo.

A chi posso risparmiare la chemioterapia? Quale sarebbe la miglio-

re terapia?

Servono fattori diagnosti e fattori predittivi.

Si è cercato di ottenere firme molecolari di cattiva prognosi per ca-

pire chi poteva evitare la chemio.

Firma molecolare di 70 geni. Ogni riga è una paziente.

Se ho una barra bianca = il caso ha avuto recidiva entro 5 anni dall’intervento.

Sono tutte pazienti non trattate.

Sopra la soglia evito la chemioterapia perché è improbabile che abbiano una recidiva.

69 tamoxifene 63



La firma è diventata un test mamma print.

In Italia il SSN non lo passa; in America le assicurazioni sì. 

La valutazione del grado del tumore viene fatta dal patologo non è una misurazione strumentale.

Grado 1 = buona differenziazione; meno aggressivo.

Zona grigia: grado 2. non

Gli stessi vetrini, dati a patologi diversi, vengono valutati diversamente omogeneità diagnostica.



Prendo tumori di grado 1 e tumori di grado 3 e vedo l’espressione genica definisco la firma molecola-

re del grado. Ci si aspettava che il grado 2 avesse fenotipo intermedio, invece

i casi 2 si sono divisi in 2 sottogruppi: uno di grado 1 e uno di

grado 3. Pochi casi erano in mezzo.

dal punto di vista trascrizionale, sembra che grado 2 non ci sia.

Puntino rosso = c’è stata recidiva. Molti pallini rossi prima dei 5

anni nel grado 3.

Nel grado 1 ci sono pochi pallini rossi prima dei 5 anni.

I casi a dx del grado 2 hanno recidiva; quelli a sx ne hanno di

meno! Si riesce quindi anche a prevedere il rischio metastatico.

Rimanda i vetrini ai patologi, in cieco, e forza la scelta tra grado 1



e 3 risultati sono stati concordi.

La raccolta dei campioni è durata molti anni (15).

Ad un certo punto, i campioni erano abbastanza vecchi da avere informazioni di forward. Si può sapere

già se la paziente ha avuto recidiva.

Prevedere la risposta al trattamento è più complicato. 

In alcuni casi, se il tumore è abbastanza grosso ma non metastatico trattamento chemioterapico pre-

operativo (terapia neo-adiuvante). Scopo: ridurre la massa tumorale consentendo una chirurgia più effi-

cace e più radicale.  operazione 

Biopsia prima del trattamento trattamento per-operativo biopsia per vedere se ri-

sponde al trattamento. Contemporaneamente si fa l’analisi dell’espressione genica. 64

?/5/15

Cancer Genome Atlas

Si stanno costituendo consorzi di ricerca genomica. Questi consorzi riguardano oncologia, analisi delle

predisposizioni genetiche e altre malattie multifattoriali o ereditarie.

Un esempio di questi consorzi è The cancer genome atlas (atlante del genoma del cancro).

2001-2002: completamento di gran parte del Progetto Genoma Umano.

Poi si è voluti andare a vedere le differenze nei genomi tumorali.

Principio: capire il significato biologico delle alterazione genomiche nel cancro.

Capirne anche il significato clinico.

Quali possono essere i cambiamenti genomici in un tessuto tumorale?

- variazione del n° di copie di ogni gene determinano quanto RNA e quanta proteina possono essere

presenti. Amplificazioni o delezioni (riduzione o perdita). Sono variazioni quantitative.

- variazioni nel trascrittoma (profili di espressione). 

- variazioni nella regolazione della traduzione. Tale regolazione è mediata dai miRNA profili di

espressione per RNA non codificanti.



- mutazioni risequenziamento per farne un catalogo.

- analisi dell'epigenoma. Si analizza per es la metilazione del DNA.

Aspetto rivoluzionario è che tali analisi si fanno sullo stesso campione. Le tecnologie hanno consentito di

usare una limitata quantità di materiale per fare queste analisi.

Facendo queste analisi sullo stesso campione, posso poi analizzarle tutte insieme.

L'identificazione di tutte queste alterazioni, può portare alla definizione di sottotipi tumorali. Questo

può trasformare gli approcci diagnostici, terapeutici e di prevenzione.

Il TGCA ha finanziato una vera e propria filiera; è una specie di catena di montaggio formata da diversi

centri che forniscono i campioni biologici. 

Vengono poi isolati acidi nucleici e proteine poi si fa sequenziamento, analisi di espressione, analisi di

copy number variation, analisi epigenetica. 

Questi risultati poi vengono convogliati ad un centro di coordinamento dei dati gestione, archiviazio-

ne ed analisi.

Obiettivo iniziale: avere un n° sufficientemente elevato di campioni per rappresentare tutta la casistica.

1° risultato ottenuto è stato per il glioblastoma.

Tumore dei precursori delle cells della glia. Era un problema clinico molto serio.

Nel 2010, la sopravvivenza media era di 12 mesi e non stava migliorando.

Caratteristiche (hallmarks):

 proliferazione veloce;

 infiltrano il tessuto nervoso che non ha barriere. Ci sono anzi tutti i prolungamenti di assoni e dendriti

a collegare il tutto; non ci sono membrane basali. Le cells della glia devono circondare e sono migra-



torie è un tumore molto infiltrante.

 asportazione problematica;

 propensione a lasciare necrotizzare le regioni interne che vanno in ipossia favorendo ulteriormente la

migrazione.

 angiogenesi;

 

resistente all'apoptosi chemioterapia e radioterapia non sono molto efficaci.

 

instabilità genomica crescente enorme potenziale evolutivo di resistenza ai trattamenti.

 molto eterogeneo: zone diverse del tumore hanno aspetti diversi (morfologici e trascrizionali).

Il glioblastoma può originare da 2 vie.

1) via progressiva: compaiono lesioni non maligne e queste progressivamente acquisiscono ulteriori mu-

tazioni e diventano poi maligne. Si inizia quindi con l'astrocitoma (non maligno) che ha già p53 mutata,

può avere iperespressione di un fattore di crescita o del recettore. La sopravvivenza a lungo termine è di