Istologia: metodologie Microscopiche

Microscopio a luce

polarizzata = mentre

prima a cambiare era delle lamine all’interno del microscopio, qui

cambia invece la luce emessa ovvero luce che vibra in un solo

piano, riuscendo a elaborare un immagine precisa di quel

determinato piano.

Microscopio a fluorescenza = anche qui il cambio avviene nella

lampada utilizzata, poiché si necessita di una lampada a vapori di

mercurio che emette radiazioni ultraviolette che colorano

determinate parti del tessuto.

Microscopio confocale ( CLSM ) = la luce utilizzata è un laser ad

una lunghezza d’onda specifica. Esso proietta l’immagine di un

determinato piano sottile uno alla volta, per poi alla fine ricostruire

col computer la figura tridimensionale dell’esaminato. La

colorazione avviene tramite immunoistochimica e

immunofluorescenza; un processo attraverso il quale si fa legare un

anticorpo alla sostanza da visualizzare contente una sostanza

fluorescente per un sola

lunghezza d’onda. ( metodo

diretto ) senno si può si far legare

un altro anticorpo con la

sostanza fluorescente

all’anticorpo primario. ( metodo

indiretto ). Esistono differenti

marker fluorescenti che donano

un colore diverso in base alla

lunghezza d’onda dalla quale

saranno colpiti.

dei campioni per la microscopia ottica

Nell’allestimento

possiamo optare per cellule e tessuti viventi, utili per la visione del

reale svolgimento delle funzioni ( esempio sangue ) ma con

brevissimo tempo a disposizione ( utilizzo del microscopio ottico a

contrasto di fase, e si utilizzano coloranti vitali ) ; oppure optare per

cellule e tessuti uccisi, ma essi solo dopo aver subito un processo :

- Fissazione ( il mantenimento delle

strutture della cellule e la

prevenzione delle conseguenze La fissazione e l’inclusione

post-morte ) grazie ad alcuni fissanti possono essere sostituiti

( alcoli, aldeidi ( formaldeide direttamente con la

formica )) che fanno precipitare nella congelazione del campione (

maniera più fine le proteine. tramite criostato ) e il

successivo taglio col

- Inclusione ovvero indurire il microtomo.

campione attraverso sostanze

quali paraffina, celloidina.

- Sezionamento, cioè sezionare il tessuto a 2-5 micrometri grazie

all’utilizzo del microtomo.

- Colorazione, colorante che si lega ad alcune strutture cellulari

che rimangono colorate anche dopo ripetuti lavaggi.

La lente o obiettivo del microscopio ha dei numeri

scritti sul suo collo :

Il primo rappresenta il potere risolutivo ( 40x / 10x );

Il secondo

rappresenta l’apertura

Prima dell’inclusione, nel numerica;

campione deve essere tolta Il terzo rappresenta la

l’acqua; grazie ad infusioni prima lunghezza della lente;

con alcool etilico a gradazioni Il quarto rappresenta

crescenti ( fino ad alcol etilico lo spessore del vetrino da

puro ) e poi con xilene o’xilolo a utilizzare.

gradazioni crescenti.

Per utilizzare il campione Microscopia elettronica

sezionato per la colorazione, l’oggetto viene visualizzato per

bisogna svolgere il processo

inverso per reidratare il campione. mezzo degli elettroni.

Troviamo ai giorni d’oggi

moltissimi tipi di microscopi ottici:

Microscopio a Trasmissione = Il fascio di elettroni generato da due

elettromagneti un po’ vengono assorbiti, altri deviati e altri

trasmessi per formare l’immagine ( fluorescente ). Esso trasmette

immagini bidimensionali. Sono immagini di alta definizione.

Microscopio ad alto voltaggio = gli elettroni ricevono una spinta che

li fa accelerare ad una velocità pari a 4/5 di

quella della luce, cosicché la maggior parte

posso o essere trasmessi all’immagine,

anche per elementi ad alto peso atomico.

Microscopio a scansione = l’oggetto viene

contornato con un metallo pesante, e poi

passato a “scansione” all’interno del

microscopio. Esso studia la parte

superficiale del campione.

dei campioni per la microscopia elettronica

Nell’allestimento

possiamo optare solo ed esclusivamente per cellule e tessuti uccisi:

- Fissazione ( il mantenimento delle strutture della cellule e la

prevenzione delle conseguenze post-morte ) grazie ad alcuni

fissanti ( tetrossido di osmio o glutaraldeide ) che fanno

precipitare nella maniera più fine le proteine.

- Disidratazione, dove avviene l’eliminazione dell’acqua attraverso

“infuso” in alcool etilico o acetone.

- Inclusione, ovvero indurire il campione

attraverso sostanze quali paraffina, Il taglio col microtomo o

.

celloidina ultramicrotomo può

- avvenire trasversale,

Sezionamento, sezionare il tessuto a longitudinale o obliqua.

20-40 nm, grazie all’utilizzo del

ultramicrotomo.

- Colorazione o contrasto, colorante

che si lega ad alcune strutture cellulari che rimangono colorate

anche dopo ripetuti lavaggi.