Immunologia, Patologia e Vaccinologia

A RICOMBINAZIONE SOMATICA DEI GENI PER LE IMMUNOGLOBULINE

Le immunoglobuline presentano una variabilità enorme poiché mentre le catene costanti dei vari isotipi

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non sono molte, le catene variabili presenti nel nostro organismo sono 10 -10 quindi non possono

essere codificate da dei normali geni, poiché richiederebbero una quantità di informazione genetica

e o e e te aggio e alla lu ghezza dell i te o genoma. Le catene variabili quindi sono codificate da

dei cluster genici particolari che durante il differenziamento dei linfociti B subiscono un riarrangiamento

so ati o he odifi a la st uttu a di uesti ge i ed espo sa ile della spe ifi ità dell a ticorpo. Il

processo di ricombinazione somatica è un meccanismo peculiare delle cellule B e non avviene in

essu alt a ellula, o p ese uelle della li ea ge i ale: uesta odifi azio e li itata

es lusi a e te ad al u e ellule dell o ga is o e o trasmissibile alla progenie.

4.1.1 ORGANIZZAZIONE DEI GENI PER LE IMMUNOGLUBILNE

I ge i pe l esp essio e delle i u oglo uli e so o o ga izzati i t e loci genici disposti su tre cromosomi

H, espo sa ile dell esp essio e

diversi: uno di questi loci, il locus delle catene pesanti, mentre gli altri

e , esp i o o due di e se a ia ti di ate e legge e, fu zio al e te ide ti he t a di lo o; Il

due, i loci , il lo us lo alizzato sul o oso a e il lo us lo alizzato

locus H è localizzato sul cromosoma

sul cromosoma 22. Ogni locus genico è organizzato secondo uno schema simile: la porzione variabile di

ogni catena è codificata da una serie di tre o due frammenti esonici presenti in molte varianti geniche

all asse laggio di u ge e fu zio ale pe il do i io

differenti, la cui ricombinazione somatica porta

variabile della catena, mentre più a valle sono disposti i geni per i domini costanti.

All i te o del lo us H il do i io a ia ile della ate a pesa te suddi iso i t e tipologie di

 ell o di e

frammenti chiamati V, D e J, più 9 geni C diversi codificanti i domini costanti dei vari

isotipi: i segmenti V sono 123, tra cui però diversi pseudogeni e solo 40 geni funzionanti, quelli D

sono 27, tra cui 4 pseudogeni e 23 geni funzionanti, e quelli J sono 9, tra cui 3 pseudogeni e 6 geni

funzionanti. Il locus è organizzato prima con un cluster contenente i 123 geni V , ognuno

H

preceduto da una sequenza segnale L indispensabile per lo smistamento della proteina tradotta,

H

poi con cluster contenente i 27 geni D , quindi con un cluster contenente i 9 geni J e poi un cluster

H H

i ale o te e te i o di e i ge i C , C , C , C , Cα , C , C , C , Cα , espo sa ili dei

C-te

diversi isotipi anticorpali. Ogni segmento D poi può essere letto con tre diverse letture di frame,

quindi è come se ogni esone D codificasse per tre diverse possibili varianti.

All i te o del lo us il do i io a ia ile della ate a legge a suddi iso i due tipologie di

 f a e ti hia ati ell o di e V e J, più u u i a ate a osta te: i segmenti V sono 132, tra cui

diversi pseudogeni e 29 geni funzionanti, e i segmenti J sono 5. Il locus è organizzato prima con

un cluster contenente i 132 geni V , ognuno preceduto da una sequenza segnale L indispensabile

per lo smistamento della proteina, poi con un cluster contenente i 5 geni J e infine un unico gene

C .

All i te o del lo us il do i io a ia ile suddi iso se p e i due f a e ti V e J, più u a

 catena costante: i segmenti V sono 105, tra cui diversi pseudogeni e soli 30 geni funzionanti, e i

geni J sono 4. Il locus è organizzato prima in un cluster contenente i 105 geni V , ognuno preceduto

29

da una sequenza segnale L indispensabile per lo smistamento della proteina, poi in un cluster

contenente 4 diverse copie del gene C , ognuna preceduta da uno dei geni J .

4.1.1.1 La diversità delle varie immunoglobuline

La presenza di così tanti diversi esoni suddivisi in frammenti è alla base della grande variabilità osservata

nelle immunoglobuline: ogni dominio variabile infatti è suddiviso in due o tre segmenti, ciascuno

rappresentato da diverse varianti esoniche che durante la ricombinazione somatica sono scelte in maniera

asuale. Quello he a ie e du a te la i o i azio e so ati a l appaia e to di u a se ue za D e u a

sequenza J per formare una sequenza DJ, la quale poi viene appaiata ad una sequenza V per formare la

; all i te o dei lo i e i e e a ie e solo l u io e

sequenza VDJ che codifica per il dominio variabile V H

di un segmento V con un J, a formare un VJ che da solo codifica per una catena leggera V . Siccome durante

L

il p o esso di i o i azio e l appaia e to dei seg e ti asuale, possi ile al ola e ua te di e se

varianti di immunoglobuline è possibile ottenere da questo processo:

 40V x 23D x 3 x 6J = 16560 combinazioni di catene V

H H H H

 (29V x 5J ) + (30V x 4J ) = 145 + 120 = 265 combinazioni di possibili catene V L

 16560V x 265V = 4388400 diverse combinazioni di anticorpi

H L

In linea teorica quindi il sistema di ricombinazione somatica, partendo dai vari loci genici per le

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immunoglobuline è in grado di garantire una diversità combinatoriale di circa 10 molecole diverse,

contando però che in realtà alcune associazioni di catene leggere e pesanti non sono stabili e

considerando che in realtà il processo di appaiamento dei vari segmenti non è sempre del tutto causale,

ma alcune coppie sono più favorite di altre. Si tratta comunque di una diversità molto inferiore a quella

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osservata di circa 10 -10 molecole diverse: da dove deriva quindi la rimanente diversità? Questa

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diversità aggiuntiva è spiegabile attraverso il meccanismo di giunzione dei vari segmenti, il quale modifica

le porzioni di giuntura tra i vari segmenti genici aggiungendo o togliendo casualmente dei nucleotidi:

questa diversità prende il nome di diversità giunzionale e contribuisce ad aumentare la diversità totale

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delle Ig da 10 a 10 -10 .

4.1.2 IL PROCESSO DI RICOMBINAZIONE

4.1.2.1 Il riconoscimento dei segmenti V, D e J

Il primo evento di ricombinazione nella catena H avviene tra i segmenti D e i segmenti J, i quali vengono

fusi per creare un segmento DJ. La coppia DJ poi viene ricombinata con un segmento V per formare il

segmento VDJ completo codificante per il dominio variabile della catena pesante. Come fa la cellula a

distinguere un segmento V da un D o da un J considerando che questi sono formati da numerose e brevi

varianti esoniche diverse disperse in una regione molto vasta, superiore a 1Mb. La cellula ovviamente non

può riconoscere ogni singola variante perché avrebbe bisogno di un apparato troppo complesso e perché

dal punto di vista funzionale ogni variante deve essere considerata uguale alle altre, altrimenti la

ricombinazione non sarebbe casuale. La distinzione tra una sequenza V, una D o una J avviene quindi sulla

base di sequenze ripetute fiancheggianti formate da due sequenze conservate di 7 e 9 nucleotidi, separate

da una sequenza non conservata di 12 o 23 nucleotidi: gli eptameri conservati sono sempre affiancati

all eso e, e t e i o a e i so o i olti e so l i te o degli i t o i; t a un eptamero e un nonamero ci

sta o u a se ue za di u leotidi o o se ati o u a se ue za di . L i sie e di u epta e o, u

nonamero e una sequenza spaziatrice tra di essi forma una sequenza fiancheggiante utilizzata

dall appa ato ole ola e della ricombinazione somatica per distinguere i vari frammenti tra di loro e

prende il nome di sequenza RSS (Recombination Signal Sequence). Nel locus H le sequenze spaziatrici di

23 nucleotidi sono presenti attorno ai segmenti V e J, mentre i segmenti D presentano una sequenza

spaziat i e di u leotidi. Nel lo us i e e le se ue ze J p ese ta o u a se ue za spaziat i e di

u leotidi e le se ue ze V di ; el lo us le se ue ze V p ese ta o u o spaziato e di u leotidi e le

sequenze J di 12 nucleotidi. Siccome il processo di ricombinazione richiede necessariamente la presenza

di una RSS con uno spaziatore di 12 nucleotidi e di un'altra RSS con spaziatore di 23 la ricombinazione

all i te o di og i lo us alta e te spe ifi a: el lo us H i fatti la icombinazione potrà avvenire soltanto

tra una sequenza V e una sequenza D (non tra V e V, o tra V e J perché hanno entrambi spaziatori RSS di

23 nucleotidi), oppure tra una sequenza D e una sequenza J (non tra D e D perché hanno entrambi

spaziatori RSS da 12 nucleotidi, non tra J e J perché gli spaziatori RSS sono entrambi da 23 nucleotidi),

a te e do se p e l o di e di i o i azio e VDJ; ei lo i e i e e la i o i azio e può a e i e

solo tra un V e un J (non tra segmenti omologhi perché avrebbero gli stessi spaziatori RSS). Questo sistema

di riconoscimento è molto efficace perché permette di produrre soltanto dei geni funzionali VDJ nella

catena pesante e VJ nella catena leggera, però allo stesso tempo non è in grado di discriminare le singole

varianti esoniche in modo da mantenere casuale il riarrangiamento. 31

32

L’appaia e to delle se ue ze

4.1.2.2 e la diversità giunzionale

Di seguito viene descritta la ricombinazione D e J nella catena pesante (locus H), ma il processo molecolare

è lo stesso anche per la ricombinazione V e DJ e per la ricombinazione nelle catene leggere. La

ricombinazione somatica nei linfociti B è mediata da un grosso complesso multienzimatico presente nel

nucleo, il quale si appaia al DNA in corrispondenza delle RSS. Questo complesso ripiega il DNA fino ad

appaia e due ‘““ i odo he due epta e i e due o a e i sia o appaiati l u o all alt o: a ausa della

particolare conformazione del sito di aggancio del complesso e del particolare ripiegamento assunto dal

DNA l appaia e to può a e i e solo t a u a ‘““ o u o spaziato e di u leotidi e u a ‘““ o u o

spaziatore di 12 nucleotidi, per ragioni steriche. Il complesso si appaia alle sequenze esoniche in maniera

causale, quindi porta vicini tra di loro due segmenti D e J scelti casualmente, ricombinandoli; la regione di

DNA interposta si ripiega a formare un loop.

Dopo aver appaiato le due RSS il complesso taglia il DNA in corrispondenza degli eptameri, quindi li lega

tra di loro in modo da trasformare il loop precedentemente formatosi in un DNA circolare che viene

degradato (con questo processo nei linfociti B maturi si hanno delle perdite di materiale genetico in

corrispondenza delle sequenze interposte tra i segmenti ricombinati). Questi due processi sono mediati

dalle proteine RAG1 e RAG2, le quali riconoscono gli eptameri, vi si legano, li tagliano dalle sequenze

codificanti e li riuniscono tra di loro. Dal punto di vista funzionale le RAG1 e RAG2 sono delle trasposasi:

sono presenti esclusivamente nei vertebrati e derivano evolutivamente da delle trasposasi modificate che

invece di spostare dei trasposoni si sono adattate a mediare la ricombinazione dei segmenti V, D e J. In

ealtà o si ha se p e l eli