Immunologia

Immunologia: immunità innata e adattativa

Fino a vent'anni fa l'infiammazione era considerata separata rispetto all'immunità. La risposta infiammatoria era percepita soprattutto come una forma di danno, più che una forma di protezione, perché in caso di danno esteso può provocare una perdita di funzione. Consente il ritorno all'omeostasi, ma intrinsecamente è considerata negativa. In caso di danni come infezioni, ferite a livello tissutale e squilibri dell'omeostasi, l'infiammazione mette in atto meccanismi di difesa e riparazione, favorendo il ritorno all'omeostasi. Da vent'anni è stata messa a fuoco la componente di difesa che ricopre l'infiammazione: un cambio di prospettiva con la caratterizzazione molecolare dei meccanismi di come il processo viene indotto e regolato. L'infiammazione è diventata una componente immunitaria. La risposta infiammatoria è la risposta immunitaria che un tessuto ha quando percepisce la presenza di un PAMP o DAMP, pattern molecolari che distinguono patogeno da ospite: strutturalmente riconducibili al patogeno, a livello molecolare dettagliato sono distinguibili dall'ospite.

PAMP e DAMP

• PAMP - Sostanze di origine del patogeno che stimolano l'immunità innata:
  • Acidi nucleici: RNA ds, sequenze CpG non metilate
  • Proteine: presentano una N-formilmetionina iniziale
  • Presenza del lipopolisaccaride LPS nei batteri Gram negativi, presenza di acido lipoteicoico (Gram +)
  • Glicoproteine: oligosaccaridi ricchi in mannosio
• DAMP - Molecole endogene che sono prodotte o rilasciate da cellule danneggiate o morenti (no apoptosi):
  • Proteine indotte dallo stress: heat shock proteins
  • Cristalli: urato monosodio
  • Proteine del nucleo: HMGB1 (High Mobility Group Box 1)

Il sistema immunitario innato si è evoluto per riconoscere solo un numero limitato di molecole. Riconoscono strutture comuni a gruppi di microbi correlati, non possono riconoscere differenze sottili. Meccanismi pronti a reagire con rapidità, reagiscono in risposta ai patogeni e alle cellule danneggiate e lo fanno in modo identico alle ripetute esposizioni. Sono necessari dei recettori chiamati Pattern Recognition Receptors (PRR) capaci di riconoscere un pattern (PAMP-DAMP). Questi possono essere di membrana, citosolubili o solubili. Altri non sono ancora conosciuti bene dal punto di vista funzionale. Sono meno di 200, l'immunità innata riconosce solo attraverso questi recettori, non possono riconoscere differenze sottili, riconoscono il mondo esterno all'ospite solo attraverso questi 200 recettori. Riconoscono anche i ligandi endogeni DAMPs (prima damage, ora danger), che sono dei pattern endogeni riconosciuti dal PRR solo se presentati in un contesto di danno.

Il funzionamento dei PRR

In condizioni fisiologiche non avviene il riconoscimento di ligandi endogeni, mentre in caso di danno avviene il riconoscimento e l'attivazione del sistema. I PRR non sono distribuiti in modo clonale. Sono espressi da diverse cellule inclusi i macrofagi, le cellule dendritiche e i neutrofili. Riconoscono diverse strutture molecolari generalmente essenziali per la sopravvivenza del patogeno. I sistemi viventi pluricellulari si basano su questo sistema di riconoscimento e si dotano di un tipo cellulare (fagocita) che ha un qualche sensore che attiva un processo che porta alla fagocitosi e all'attivazione a valle di tutto ciò che avviene a causa della fagocitosi. Questa risposta è protettiva e di difesa dell'ospite.

Identificata nel 1917 da Mecnikov, che osservò che le larve delle stelle marine sono trasparenti, infilò delle spine di rosa nel loro corpo per vedere come gestiscono il danno. Dopo ore arrivarono due tipi di cellule che tentarono di inglobare la spina: microfagi e macrofagi (chiamati così in base alla dimensione delle cellule). I macrofagi appartengono all'immunità innata, ma esiste anche l'immunità adattativa. Il 95% delle specie ha solo la risposta di tipo innato, l'evoluzione secondo il sistema adattativo è molto recente e interessa solo il 5% delle specie animali. La logica per cui alcune specie si dotano di un secondo sistema di risposta è legata a questo.

Immunità innata

L'immunità innata ha un enorme vantaggio rispetto a quella adattativa: ha inizio in tempi rapidissimi (qualche ora). Quando il tessuto viene leso oppure avviene l'entrata di un patogeno, avviene una prima difesa a opera delle barriere fisiche e chimiche come l'epitelio e le sostanze antimicrobiche prodotte dalla superficie epiteliale. Se l'infezione si diffonde in un distretto vascolarizzato, avviene l'attivazione dell'endotelio e inizia l'infiltrazione del tessuto da parte di neutrofili e macrofagi. Se non vi è vascolarizzazione, non può avvenire l'infiammazione.

Il tempo necessario affinché un neutrofilo lasci il circolo ed entri nei tessuti è di circa 1 ora. I neutrofili hanno un'ampia disponibilità, essendo il 60-70% della conta leucocitaria (6000 in un microlitro di sangue). Vi sono svariati miliardi di cellule che circolano, e tutti i neutrofili sono identici fra loro, non vi sono differenze funzionali: tutti hanno le stesse caratteristiche e tutti hanno lo stesso set di sensori PRR, non c'è distribuzione clonale.

Essendo una risposta veloce, non avviene una selezione del reclutamento. Non appena un danno o un patogeno vengono percepiti, si attiva l'endotelio e il primo neutrofilo che passa viene reclutato: risposta veloce, non clonale, risposta di popolazione. La strategia è pensata per ottimizzare i tempi; se tutti i neutrofili fossero diversi, sarebbe stato necessario effettuare una selezione e sarebbe servito molto tempo, portando a morte. Serve invece una prima risposta efficace, ma soprattutto rapida. È necessaria rapidità, per questo viene tollerata una specificità minore. Il tempo di replicazione degli agenti infettivi è molto veloce (circa 20 minuti per i batteri), quindi bisogna agire velocemente anche a scapito della specificità bassa.

I neutrofili hanno un'emivita di 2/3 giorni. Siccome non è clonale, non vi è memoria immunitaria: ogni volta che si viene infettati, la risposta è sempre la stessa, sempre infiammazione, anche se si era già entrati in contatto con lo stesso agente infettivo in passato. Protegge come se fosse la prima esposizione, anche se magari non lo è. La memoria è data dall'immunità adattativa, una risposta immunitaria di secondo livello. Avviene l'ottimizzazione della risposta, che diventa più efficace nei confronti degli agenti infettivi per i quali avviene una ripetuta esposizione.

Immunità adattativa

L'immunità adattativa ha come limite il tempo: nel caso di una prima esposizione a un agente infettivo, sono necessari almeno dieci giorni prima che si sviluppino le cellule dell'immunità adattativa. La risposta adattativa arriva talmente tardi, che se non ci fosse la risposta innata sopraggiungerebbe la morte. È però fondamentale perché ha come grandissimo valore aggiunto la memoria immunologica: serve non per gestire la prima esposizione, ma per rispondere in modo più veloce ed efficace alle seconde esposizioni. L'infiammazione è stereotipata, l'immunità adattativa è lenta ma ottimizzata (trained). Nel caso di una seconda esposizione, vi è memoria e avviene un'eliminazione molto più veloce del patogeno.

Durante la prima esposizione, si vedono pezzi/frammenti del patogeno (antigeni), generati da risposta innata che processa il patogeno. L'antigene appartiene a una struttura non infettiva, ma è presente anche sui patogeni vitali alla seconda esposizione.

Caratteristiche delle risposte immunitarie adattative

• Specificità - Sono specifiche verso porzioni distinte di una singola proteina, di un polisaccaride o di altre macromolecole. Le porzioni degli antigeni che vengono riconosciute dalle cellule dell'immunità adattativa sono detti epitopi o determinanti. I linfociti esprimono dei recettori di membrana che sono in grado di riconoscere differenze anche molto sottili presenti nella struttura di diversi antigeni.
• Diversificazione - Capacità di riconoscere un elevato numero di antigeni. Si calcola che siano in grado di discriminare tra 10⁷ e 10⁹ determinanti antigenici. È il risultato della variabilità dei siti di legame dei recettori con l'antigene. Vi sono molti cloni di linfociti che differiscono nella struttura del loro recettore.
• Memoria - A ogni esposizione antigenica, si generano delle cellule a lunga sopravvivenza specifiche per quel dato antigene. Sono più efficienti dei linfociti naive e permettono una risposta rapida.
• Espansione clonale - Quando i linfociti riconoscono l'antigene per cui sono specifici, vanno incontro a una forte proliferazione, con aumento del numero dei linfociti che esprimono un recettore identico per il medesimo antigene, quindi appartengono allo stesso clone.
• Specializzazione - Risposta differenziata in base al tipo di patogeno.
• Risoluzione e omeostasi - Dovuta all'eliminazione dell'antigene che fa venire meno lo stimolo che ha determinato la risposta immunitaria. I linfociti (esclusi quelli della memoria) una volta che lo stimolo è cessato, vanno incontro ad apoptosi.
• Non reattività verso il self - Capacità di riconoscere antigeni estranei all'organismo, quindi non-self, e rispondere al fine di eliminarli senza reagire con gli antigeni self, tolleranza, non responsività immunologica.

Le cellule del sistema immunitario adattativo sono i linfociti:

• Linfociti B - Producono anticorpi, riconoscono gli antigeni extracellulari solubili e quelli presenti sulla superficie cellulare e si differenziano in cellule secernenti anticorpi, mediatori dell'immunità umorale. Maturano nel midollo osseo.
• Linfociti T - Riconoscono gli antigeni dei microbi intracellulari, agiscono aiutando le cellule fagocitiche a eliminare i patogeni, sia uccidendo loro stessi le cellule infettate. Riconoscono antigeni peptidici associati ad alcune proteine codificate dai geni del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) espresse sulla superficie cellulare.
  • T helper: secrezione citochine, messaggeri
  • T citotossici: uccidono cellule che presentano antigeni non-self
  • T regolatori: inibizione delle risposte immunitarie
• Cellule NK - Killing delle cellule infette

Immunità adattiva umorale e cellulo-mediata

L'immunità adattiva umorale è mediata da molecole presenti nel sangue e nelle secrezioni mucosali, chiamate anticorpi, prodotti dai linfociti B. Questi riconoscono gli antigeni microbici, neutralizzandone l'infettività e identificandoli per la successiva eliminazione da parte di vari meccanismi effettori. È la difesa contro i microbi extracellulari e le loro tossine; gli anticorpi secreti possono legarsi, agevolandone l'eliminazione.

L'immunità adattiva cellulo-mediata riguarda i patogeni intracellulari come i virus e alcuni batteri che sopravvivono e proliferano all'interno dei fagociti e di altri tipi cellulari, diventando così inaccessibili agli anticorpi circolanti. Sono eliminati i serbatoi di infezione attraverso l'eliminazione dei patogeni residenti nei macrofagi e l'uccisione delle cellule infettate.

I recettori dell'immunità adattativa sono codificati da diversi segmenti genici, richiedendo riarrangiamento e distribuzione clonale, permettendo il riconoscimento di strutture molecolari dettagliate. L'antigene, inteso come antibody generator, è un'entità in grado di produrre anticorpi. Gli anticorpi hanno una forma molto simile al recettore per l'antigene dei linfociti B: quando i linfociti B vengono attivati, producono dei recettori solubili (anticorpi). I linfociti T non producono anticorpi, ma riconoscono gli antigeni in contesti diversi.

Il 99% degli antigeni sono di natura peptidica, segmenti di proteina lunghi dagli 8 ai 10 amminoacidi che derivano da una proteina che apparteneva al patogeno. È necessaria la degradazione del patogeno affinché possano essere prodotti gli antigeni. Le proteine, diversamente dai PAMP, sono fatte da amminoacidi, hanno la stessa composizione chimica delle nostre proteine e stessi amminoacidi, ma esiste un'enorme quantità di antigeni. Per il riconoscimento di un peptide che deriva da un agente infettivo, è necessario un enorme numero di recettori, il repertorio: numerosità di target antigenici con i quali devono confrontarsi.

Il repertorio del sistema immunitario adattativo

Il sistema immunitario adattativo è in grado di riconoscere dai 10 a 100 miliardi di peptidi, per ognuno dei quali è presente un recettore (mentre il sistema innato ha solo 200 recettori). Dovremmo avere geni per i recettori, ma i geni in realtà sono intorno ai 30.000. La diversificazione del sistema per un repertorio così ampio avviene avendo a disposizione un numero limitato di geni. Non è possibile che una cellula esprima così tanti recettori. Si formano cloni di ogni singolo linfocito T e B in seguito alla loro attivazione. B cell receptor e T cell receptor sono formati da due catene. La ricombinazione genera copie multiple di un singolo recettore, ogni cellula ha diversa specificità recettoriale (se sono uguali, sono due cloni che derivano dalla stessa cellula attivata).

L'attivazione porta alla generazione di un clone. Un patogeno ha PAMPs che possono essere riconosciuti da qualsiasi neutrofilo e macrofago, ma solo un linfocito B o T è capace di riconoscere uno specifico antigene di quel patogeno, il che richiede molto tempo. L'identificazione del giusto clone avviene presentando l'antigene e ingaggiando uno dopo l'altro i linfociti fino a quando non viene trovato quello che si attiva. Vi sono dei loci appositi nei quali avviene la selezione, come i linfonodi, per evitare che ci voglia troppo tempo. A livello dei linfonodi avviene la filtrazione dei tessuti. Se una mano viene punta da una spina, a livello della mano si genera la risposta innata, mentre a livello dei linfonodi ascellari quella adattativa.

Teoria della selezione clonale

Ogni antigene seleziona un clone linfocitario pre-esistente e ne induce la proliferazione e differenziazione. I cloni antigene-specifici vengono attivati e selezionati dagli antigeni. Al giorno zero vi è solo un linfocita specifico, ma alla fine della risposta si hanno migliaia di copie. Nella fase di attivazione avviene la proliferazione del clone. Infine, si ha un declino della risposta perché le cellule effettrici vanno incontro ad apoptosi, mentre alcune cellule sopravvivono e sono responsabili della memoria immunologica: in circolo non vi è solo un linfocita specifico, ma 10.000.

Se avviene una seconda esposizione all'antigene, il tempo di risposta da parte dell'immunità adattativa sarà più breve. Avviene un'altra espansione del clone ogni volta che si entra in contatto con l'antigene, rendendo la risposta sempre più veloce. Il sistema immunitario si costruisce a immagine dei patogeni che si trovano nell'ambiente esterno e varia a seconda del luogo in cui si vive (patogeni diversi in nazioni e ambienti di vita diversi). La frequenza di linfociti specifici di un individuo è sensibilmente minore rispetto al corrispettivo di specie: ognuno vede solo una parte degli antigeni che potrebbe riconoscere la specie.

Se comparisse ora un patogeno che di solito non si trova in questo ambiente, solo alcuni di noi avrebbero dei recettori specifici, altri invece non lo hanno nel repertorio. All'interno della specie avviene una selezione: selezione positiva per chi riconosce l'agente. Alla comparsa di nuove specie infettive, solo alcuni riconoscono, portando a selezione ed eventuale morte di chi non riconosce. Immunologicamente non siamo tutti uguali, il repertorio è diseguale nella popolazione per assicurarsi che qualche individuo sopravviva.

I vaccini sono basati solo su alcuni antigeni: nel vaccinato viene indotto lo sviluppo di una risposta adattativa. Lo 0,5% dei soggetti non risponde, non avendo recettori adeguati per il riconoscimento. Infezione con agente infettivo per la quale non si sviluppa una risposta adattativa porta a soggetti non-responder, cercando convivenza. Le prime versioni che compaiono sono molto virulente, coprono pochi soggetti e la mortalità è alta. Col passare della convivenza, avviene la selezione di specie meno virulente, con bassa sopravvivenza e morte a causa della continua replicazione dell'agente virale, cercando un punto di equilibrio e instaurando convivenza se non si riesce a eliminare, con un rapporto cronico di tipo infiammatorio.

I recettori dell'immunità innata vengono ereditati con il genoma, selezionati su base di specie: è sicuro che il recettore riconosca bene, altrimenti sarebbe avvenuta la selezione contro. Nei recettori dei linfociti avviene un riarrangiamento clonale dei segmenti genomici, ogni linfocita deve dotarsi di un recettore. Il riarrangiamento dei geni del recettore per l'antigene è l'evento chiave nella maturazione linfocitaria. I geni funzionali per i recettori per gli antigeni sono prodotti nei linfociti T immaturi nel timo, attraverso un processo di riarrangiamento genico che genera una grande quantità di esoni diversi in grado di codificare per la regione variabile.

Il processo di riarrangiamento avviene durante la vita del soggetto (3 mesi di vita intrauterina + 6 mesi extrauterina). Durante la gravidanza, la madre trasferisce gli anticorpi al feto (hanno emivita di 3/4 mesi) attraverso la placenta e con l'allattamento. Per i neonati non è possibile dire se è infettato o meno, nel siero sono presenti anticorpi della madre, non suoi. Nella finestra dei primi 3/4 mesi, non è possibile sapere se è avvenuta infezione o meno.

La specificità di un recettore è il risultato di una selezione che dura qualche anno o mese di vita. I recettori di tipo innato non possono avere reazioni contro antigeni che invece non devono essere target. Nell'immunità adattativa, il 99% dei recettori vedono peptidi self e non del patogeno, impegnati a tollerare self, con il rischio che si sviluppino anticorpi anti-self.